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河豚毒素（TTX）是一种海洋生物毒素。TTX首次在河豚中提取得到，而后在多个海洋动植物和陆地部分动物中发现。TTX是一种电压门控钠通道（VGSCs）的阻滞剂，能够选择性地与VGSCs外前庭上的α-亚基结合，阻止钠离子进入通道，从而产生药理活性。TTX具有镇痛、戒毒、抗心律失常等作用，此外，还有降低心血管药物不良反应的作用。目前已经有许多TTX在研制剂，研究者也正在针对TTX的剂型进行研究。本文就TTX的来源、结构性质、作用机制、药理活性、在研剂型进行综述，旨在为下一步TTX的药用开发提供参考。
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1894年，日本学者田原良纯在日本药物学会的月度会议上介绍了从河豚卵巢水提取物中分离出的毒素，这是TTX的首次面世。1909年他提出河豚只含有1种有毒物质，并将其命名为河豚毒素[1]。1950－1957年间，横尾晃、津田藤介等人首先从红鳍东方鲀、紫色东方鲀卵巢中分离得到结晶态的TTX [2-4]。目前河豚毒素的实验室合成已经实现[5]，但尚未实现产业化。
起初，人们认为TTX只存在于河豚科的河豚中，但自不同纲属的两栖动物中发现TTX，打破了以往认为它仅存在于鲀科鱼类中的学说[6]。此后，在多个种类的海洋动植物和陆地动植物中都发现了TTX的存在，如甲藻、红色石灰质藻类、节肢动物、棘皮动物、软体动物、蝾螈和青蛙等。在海洋和淡水环境的沉积物中也发现了TTX[7]，进而产生了生物体内发现的TTX到底是内源性的（由河豚自身产生）还是外源性的（从外部获取并积累）争议。
对于TTX的来源，目前有两种理论：外因说和内因说。日本的清水、松居是最早提出“外因说”的学者。他们用含有TTX的饲料来喂养人工养殖的无毒河鲀，结果河鲀由无毒转变为有毒，由此推论河豚体内的TTX可能是外源性的[8]。2005年，Cheng和Wu 等[9-10]提出TTX是由外界细菌产生的，他们从河豚体内提取出36种细菌，包括弧菌、芽孢杆菌、假单胞菌等。Simidu等[11]通过实验发现溶藻弧菌和互生单胞菌属产TTX较多，但细菌能否产生TTX取决于菌株。Noguchi等[12]的研究表明河豚内的TTX可能来源于其体内的共生细菌，产生TTX的是这些共生细菌而非河豚本身。
内因说认为河豚鱼体内的TTX来源于河豚体内的微生物或是某些生理过程的产物。1998年，Matsumura等[13]以星点东方鲀成熟的卵细胞进行人工授精及胚胎培育，发现胚胎中TTX含量在孵化过程中有所增加，由此认为TTX是河豚胚胎发育的产物。有报道认为河豚体内的TTX可能不是直接来自细菌，也有可能是河鲀鱼与共生细菌共同的产物，并随生长发育逐渐积累[14]。目前大多数研究者认为河豚体内的TTX是由食物链累积和体内微生物产生这两种方式共同形成的。
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河豚毒素（TTX）的分子式为C11H17O8N3，分子量为319.27，为氨基全氢化喹唑啉型化合物，呈独特的笼形结构（见图1），杂环含2个氮母核，含有1个碳环、1个胍基、6个羟基，在C-5和C-10位有1个与半醛糖内酯连接的分开的环[15]。热性质稳定，在碱性溶液中易降解，微溶于水、无水乙醇、乙醚，几乎不溶于其他有机溶剂，易溶于有机酸和无机酸水溶液，log Kow=−6.21（est），25 ℃时的比旋度为−8.64°（在8.55%稀醋酸中），其pKa在水中为8.76，在50%乙醇中为9.4[16]。
图 1 河豚毒素（TTX）的结构
TTX毒性很强，经腹腔注射对小鼠的LD50为8 μg/kg，目前没有特效解毒剂。常温下，提取获得的TTX为无色晶状固体，固体状态很稳定，但其水溶液易水解，温度越高分解速度越快；当助溶剂为pH 4.05醋酸溶液时，放置30 天的常规TTX注射液含量由99.20％下降到93.88%（25 ℃）或65.57%（40 ℃）[17]。
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TTX是一种电压门控钠通道（VGSCs）的阻滞剂，它能够选择性地结合到VGSCs外前庭上的α-亚基，阻止钠离子进入通道，从而产生抑制兴奋的作用[18]。从结构上看，TTX的胍基与钠离子通道内受体蛋白的羰基相互作用，阻滞离子进入通道，继而产生神经、肌肉的麻痹。TTX与钠离子通道是1∶1的结合，即1分子毒素结合1个钠通道，其结合是可逆的，并且与K+、Mg2+、Ca2+等带正电荷的离子竞争受体。根据对河豚毒素的敏感性，VGSCs可分为 TTX 敏感型（TTX-s）和 TTX 耐受型（TTX-r）[19]，分别介导激活电压较低、失活较快的快钠电流和激活电压高、失活较慢的慢钠电流。
研究表明，TTX对钠离子通道的影响可能是其镇痛的机制。在 VGSC家族中有6个 TTX-s 钠离子通道成员（Nav 1.1 ~1.4，1.6，1.7）可以被 TTX阻断，而其他的钠离子通道亚型是 TTX-r 钠离子通道，不能被TTX阻断[20]。TTX可以选择性抑制膜电压，使通道难以打开，从而抑制神经冲动的发生和传导，造成神经肌肉丧失传递兴奋的能力。有基因研究表明，在河豚体内有非芳香族氨基酸（Asn）和Cys残基存在于河豚Nav1.4通道的域I，这与河豚的TTX抗性相关，将这2个残基引入到对TTXs敏感的大鼠Nav1.4通道后，大鼠也具有了抗性[21]。
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镇痛是目前TTX在临床应用上研究最多的方向。作为典型的钠离子通道阻滞剂，TTX可以与吗啡等多种镇痛药联用，以发挥出比单一镇痛药更好的效果。陈学军等[22]进行了TTX和吗啡单独或联用对腹腔注射醋酸小鼠的扭体实验，考察其镇痛效果。结果显示当TTX剂量范围在0.0312~4 μg/kg时能剂量依赖性地抑制醋酸扭体小鼠的疼痛；固定TTX用量在0.125 μg/kg，联合使用剂量范围在1.95~31.2 μg/kg的吗啡，各剂量组与TTX和吗啡单一使用比较，扭体抑制率差异均有统计学意义（P<0.01）。这说明两者联用使得低剂量吗啡镇痛效应增强，降低了其不良反应，比单一使用具有更好的镇痛效果。TTX与因得克（indoxacarb）联用证明了TTX能够抑制甲醛引起的炎症性疼痛和水肿[23]。TTX在临床上使用也效果显著，以它为主药用于癌症晚期患者镇痛的注射剂曾于加拿大进行了24例志愿者实验，通过单盲实验确定TTX与阿片类药物相比具有良好的镇痛作用，且在停止注射后有长效镇痛的作用。这个附加的镇痛作用在第10天左右达到峰值，随后开始减小[24]。后来他们进行了Ⅱ期临床试验，通过对更大样本量的志愿者群体进行更详细的实验，对不同分组给予不同给药方案，结果表明肌内注射TTX的一般耐受性良好，在每日30 mg、分2次给药时，4 天内是安全的[25]。
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将TTX应用于戒毒和药物成瘾性戒断的治疗中，在临床上也有良好的表现。中等成瘾程度的戒毒者每日1次注射10 μgTTX，5~7天为1个疗程就能很好地控制毒瘾，并大大减轻了常规戒毒方法中常出现的戒毒综合征[26]。随后还出现了喷雾剂型的TTX戒毒制剂，改善了毒瘾患者用药时的便携度和及时性[27]。
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相比较于常用的抗心律失常药，TTX能够选择性地阻断Na+通道而不影响其他离子通道，减少了引起不良反应的概率，降低了用药风险。朱成华等[28]通过建立小鼠BaCl2心律失常模型和大鼠乌头碱心律失常模型，将微量TTX与心得安、利多卡因等抗心律失常药合用，TTX可增强抗心律失常药的疗效而不产生毒性影响。现国内已有以TTX为主药制成的抗心律失常药[29]。
对于心血管疾病，由于TTX的毒性反应中存在低血压反应，实验显示5×10−4 μg/g剂量就有明显的降压反应[30]。有研究者对多种动物进行了在体或离体实验，静脉注射一定剂量TTX后发现它对各种动物均有不同程度的降压作用。TTX没有直接扩张血管的作用，但可抑制心脏，其降压作用与抑制心脏有关[31]。
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①预防肾功能衰竭。Bergman等[32]建立了单侧大鼠肾切除模型，对大鼠进行60 min缺血处理后再灌注，肌内注射不同剂量TTX。结果显示，2~4 μg/kg的TTX对急性缺血性肾衰具有保护作用，分组实验则证明肾衰前后注射TTX都具有同样作用，但作用机制尚不明确。②用作皮肤瘙痒症状的止痒剂，能止痒并促进恢复。③治疗前列腺病症。TTX对多种细菌都有抑制作用，能够有效缓解细菌感染引起的前列腺炎症[33]。④对肺癌具有一定治疗作用。将河豚肝脏加水煎煮2~2.5 h，收集上层河豚肝油，将TTX溶于河豚肝油并加入香叶油、白术油和鸦胆子油等辅料制备成药，通过构建免疫缺陷型模型鼠来验证其对肿瘤生长的影响，结果与对照组相比该药物抑制肿瘤细胞生长效果明显，但起作用的具体成分难以判断[34]。
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根据TTX不同药理作用，可将它制备成多种剂型以发挥或提高其有效性，目前已报道的包括口服制剂、喷雾剂、气雾剂、注射剂、可植入式渗透微泵或栓剂等。
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口服制剂是最常见的给药剂型之一，但对TTX而言，液态口服制剂需要达到注射剂数十倍的剂量才能起到相同的效果。研究证实TTX在小肠液中稳定，故可将其制成胶囊剂或片剂，根据情况填充液体或半固体，成药辅料以乳糖、硬脂酸盐、微晶纤维素、交联羧甲纤维素等为优选[35]。口服制剂不仅增加了患者服用便捷性，而且患者无需住院就可安全使用，也更利于药物的储藏和运输[36]。有研究者制备了载河豚毒素的微囊[37]，使用挤出滚圆（Ex-Sp）和流化床处理制得，样品在2～12 h持续释放，累计释放率达80%，在40 μg/kg剂量取得最优镇痛效果。研究者测得河豚毒素注射液6 μg/kg静脉注射的t1/2为0.92 h，载药微囊150 µg/kg灌胃给药，测得cmax为0.88 ng/ml，t1/2约14.5 h，tmax约为5 h。
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呼吸道给药途径包括鼻腔、口腔和舌下黏膜等部位，其吸收率也不低于肌内或静脉注射，现有气雾剂、喷雾剂和粉末吸入剂等形式。通过混合稀释剂、抛射剂、稳定剂、皮肤助渗剂等多种药用辅料使TTX在喷射装置内保持稳定，制成喷雾剂形式的戒毒、镇痛用TTX制剂，使用十分方便[27]。
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国外早以TTX注射剂作为局麻剂和戒毒剂，如TTX与吗啡联用作为手术所需局麻剂。加拿大WEX制药公司研制了TTX注射剂，其申请的专利中虽未公开特定溶剂，但最有可能为极性溶剂，如氢氧化物和醇化物。该TTX注射剂用于缓解化疗和晚期癌症患者的剧烈疼痛，临床试验效果良好，在每日不超过30 μg的剂量条件下表现出非常好的镇痛效果。在30 μg给药剂量时，其cmax为0.58 ng/ml，tmax约为1.5 h，t1/2约为4.5 h[38]，现已进入Ⅲ期临床试验[39]。该公司在国内申请的专利中也列出了其对于TTX可能的剂型制备方法，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、贴剂、乳膏剂等多种剂型，同时TTX与多种药物联合使用有协同治疗作用，如抗癌药顺铂、卡铂、奥沙利铂和长春新碱等[40]。
TTX水溶液对温度敏感，可将其制成冻干制剂，以获得稳定的可注射制剂，但其用于临床的剂量均为微克级。微量的TTX冻干脱水后无法形成所需要的固态残留物，因此需要添加必需的赋形剂，作为TTX附着的支架以形成固态物。已有的解决办法有采用等渗调节剂氯化钠，以甘露醇为成型骨架辅料，以海藻糖作稳定剂并在冷冻干燥前调节pH值至3.5~4.5，可获得质量稳定性好、安全性高的冻干粉针制剂[41]。
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TTX极具开发潜力，尤其在医药领域。它作为典型的钠离子通道阻断剂在很多方面都表现出药用功效，但可能仍有许多作用未被发现。在已知的一些功效中尚未明确其作用机制，作用于人体的给药途径也仍需探索以获得更好的给药形式和治疗效果，需要多个领域的合作研究才能进一步挖掘TTX对人类的有益作用。
Advances in medicinal research on tetrodotoxin
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摘要: 河豚毒素（TTX）是在河豚鱼和其他海洋动物中发现的一种神经毒素。它是一种电压门控钠通道（VGSCs）阻滞剂，能够选择性地与VGSCs外前庭上的α-亚基结合，阻止钠离子进入通道，从而产生药理活性。作为典型的钠离子通道阻滞剂，TTX具有显著的镇痛作用。TTX能够选择性地阻断Na+通道而不影响其他离子通道，减少了常用抗心律失常药物引起不良反应的概率，降低了用药风险。此外，TTX在戒毒等方面亦有显著作用。因此，TTX具有很大的成药潜力。本文对河豚毒素的结构与性质、作用机制、药理活性和在研制剂进行综述，为其成药性评价研究和在药学领域的应用提供概要性支撑。Abstract: Tetrodotoxin (TTX) is a neurotoxin found in puffer fish and other marine organisms. It has been used as an inhibitor of voltage-gated sodium channels (VGSCs), which could selectively bind to the α-subunit on the outer vestibule of VGSCs, preventing sodium ions from entering the channel, resulting in pharmacological activities. As a typical sodium channel blocker, TTX shows a significant analgesic effect. TTX could selectively block Na+ channels without affecting other ion channels, therefore it could reduce the probability of adverse reactions caused by commonly used antiarrhythmic drugs. In addition, TTX has a significant role in detoxification and prevention of renal failure, so TTX has great potential as a medicine. The structure and physicochemical properties, mechanism of action, pharmacological activities and preparations of tetrodotoxin have been reviewed in this paper, so as to provide a general support for the evaluation of its druggability and application in the field of pharmacy.
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Key words:
- tetrodotoxin /
- neurotoxin /
- analgesic effect /
- pharmacological activity /
- preparation
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溃疡性结肠炎（ulceractive colitis, UC）属于炎症性肠病的一种，有着较高的发病率，其特征为损伤性炎症，近年来有关其病因及发病机制的研究受到广泛关注，但至今仍不明确[1]。对于溃疡性结肠炎的治疗目前多采用手术、抗感染、糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗，但上述治疗手段均为对症治疗，且药物长期使用的不良反应很容易造成疾病复发[2]。因此，探究溃疡性结肠炎的发病机制，将为今后治疗药物的研发提供理论基础。
Metrnl（Meteorin-like）是近年来新发现的神经营养因子，也叫Cometin, Subfatin或是IL-39[3-4]。 Jorgensen等[4]在2012年将Metrnl描述为类似于Meteorin（Metrn）的神经营养因子。Metrnl基因开放阅读框包含4个外显子，由936个碱基对编码311个氨基酸。Metrnl蛋白包含45个N端信号肽序列，切除信号肽后的266个氨基酸构成分子量约为30 000的成熟蛋白分子，整个蛋白分子没有穿膜区域，是一种分泌蛋白。到目前为止，关于Metrnl功能的研究较少，我们前期针对该蛋白相关研究确认Metrnl为一种新的细胞因子，阐明了Metrnl通过PPARγ信号通路介导胰岛素的增敏作用的重要机制[5]。 Jorgensen等[4]报道了Metrnl在神经突触生长和成神经细胞迁移中的神经营养活性。Watanabe等[6]报道，Metrnl是潜伏过程（Latent process，LP）基因，可用于细胞分化和神经突触延伸。脂肪组织Metrnl能促进脂肪细胞分化、改善代谢、抑制炎症从而调节脂肪功能，对抗肥胖引起的胰岛素抵抗[7]。通过检测Metrnl在各种组织中的表达，我们发现Metrnl在人和小鼠胃肠组织中，特别是在肠上皮细胞中都高度表达，并发现肠上皮Metrnl敲除后可以通过抑制肠上皮细胞的自噬而加重溃疡性结肠炎，提示 Metrnl是溃疡性结肠炎的治疗靶点[8]。
肠道微环境形成了良好的微生物群栖息地，肠道微生物群被认为是人体的重要器官，越来越多的研究将这种微生物环境与胃肠道疾病联系起来。肠道菌群在溃疡性结肠炎中起着重要作用，如在无菌状态下，无法制备出某些小鼠结肠炎模型（如IL-10缺陷型小鼠等）[9-10]。也有研究报道，在治疗溃疡性结肠炎患者时，联合使用抗生素也显示出了较好疗效[11]。此外，与健康人群相比，溃疡性结肠炎患者的肠道菌群组成也发生了显著变化[12]。但由于人类肠道菌群的复杂性和多样性，目前尚未清楚某些特定菌属与溃疡性结肠炎发病机制的关系。
因此，本研究聚焦溃疡性结肠炎，从肠道微生态角度出发，探究肠上皮Metrnl对于溃疡性结肠炎的作用以及对肠道菌群调节机制的影响。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂和仪器
雄性C57小鼠（8周龄，20只，16~20 g），上海西普尔-必凯实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016）。Villin-cre小鼠[B6.Cg-Tg(Vil1in-cre)1000Gum/J，021504]，2只，16~20 g，美国JAX公司（北京澄天生物科技有限公司代理），生产许可证号：SYXK（京）2018-0016），用于产生肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠（Metrnl(-/-)）。所有小鼠饲养于相对洁净环境下，使用独立通风系统（individual ventilated cages, IVC）动物房，温度恒定（22~26 ℃），室内明暗交替12 h（08:00至20:00照明），相对湿度为40%~70%，笼内维持正压20~25 Pa，每小时换气60~70次。所有实验动物的使用，都经过海军军医大学动物管理机构的同意和认证，符合实验动物饲养及相关管理规定。所有动物实验均按照美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行，并得到海军军医大学动物伦理委员会的批准。IVC系统购自上海鸣励实验室科技发展有限公司。TRIzol试剂（15596026），美国Invitrogen公司；葡聚糖硫酸钠盐（dextran sodium sulfate，DSS），MFCD00081551，分子量36 000~50 000，美国MP公司，引物，生工生物工程有限公司；包埋机（JB- L5，德国徕卡有限公司）；切片机（RM2126，德国徕卡有限公司）；RT-PCR仪器（ABI 7500系统，美国赛默飞公司）；粪便DNA提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，Qiagen, Hilden, 德国）；紫外微量分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Scientific, 美国）；DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA GelExtraction Kit，Axygen Biosciences, 美国）；微型荧光计（QuantiFluor-ST，Promega, 美国）；测序仪（Illumina MiSeq，Illumina, 美国）。
1.2 肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠的制备
首先按照本课题组已报道的方法[5]制备Metrnlloxp/loxp小鼠。根据报道的Metrnl(-/-)小鼠的繁殖策略[13]，即将Metrnlloxp/loxp小鼠与购买的Villin-Cre小鼠进行交配，产下后代小鼠基因型为Metrnlloxp/wtVillin-Cre。将Metrnlloxp/wtVillin-Cre小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠交配，产生下一代Metrnlloxp/loxpVillin-Cre小鼠。继续与Metrnlloxp/loxp交配，产下的后代，经基因型鉴定分别为Metrnlloxp/loxpVillin-Cre（Metrnl(-/-)）和Metrnlloxp/loxp（Metrnl(+/+)）。
1.3 RT-PCR定量肠道组织Metrnl mRNA表达
按照本课题组已报道的方法[3]，使用TRIzol试剂从肠道组织中提取总RNA，并使用ABI 7500系统进行RT-PCR。最终的20 μl反应混合物包括10 μl SYBR Green，2 μl cDNA模板和1 μl引物。通过重复反应确定平均阈值循环（Ct），将靶基因表达标准化为GAPDH，并使用ΔΔCT方法获得定量测量结果。Metrnl上游引物（F）CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT，下游引物（R）GGACAACAAAGTCACTGGTACAG；GAPDH上游引物（F）GTATGACTCCACTCACGGCAAA，下游引物（R）GGTCTCGCTCCTGGAAGATG。
1.4 DSS诱导肠炎模型制备
雄性C57小鼠（8周龄）于实验室适应2周后，按照本课题组已报道的方法进行模型制备[7]，将DSS溶于水中，分别至终浓度为3%和1%，让小鼠自由饮用。
小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分，按照我们之前已报道的的评分标准进行评分[8]，对体重下降程度、大便性状、血便情况共3部分分别进行评分，然后进行加和，计算总分数。具体评分标准如下（表1）。
表 1 小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分表疾病评分 体重下降 (%) 大便性状 大便潜血 0 <1 正常 阴性 1 ≥1-5 - + 2 ≥5-10 软 ++ 3 ≥10-15 - +++ 4 ≥15 腹泻 ++++ 注：“-” 无此性状；“+” 潜血程度。 1.5 结肠长度检测及HE染色
小鼠处死后，取整个结肠部位，测量长度进行比较。然后将结肠下段部位组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片机切至4 μm的切片，按照之前的实验方法[14]，进行HE染色，染色后在光学显微镜下观察炎症细胞浸润情况，组织损伤情况并拍照记录。
1.6 肠道菌群测定
使用16S核糖体RNA基因测序技术检测肠道菌群。为了进行样品收集和DNA提取，从实验小鼠中收集粪便样品，并在取样后3h内将其冷冻在−80°C下。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit进行DNA提取。使用NanoDrop 2000测量细菌DNA的浓度。然后，将16S核糖体RNA基因测序用于检测细菌DNA。基因的V3-V4区域使用FastPfu聚合酶通过条形码索引引物（338F和806R）进行PCR扩增。然后通过AxyPrep DNA GelExtraction Kit，凝胶提取纯化扩增子，并使用QuantiFluor-ST进行定量。将纯化的扩增子以等摩尔浓度合并，并使用Illumina MiSeq仪器进行末端配对测序。
1.7 微生物宏基因组学分析
16S rRNA测序数据由Quantitative Insights Into Microbial Ecology平台（V.1.9.1）处理，并进行了MegaBLAST搜索，将生物分类单位的读数（OTU）与国家生物技术信息中心16S rRNA数据库中的参考序列比对。按照文献报道的方法[15]进行宏基因组学分析，从16S rRNA序列推算肠道微生物组的基因组，并且对每个样品的基因含量进行了预测。
1.8 统计分析
本实验结果数据以（
$\bar x $ ±s）表示，使用SPSS18.0软件进行统计分析。多组以上比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），各组与正常对照组比较采用Dunnett t检验法，两组比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 Metrnl(-/-)小鼠未表现结肠炎症状
我们构建了肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除（Metrnl(-/-)）小鼠，并检测了Metrnl mRNA在大肠和小肠组织中的表达。结果表明，Metrnl(-/-)小鼠中Metrnl mRNA的表达在结肠和小肠组织中极低（图1A）。 HE结肠切片显示Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间均无组织损伤和炎症细胞浸润（图1B）。以上结果表明，肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除后不会诱发溃疡性结肠炎。
2.2 溃疡性结肠炎模型制备条件的选择
在建立DSS诱发的溃疡性结肠炎模型之前，为了选择最佳的观察时间和DSS给药浓度，我们分别选择3％DSS和1％DSS进行造模，并观察了不同DSS浓度下C57小鼠的存活时间。结果显示，在3％DSS组的第6天，出现了小鼠死亡；直至给药10 d，全部小鼠死亡（图2A）。在1％DSS组中，未观察到小鼠死亡。与对照组相比，3％DSS组的小鼠体重在第5天时显著性降低（P<0.05），而1％DSS组的体重并无显著改变（图2B）。同样，与对照组相比，3％DSS组小鼠DAI增加（P<0.05），结肠长度显著性缩短（P<0.05），而1％DSS组在疾病活动指数、结肠长度方面均无明显变化（图2C-D）。 组织形态学方面，3％DSS组表现出结肠炎表型，具有明显的组织损伤，而对照组并无明显变化（图2E）。因此，我们选择3％DSS和5 d的给药时间作为后续实验条件。
2.3 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响
给予Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠3％DSS后，两组小鼠均表现出溃疡性结肠炎症状，其特征为持续的体重减轻、疾病活动指数增加、血性腹泻、结肠长度缩短以及结肠炎症（图3）。在此过程中，在给药后第5天时，与Metrnl(+/+)小鼠体重减轻（−8.27± 1.32）%相比，Metrnl(-/-)小鼠的体重减轻（−14.92±1.05）%，具有统计学差异（P<0.05，图3A）；与Metrnl(+/+)小鼠的疾病活动指数（6.00±1.63）相比，Metrnl(-/-)小鼠显著增加至（9.67±1.38）（P<0.05，图3B）；与Metrnl(+/+)小鼠结肠长度（7.08±0.89 cm）相比，Metrnl(-/-)小鼠结肠更短（5.77±0.58 cm）（P<0.05）（图3D）；为了排除上述差异不是由小鼠摄入不同量的3%DSS引起的，我们还检测了两组小鼠的饮水量。结果显示两组小鼠饮水量之间并无显着差异（图3C）。
图 3 Metrnl敲除后对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响A. 体重；B.疾病评分；C.水摄入量；D.结肠长度；E.结肠组织HE染色P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。2.4 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的菌群平衡的影响
我们通过高通量16S rRNA基因测序，检测了Metrnl对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中肠道菌群的影响。应用Chao1 丰度估计量（chao1 richness estimator），香农多样性指数（shannon diversity index），辛普森多样性指数（simpson diversity index）三种指标评价各组小鼠中菌群的Alpha多样性（图4A-C）。结果显示，在未进行DSS造模之前，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠的Alpha多样性并无显著差异；而进行3%DSS造模后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠出现了差异，其中Metrnl(-/-)小鼠多样性显著下降（图4A-C）。主成分分析显示，在给予3%DSS造模后的Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间微生物的组成显著不同（图4D）。检测小鼠粪便微生物组成，结果显示，在“门”这一层面，给予3%DSS后拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria）在Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间存在显著的不同（图4E）。在Metrnl(-/-)小鼠中，Bacteroidetes和Proteobacteria显著降低，而Firmicutes显著升高。在“纲”这一层面，发现给予DSS后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）具有显著差异。值得注意的是，拟杆菌纲（Bacteroidia）属于拟杆菌门（Bacteroidetes）；梭菌纲（Clostridia）属于厚壁菌门（Firmicutes）（图4F）。为了进一步探究影响给予DSS后造成Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间状态的原因，我们又在“目”层面进行了检测，结果显示（图4G），拟杆菌目（Bacteroidales），属于杆菌纲（Bacteroidia）；梭菌目（Clostridiales），属于梭菌纲（Clostridia）发生了显著改变。
图 4 肠上皮Metrnl 敲除对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群动态平衡的影响A. Chao1丰度估计量；B.香农多样性指数；C.辛普森多样性指数；D.主成分分析；E.门水平上的丰度；F.纲水平上的丰度；G.目水平上的丰度P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。3. 讨论
本研究用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型并从对肠道微生物影响的角度出发，探究肠上皮Metrnl特异性敲除对于肠道菌群调节的影响以及对溃疡性结肠炎的作用。发现Metrnl在溃疡性结肠炎小鼠模型中具有保护的功能，该效应可能是Metrnl通过对肠道菌群的调节所致。 近期有一篇关于Metrnl改善克罗恩氏病（CD）的报道，该研究表明肠系膜脂肪组织与肠道存在交互作用，发现小鼠在给予Metrnl后，可通过激活STAT5/PPARγ信号通路，从而达到促进脂肪细胞分化来减轻肠系膜脂肪组织病变的作用[16]。该研究表明Metrnl确实可以影响炎症性肠病的发生发展。除此以外，我们进一步证实了，肠上皮特异性Metrnl敲除后可以加重DSS诱导的溃疡性结肠炎，并且该作用是通过抑制AMPK-mTOR-p70S6K通路，下调了肠上皮细胞自噬水平产生的[7]。
肠道微环境形成了合适的微生物群栖息地，已证明会影响多种消化系统疾病的发生[17]。肠道菌群稳态的紊乱已被广泛认为与炎症性肠病的发病机制和进展密切相关[8]。肠道菌群主要有三种功能，分别是代谢作用，保护作用和营养作用[18-19]。正常人肠道中在“门”这一层面，主要有四类微生物群，包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形杆菌门（Proteobacteria）[20-21]。
溃疡性结肠炎的主要特征是有益细菌的减少。拟杆菌门（Bacteroidetes）是革兰阴性厌氧细菌，构成了哺乳动物胃肠道中主要微生物群[22]。目前认为，拟杆菌门可以通过免疫调节和维持体内平衡而对宿主发挥有益作用。据报道，拟杆菌门可以通过分泌多糖A（polysaccharide A, PSA）来增强抗炎因子IL-10的mRNA表达[23-24]。本研究结果显示出类似趋势，在给予3%DSS进行溃疡性结肠炎造模后，Metrnl(-/-)小鼠症状更加严重，与Metrnl(+/+)小鼠相比，其拟杆菌门的成分显著下降。然而，拟杆菌门在溃疡性结肠炎中并不完全有益。有报道显示，拟杆菌门可以侵入肠道组织并引起个别患者的肠道损伤[25]。因此针对该类菌属的作用还有待进一步验证。除此以外，由于SCFA具有增强肠壁屏障和免疫系统的作用，从而有助于抵抗病原体，因此产生SCFA的菌群目前认为对人体是有益的，例如Faecalibacterium prausnitzii，Roseburia或Eubacterium[26-28]。放线菌门（Actinobacteria）中的双歧杆菌属（Bifidobacterium）也是有益菌群[29-30]。然而，在该属中发现了有争议的结果，因为有研究报道显示，与对照组相比，溃疡性结肠炎患者的Bifidobacterium增加了[31- 32]，其原因可能是疾病程度的造成的。因此，需要进一步的研究来阐明该有益菌群在溃疡性结肠炎中的作用。
相反的，目前很多研究显示菌群在溃疡性结肠炎中显著增加，如变形杆菌门（Proteobacteria）下的黏附侵入性大肠杆菌属（adherent-invasive Escherichia coli）和巴斯德杆菌属（Pasteurellaceae），厚壁菌门（Firmicutes）下的韦荣氏球菌属（Veillonellaceae）和瘤胃球菌属（Ruminococcus gnavus），梭杆菌属（Fusobacterium）。我们的研究结果也显示出类似趋势，在给予DSS后，与Metrnl(+/+)小鼠相比，Metrnl(-/-)小鼠的厚壁菌的成分显著上升。除此以外，以下菌属也被认为具有潜在致病性，如大肠杆菌属（Escherichia），沙门菌属（Salmonella），耶尔森菌属（Yersinia），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），幽门螺杆菌属（Helicobacter），弧菌属（Vibrio）[31, 33-36]。目前报道较多的是黏附侵入性大肠杆菌，此种细菌能够黏附并穿过肠道黏液屏障，侵入肠道上皮层，促进TNFα分泌和炎症的发生[37-38]。本研究表明，肠上皮特异性Metrnl敲除后，在3%DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中，导致肠道菌群动态平衡的进一步紊乱，表明恢复菌群动态平衡对于治疗溃疡性结肠炎至关重要。
需要注意的是，大量研究表明，目前并没有明确具体的哪一种微生物群对人体是有益的，因为每个人的菌群特征都不同。一般而言，只有相对平衡的微生物群，才能最佳地维持人体的代谢和免疫功能以及预防疾病的发展。在健康的肠道中，病原菌和共生菌群可以共存而不会出现问题。但是，这种平衡的任何紊乱都会导致营养不良，从而改变微生物与宿主之间的相互作用[39]。尽管目前普遍认为溃疡性结肠炎中肠环境平衡的破坏是显著发生的，但是造成肠道平衡紊乱的生物学机制的仍然未知，并且不清楚这种紊乱究竟是造成溃疡性结肠炎的原因还是结果。
本研究仍存在不足。首先，肠道微生态对溃疡性结肠炎的保护作用的详细机制仍未探究清楚，特别是肠道中存在的主要4类微生物群（拟杆菌，厚壁菌，放线菌，变形杆菌）对溃疡性结肠炎的作用还有待证实。其次，肠上皮特异性Metrnl敲除后通过调节肠道菌群的组成，从而加重3%DSS诱导的溃疡性结肠炎的作用证据仍不十分充分，需要今后在进一步的研究中加以阐明。
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