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醛脱氢酶（ALDH）是I相反应中非常重要的氧化酶超家族之一，由一组NAD+依赖性酶组成，主要作用是不可逆的催化内源性和外源性醛，避免醛在人体内蓄积中毒[1]。在哺乳动物组织中均存在ALDH，其中肝脏表达水平最高，其次是肾脏、子宫和大脑，目前在人体内发现了19种不同的ALDH[2]。ALDH2是已知的19种ALDH中分布最广泛和表达最高的同工酶，是一种具有相同亚基的四聚体蛋白（图1），由位于12号染色体长臂（12q 24.2）上的ALDH2基因编码而成的517个氨基酸组成。其亚基均是由3个结构域组成：催化结构域、NAD+结合结构域和寡聚结构域[3]（图1）。
图 1 ALDH2结构示意图
ALDH2是对体内外活性醛代谢的最重要的一种酶，因其对酒精代谢解毒而闻名[4]。ALDH2代谢的活性醛主要有乙醛、丙烯醛、3,4-二羟基苯乙醛（DOPAL）、丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛（4-HNE）等[5, 6]。其中很重要的是4-HNE，它是由人体脂质过氧化反应时活性氧（ROS）攻击双分子层细胞膜上的多不饱和脂肪酸而生成的有毒醛类物质，是目前研究最多的生物活性醛类物质之一[7, 8]。脂质过氧化以及它产生的4-HNE与许多疾病的发生有关，ALDH2能有效清除这些醛，因此是人体内重要的抗氧化应激损伤因子之一，越来越多被关注和研究。
ALDH2基因具有多态性,易发生基因突变，其点突变命名为ALDH2*2，是人类最常见的基因突变之一。全球估计有5.6亿人（约占世界人口的8%）都携带这种基因，尤其在东南亚人群中约有35%～45%为携带者。携带者分布中心位于我国南部地区，特别是我国长汀县约有65%的人口携带这种突变基因[9]。造成这种基因突变的原因是ALDH2基因在12外显子42421碱基上腺嘌呤取代鸟嘌呤，从而在转录翻译成ALDH2时其487位点的谷氨酸被赖氨酸（Glu 487 Lys）取代（图1），从而导致ALDH2结构不稳定以至活性降低。通常，ALDH2野生型和变异型等位基因有3种类型：野生型纯合子（ALDH2*1/*1）、杂合子（ALDH2*1/*2）和变异型纯合子（ALDH2*2/*2）。由于突变对编码ALDH2*1等位基因的野生型单体产生显性影响，所以凡是携带这种突变基因的人ALDH2活性均有所下降，ALDH2*1/*2相比于ALDH2*1/*1活性降低约50%，而ALDH2*2/*2活性几乎完全丧失[10]。
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ALDH2是人体内重要的抗氧化应激损伤因子，突变基因携带者会增加与活性氧介导的氧化应激损伤相关疾病的风险。氧化应激损伤将导致脂质过氧化，这一过程会产生毒性醛，引发细胞稳态受损、酶失活、DNA损伤和细胞死亡，从而导致或加剧疾病的发生。研究不断发现与ALDH2密切相关的氧化应激损伤相关疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病、肝脏疾病、癌症、糖尿病、范可尼贫血、骨质疏松症、疼痛等[3]，下面将重点介绍最常见的几类疾病的相关研究。
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心血管疾病是全球发病率以及死亡率最高的疾病，这其中主要包括心肌梗死、心脏肥厚和心力衰竭。研究发现，这些疾病的发生均与ROS诱导的应激损伤有关，ROS能使生物膜中的多不饱和脂肪酸过氧化，产生活性醛，从而影响人心肌的正常功能[11-13]。研究表明，心肌缺血再灌注损伤（IRI）与急性缺血性脑卒中（AIS）均与氧化应激产生过度4-HNE有关，而ALDH2是醛代谢解毒主要依赖，所以ALDH2介导的活性醛解毒是一种缺血再灌注损伤的内源性保护机制[14]。
近期研究发现，ALDH2还与心律失常相关。心房颤动（AF）是最常见的心律失常，其特征是过快的心房激活，不同步的心房收缩和不规则的心室率[15]。研究发现，ALDH2在 AF相关氧化应激反应中发挥心脏保护作用，同时ALDH2活性降低将导致AF的阈值水平低下，导致AF易感性增加。ROS诱导脂质过氧化产生活性醛，同时活性醛反过来会触发更高的ROS水平，ROS与醛类物质均可能导致心律失常。过量的ROS产生主要离子效应、肌细胞电偶联和异常分子机制的影响而与房颤相关，而活性醛会导致心肌细胞内ATP浓度严重下降，并引起与心律失常发展有关的电生理变化，也能显著抑制大鼠心室肌细胞内向整流钾电流（IK1）从而触发AF[16]。ALDH2与心律失常有着紧密联系，由于ALDH2对ROS与醛类物质均有抑制作用，所以激动ALDH2抗心律失常治疗途径可能有较好前景。
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神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘失去正常活性导致的，往往随年龄增长越来越严重，从而出现功能障碍，这其中最常见的是帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD），它们的特征均是氧化应激诱导的脂质过氧化、线粒体功能障碍和醛产物的积累导致记忆丧失、认知能力下降和神经退行性变[3]。
PD是由黑质多巴胺能神经元缺失引起。大量研究表明，黑质多巴胺能神经元与强活性的DOPAL蓄积有关，动物实验证明DOPAL是一种神经毒素，注射DOPAL可诱发帕金森病[17, 18]。ALDH2是DOPAL代谢的关键酶，能将DOPAL转化为无毒的3,4-二羟基苯乙酸，所以ALDH2被认为对PD具有神经保护作用。
AD是另一种常见的以认知功能障碍为特征的神经退行性疾病。一些研究表明ALDH2与AD的发生有关，Ohsawa等[19]建立了携带ALDH2*2基因小鼠模型，发现由于ALDH2活性下降，小鼠的tau蛋白过度磷酸化而导致的4-HNE积累，使小鼠显示出与人类AD相似的年龄依赖性记忆障碍和神经病理。尸检报告发现，AD患者的颞皮层和壳核中的ALDH2活性明显高于健康对照组，这可能是因为AD患者大脑的ROS诱导氧化应激以至醛的增加，ALDH2活性的升高是为促进醛的代谢[20]。因此，较高的ALDH2活性被认为对AD的存活具有保护作用。
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肝脏疾病，包括非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、肝炎、酒精性肝病（ALD）、药物性肝损伤（DILI）和原发性胆道胆管炎（PBC）等，每年全世界约有200万人死于该类疾病。有研究表明肝脏是ALDH2表达水平最高的器官，也是乙醇代谢的主要部位，而ALDH2是乙醇代谢的主要酶。此外，过量饮酒可增加细胞色素P450 2E1（CYP2E1）的表达和活性，CYP2E1的活化会促进ROS的形成进而导致乙醛的产生[21]。ALDH2活性对肝脏的影响是复杂的， ALD发生是长期大量饮酒导致的，这在很大程度上受到ALDH2变异的影响，ALDH2活性降低导致乙醇代谢过程中乙醛在肝脏蓄积，从而导致ALD。其他NAFLD、肝炎、DILI和PBC也均与ROS诱导的氧化应激有关，在这些肝脏疾病中ROS升高导致肝脏细胞脂质过氧化产生4-HNE。一组体内实验表明，敲除ALDH2基因将加重肝脏疾病，而相应提升ALDH2的表达水平可以延缓疾病进一步发展[22]。
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研究表明，ALDH2与许多癌症发生有关，如肝癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、膀胱癌等。乙醛、4-HNE和MDA等有毒物质，在细胞中的积累会引起醛类诱导的DNA链间交联，从而进一步诱导这些癌症的发生和发展[23, 24]。对于庞大的ALDH2*2携带人群来说，ALDH2低活性更易引起毒性醛的蓄积，患上癌症风险更大。同时研究也证实了ALDH2在大多数肿瘤中相对于正常组织表达水平上存在缺陷，此外，ALDH2的缺失往往提示恶性表型和不良预后，有助于提高癌症患者的准确诊断和及时干预[25]。对于携带ALDH2*2癌症患者，可能不仅ALDH2活性低导致毒性醛蓄积诱导癌症的发展，还可能因患有癌症使得患者ALDH2表达降低，这种双重效应使得患者症状加重。鉴于此，对于与ALDH2相关的癌症，可将ALDH2作为新的靶点，激动ALDH2活性是一个可能的新治疗方法[26]。
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近些年新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎持续大流行，在全球范围内造成严重的公共卫生威胁。现在对其治疗的方式大多还是以疫苗的预防作用为主，提前接种能够在很大程度上避免重症和死亡[27]。近几年的研究发现，ALDH2基因rs671多态性可能与免疫系统存在一些联系。随后在最新研究中发现ALDH2基因突变携带者在接种疫苗前后4个月，其体内SARS-CoV-2 刺突蛋白S1 IgG水平与rs671变异等位基因数量呈负相关。该研究结果首次表明了ALDH2的变异等位基因rs671与COVID-19 mRNA疫苗的免疫原性减弱有关[28]。因此，对突变基因携带者来说，提高ALDH2活性可能可以辅助疫苗作用，加强疫苗在病毒免疫应答流程快速产生抗体，这将对新冠后时代提供一个新的解决方式。
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铁死亡是近年来发现的一种铁依赖的、非凋亡的新型细胞死亡模式，在其发生过程中通常伴有大量铁积累和脂质过氧化，其中最主要特征是累积大量ROS[29]。近期研究发现，在某些疾病发生时ALDH2与铁死亡之间存在着一些联系，在一定程度上，铁死亡的发生将使得细胞中ALDH2的表达减少，提高ALDH2活性能够减少细胞铁死亡。
急性肺损伤（ALI）是败血症的常见并发症，在2022年Cao等[30]采用盲肠结扎穿刺法（CLP）建立脓毒症所致小鼠肺损伤模型，经过CLP处理的小鼠肺组织形态遭到破坏，脂质过氧化损伤，铁含量增加，肺环加氧酶2（PTGS2）蛋白表达增加，同时谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）蛋白表达减少，还下调了ALDH2的表达。而在对照组，加入ALDH2激动剂处理后，发现ALDH2表达增加，肺损伤减轻，ROS水平降低，组织铁含量和PTGS2蛋白表达降低，GPX4蛋白表达升高，这表明了ALDH2的激活能抑制铁死亡。另一组加入铁死亡抑制剂铁抑素Fer-1处理组，ALDH2蛋白表达增加，铁死亡被抑制也促进ALDH2的表达。这些研究表明在急性肺损伤中ALDH2和铁死亡存在很大联系。
最近研究发现，在临床相关心脏骤停（CA）和心肺复苏（CPR）后的肺损伤存活猪模型中，均观察到肺铁死亡，其表现为铁过量和醛产物增加，抗氧化剂减少。然而，当使用ALDH2激动剂处理的CA/CPR组，肺铁含量和醛产物均降低了，同时抗氧化剂增加。ALDH2激动剂能够抑制铁死亡并有效缓解CA/CPR后的肺损伤，其可能是ALDH2激动剂治疗缓解CA/CPR后肺损伤的作用机制[31]。Yu等[32]发现CPR后肾和肠损伤猪模型中，肾脏和肠道细胞发生铁死亡，其肾脏和肠道中铁过量，MDA和4-HNE含量及酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）表达显著增加，GPX4表达显著降低，然而用ALDH2激动剂处理的CPR组，上述变化显著逆转，铁死亡得到有效的抑制。由此可见，ALDH2激动剂处理可通过抑制细胞铁死亡来缓解CPR后肾脏和肠道损伤。
近期Zhu等[33]针对阿尔茨海默病APP/PS1小鼠模型，发现ALDH2能通过抑制ACSL4依赖的铁死亡从而缓解由AD引起的心血管功能障碍，结果还表明ALDH2可通过调节脂质过氧化和铁死亡在AD诱导的心脏异常中起重要保护作用。
综上所述，铁死亡与ALDH2之间的关系密切，但以上联系的具体机制仍有待进一步研究。目前铁死亡相关疾病的研究还有很多，涉及神经系统、心脏、肺部、肾脏、胰腺疾病等[34]。如果能够进一步明确ALDH2与铁死亡在生物作用机制上有直接关系，那提高ALDH2活性对铁死亡相关疾病的患者将是一种新的可能治疗手段。
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ALDH2是人体氧化应激损伤防护的重要环节，提高ALDH2活性具有重要意义，对人数众多的突变基因携带者尤其重要。提高ALDH2活性有利于氧化应激损伤导致的毒性醛的代谢，具有降低心血管疾病、神经退行性疾病、癌症、肝脏疾病等的患病率的潜在作用，同时也可能改善这些疾病预后。最近研究又表明，提高ALDH2活性在某些疾病中能够缓解铁死亡。因此，ALDH2逐渐成为相关疾病治疗的潜在靶点。最近十多年，研究报道了多个类型的小分子激动剂，不过总体来说仍处于研究起步阶段。
2008年Chen等[12]首次通过高通量筛选发现小分子Adla-1, 它能有效的对ALDH2野生型和ALDH2*2突变型产生激活作用。在体外实验中，Alda-1能将失活变体ALDH2*2 激动活性最高提高至10倍，同时也能最大程度的提高野生型ALDH2的活性至2倍。在体内实验中，能使缺血性脑损伤大鼠减少60%的梗死面积。研究证明，Alda-1与ALDH2催化区伸向蛋白表面的入口部位结合（图1），通过变构效应稳定ALDH2的结构从而发挥激动作用[35]。但是Alda-1的水溶性较差，且生物活性也有待提高（图2）。
图 2 已报道的ALDH2小分子激动剂
针对Alda-1存在的问题，为了得到生物活性与水溶性更好的ALDH2激动剂，2018年本课题组Hu等[36]直接对Alda-1进行了结构修饰，以期提高它们的水溶性和生物活性。在合成所得到的三类新化合物中，化合物的水溶性均有所提高，其中两类化合物表现出较好的激动活性，其中化合物I-6活性最好。而后2020年Cheng等[37]鉴于Alda-1构效关系不完善以及活性不佳等问题，也对Alda-1进行了结构改造，设计并合成了系列Alda-1类似物，其中部分目标化合物的活性高于Alda-1，活性最好的化合物为3k。2021年，Lee等[38]研究发现了一种新的ALDH2激动剂AD-9308（结构未公开），它比Alda-1活性更好，且有较好水溶性和高选择性。研究发现AD-9308在治疗由4-HNE介导的糖尿病引起的心肌病时，能有效地激活ALDH2，从而降低糖尿病小鼠的血清4-HNE水平和心脏组织中的4-HNE蛋白加合物，同时改善心肌纤维化、炎症和细胞凋亡。这一研究结果表明了ALDH2激活对4-HNE介导疾病的治疗潜力，也表明了对新的ALDH2激动剂研发的重要性。
2021年，Chen等[39]发现厚朴中一种天然活性分子厚朴酚（Magnolol），能通过激动ALDH2活性从而抑制心脏成纤维细胞的增殖和胶原合成，进而抑制心肌纤维化，且有助于预防心血管疾病，包括心力衰竭。虽然其精确作用机制尚不清楚，不论作用位点是否与Alda-1一致，鉴于其源于天然产物，为ALDH2激动剂的发现提供了一个新方向。
2021年，本课题组通过计算机模拟筛选发现了一类全新骨架的ALDH2激动剂N-苄基苯胺类化合物C6[40]，其在体外ALDH2活性实验中最大激动倍数为Alda-1的104%，在体内能使缺血性脑损伤大鼠模型减少约70%的梗死面积。该化合物的发现首先是通过两轮模拟筛选、基于药效团和结构平行筛选以及基于命中化合物的子结构搜索，发现N-苄基苯胺对ALDH2有激动活性，然后对其进行了结构优化，最终得到了具有良好体内外活性的化合物C6。
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ALDH2不仅与氧化应激损伤相关疾病存在联系，也和铁死亡相关疾病存在间接联系，虽然有些机制尚不明确，但毫无疑问把ALDH2作为治愈或缓解相关疾病的靶点，是很有前景的。原因有两点，第一是在一些体内外实验中已经证明了激动ALDH2活性确实能够缓解相关疾病症状，而如果针对这些疾病以前的药物靶点存在耐药性或药效不好的问题，ALDH2不乏是一个全新的选择；第二是ALDH2基因突变的携带者广泛存在，特别是东亚人，对于这类人更易因为内源性醛的蓄积从而加重一些疾病的症状，激活ALDH2能够辅助相应疾病的治疗。目前，ALDH2小分子激动剂的研究还比较有限，报道的激动剂还存在结构类型少、生物活性不高和成药性有待提高等诸多问题。期望随着研究的深入，未来会有更多、更好的ALDH2小分子激动剂问世。
Progress on the relationship of aldehyde dehydrogenase 2 with human diseases and its small-molecule activators
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摘要: 醛脱氢酶2（ALDH2）是人体内重要的抗氧化应激损伤因子之一，而较高比例的东亚人携带ALDH2失活突变基因。与ALDH2密切相关的疾病有很多，如心血管疾病、神经退行性疾病和肝脏疾病等。近期研究还发现ALDH2与铁死亡也有联系。正因如此，ALDH2逐渐成为上述相关疾病治疗的潜在靶点，研究者报道了其多个类型的小分子激动剂，展现出一定的应用前景。本文重点介绍ALDH2的结构、功能、与人类疾病的关系以及其激动剂的研究进展。Abstract: Aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) is one of important factors against from the damage under oxidative stress in human body. A high proportion of East Asians carry ALDH2 inactive mutation gene. There are many diseases closely related to ALDH2, such as cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases and liver diseases. Recent studies also have found that ALDH2 is associated with ferroptosis. Therefore, ALDH2 has becoming a potential target for the treatment of the above related diseases. Several types of small molecule activators with potential value of clinical application have been reported. The research progress on the structure and function of ALDH2 , the relationship with human diseases and its activators were summarized in this paper.
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Key words:
- aldehyde dehydrogenase 2 /
- oxidative stress injury /
- mutant /
- ferroptosis /
- small-molecule activators
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近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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图 1 ALDH2结构示意图
注：左图中每种颜色代表一个ALDH2四聚体亚基，右图以粉红色亚基为例标注亚基的3个结构域，黄色CPK模式显示为E487K氨基酸残基，紫色显示为ALDH2激动剂Alda-1。
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