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苯磺酸顺阿曲库铵为临床常用的中长效肌肉松弛药，苏醒期药物在体内的残留导致残余肌松的发生，成为导致麻醉后发生呼吸系统不良事件的主要原因，尤其是老年患者，术后残留会带来更严重的不良后果[1]，因此对老年患者手术后血浆中苯磺酸顺阿曲库铵的残留进行监测有重要意义。苯磺酸顺阿曲库铵易发生霍夫曼降解，温度和pH值的升高会加速降解[2]，因此，临床收集的血浆样本的稳定保存至关重要。本研究在既往文献报道的HPLC法及高效液相色谱-质谱（LC-MS）法[3-6]基础上，开发了一种用灵敏、准确、高效的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵浓度的方法，有效避免了苯磺酸顺阿曲库铵的降解，对老年患者手术后血浆中苯磺酸顺阿曲库铵浓度随时间变化的规律进行研究，探讨自体血回输对患者体内苯磺酸顺阿曲库铵浓度的影响。
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Agilent 1290 UPLC超高效液相色谱（安捷伦，美国）；Agilent 6470三重四极杆质谱，配备AJS-ESI喷射流电喷雾离子源（安捷伦，美国）；SECURA125-1CN型电子天平（赛多利斯，德国）；Arium® mini 超纯水机（赛多利斯，德国）。
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苯磺酸顺阿曲库铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号101170-201902，纯度>98%）；内标维库溴铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号100813-201603，纯度>99%）；甲酸、乙酸铵为色谱纯（麦克林，中国）；乙腈为质谱纯（霍尼韦尔，美国）；水为超纯水。
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色谱柱为SHISEIDO（资生堂）ADME（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），柱温35 ℃；流动相系统以含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液为A相，以乙腈溶液为B相，等度洗脱，A∶B=30∶70（V/V），流速：0.35 ml/min；进样量2 μl，分析时间3 min。
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选择AJS-ESI离子源正离子模式，离子源参数设置：雾化器压力40 psi；干燥气流速11 L/min；干燥气温度350 ℃；鞘气流速11 L/min；鞘气温度350 ℃；毛细管电压4 000 V。
多重反应监测（MRM）参数：苯磺酸顺阿曲库铵464.3→358.2（m/z），碎片电压135 V，碰撞能量20 eV，保留时间为2.05 min；维库溴铵（IS）557.4→356.3（m/z），碎片电压135 V，碰撞能量35 eV，保留时间为1.86 min。
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取苯磺酸顺阿曲库铵对照品约1.5 mg，精密称定，置于2 ml棕色称量瓶中，精密加入含0.1%甲酸的乙腈溶液溶解并涡旋混匀，配成浓度为1.0 mg/ml的储备液；取上述储备液适量，用含0.1%甲酸的乙腈溶液按比例逐级稀释，配成浓度为400~100 000 ng/ml的标准溶液，置于4 ℃冰箱备用。
同法配制浓度为800、40 000、80 000 ng/ml的质控溶液，置于4 ℃冰箱备用。
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取维库溴铵对照品约1.5 mg，精密称定，置于2 ml棕色称量瓶中，精密加入含0.1%甲酸的乙腈溶液溶解并涡旋混匀，配成浓度为1.0 mg/ml的内标储备液；取上述储备液用含0.1%甲酸的乙腈溶液稀释为500 ng/ml的内标标准溶液，置于4 ℃冰箱备用。
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精密吸取空白人血浆与不同浓度的苯磺酸顺阿曲库铵标准溶液，配制为浓度为20、50、100、250、500、1 000、2 500、5 000 ng/ml的苯磺酸顺阿曲库铵模拟标准曲线样品。同法配制浓度为40、2 000、4 000 ng/ml的质控样品。
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取血浆样品50 µl，加入50 µl的维库溴铵内标标准溶液、400 µl的含0.1%甲酸的乙腈溶液，涡旋1 min， 13 000 r/min（5 ℃）离心5 min，取上清液100 µl进样。
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该临床试验经上海市浦东新区公利医院医学伦理委员会审批同意，批件号：（2020）临审第（018）号。选取老年脊柱手术患者给予咪达唑仑0.05 mg/kg，丙泊酚1.5 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg、苯磺酸顺阿曲库铵0.2 mg/kg麻醉诱导；诱导后进行急性等容性血液稀释（ANH），采集总血容量的10% 血液冷藏保存于ACD储血袋中；术中丙泊酚2.5 μg/ml、瑞芬太尼0.1~0.2 μg/(kg·min)、苯磺酸顺阿曲库铵2.0 μg/(kg·min)维持麻醉，于手术主要步骤完成后停止泵注苯磺酸顺阿曲库铵并回输采集的自体血液。收集麻醉诱导结束（T1）、术毕（T2）、术毕0.5 h（T3）、术毕1 h（T4）、回输时刻ACD血袋（LT）的血样各5 ml，于3 000 r/min离心5 min，分离得血浆，精密吸取1 ml血浆置于事先加入100 µl的2%甲酸水溶液的冻存管中，振摇10 s混合后，于−80 ℃冰箱保存。
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取空白人血浆样品、模拟血浆样品（苯磺酸顺阿曲库铵浓度为5 000 ng/ml）以及手术中采集的人血浆样品，分别按“2.1.4”项下进行血浆样品前处理后进样，获得相应的零点样品、模拟样品及人血浆样品的色谱图；空白人血浆样品处理时以含0.1%甲酸的乙腈溶液代替内标溶液，获得双空白样品的色谱图。结果表明该方法选择性良好，见图1。
图 1 人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵及内标维库溴铵典型色谱图
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以血浆中苯磺酸顺阿曲库铵浓度为X，苯磺酸顺阿曲库铵与维库溴铵的峰面积比值为Y，用1/X权重求得回归方程：Y=0.002 6 X+0.010 9，（r=0.999 7），表明在20～5 000 ng/ml范围内线性关系良好。
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通过在定量上限样品（浓度为5 000 ng/ml）之后立即进样分析双空白样品来评估系统残留。结果显示双空白样品中苯磺酸顺阿曲库铵的峰面积不超过该分析批定量下限样品待测物峰面积的20.0%，内标维库溴铵的峰面积不超过该分析批标准曲线内标最小峰面积的5.0%，表明该方法的残留效应不影响测定。
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进样分析低、中、高3个浓度（40、2 000、4 000 ng/ml）的质控样品，每个浓度平行操作6份，连续分析3 d，计算批内、批间的精密度（RSD）及准确度（RE），结果表明批内和批间的RSD<10%，RE<±10%，见表1。
表 1 苯磺酸顺阿曲库铵精密度和准确度考察结果
浓度(ng/ml) 批内（n=6） 批间（n=18） 精密度
（RSD,%）准确度
（RE,%）精密度
（RSD,%）准确度
（RE,%）40 3.10 1.34 7.66 −7.67 2 000 8.27 −5.98 5.23 −7.75 4 000 6.47 4.62 9.34 −5.17 -
配制两种溶液，其中苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的浓度均与低、中、高浓度质控样品处理后的浓度一致：①将6个不同来源的空白人血浆按“2.3.1”项下处理为双空白样品后，加入苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵对照品溶液；②配制两者的对照品溶液。分别记录两种溶液分析后苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的峰面积，以峰面积的比值计算内标归一化的基质效应。
再配制2种溶液：①将低、中、高3个浓度水平的质控样品按“2.1.4”项下处理；②将单一来源的空白人血浆按“2.3.1”项下处理为双空白样品后，加入苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵对照品溶液，使两者浓度均与低、中、高浓度质控样品处理后的浓度一致。分别记录两种溶液分析后苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的的峰面积，以峰面积的比值计算提取回收率。
结果表明，低、中、高浓度的基质效应影响一致，RSD为5.81%，基质效应和提取回收率的考察结果见表2。
表 2 苯磺酸顺阿曲库铵基质效应和提取回收率考察结果
品名 浓度
（ng/ml）内标归一化的
基质效应（%）提取回收率
（%）苯磺酸顺阿曲库铵 40 71.88 83.62 2 000 77.67 83.40 4 000 80.64 88.87 维库溴铵 125.91 -
将新鲜配制的苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的储备液（浓度均为1.0 mg/ml）于4 ℃冰箱中放置28 d，以峰面积的偏差考察其稳定性，结果显示苯磺酸顺阿曲库铵峰面积的偏差为−4.37%，维库溴铵峰面积的偏差为4.75%，表明待测物和内标的储备液稳定性良好。再考察低、中、高3个浓度水平的质控样品（浓度为40、2 000、4 000 ng/ml），室温下放置3 h后处理、处理后在自动进样器（4 ℃）放置24 h、反复冻融3次、−80 ℃冰箱中放置30 d的稳定性，每个浓度平行操作6份，结果见表3。
表 3 血浆样品稳定性考察结果
浓度
(ng/ml)室温（n=6） 进样器（n=6） 冻融（n=18） 长期（n=6） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 40 6.23 7.30 6.75 −1.86 3.89 −2.19 2.23 8.24 2 000 1.38 0.33 2.57 −7.87 4.72 −8.99 3.62 −12.62 4 000 6.75 −2.25 2.40 −6.04 4.38 −10.96 3.48 −10.89 -
研究纳入8名老年患者，受试者1～4诱导后进行ANH，受试者5～8未进行ANH。采用建立的方法测定临床采集的血浆样本的浓度，结果见表4。
表 4 血浆样品中苯磺酸顺阿曲库铵的含量测定结果（ng/ml）
时间点（t/h） 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 受试者7 受试者8 T1 332.0 362.3 556.8 388.9 289.5 328.1 359.9 348.3 T2 228.4 190.9 363.6 205.9 65.71 180.3 170.1 158.5 T3 81.66 99.30 174.4 145.9 41.60 68.56 73.07 61.64 T4 50.11 58.34 125.9 84.42 24.72 35.21 40.14 34.22 LT 270.8 338.0 489.9 316.3 -
既往文献报道的苯磺酸顺阿曲库铵血药浓度的检测方法主要有HPLC法及LC-MS法，但往往需要经过真空离心浓缩或氮吹浓缩等较为复杂的样本前处理方法或经梯度洗脱而分析时间较长[3-6]。本研究在此基础上，开发了UPLC-MS/MS检测方法，优化了前处理方法，采用蛋白沉淀法，操作简便，基质效应和提取回收率满足方法学要求；同时筛选了不同的流动相，最终确定含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液∶乙腈（30∶70，V/V）等度洗脱，使苯磺酸顺阿曲库铵的离子化程度达到最优，方法验证结果显示该方法的精密度和准确度符合生物样本的分析要求。
苯磺酸顺阿曲库铵易发生霍夫曼降解而消除，温度和pH值的升高会加速其降解[2]，如不加入酸调节pH值，即使在−80 ℃的储存条件下，其仍会很快降解。本研究中，经过对不同浓度甲酸溶液的考察，最终确定标准品的配制溶剂与蛋白沉淀剂均使用含0.1%甲酸的乙腈溶液、血浆样品的收集过程中加入含2%甲酸的水溶液，稳定性研究显示储备液可在4 ℃稳定储存28 d（RE=−4.37%），血浆样本可在−80 ℃稳定储存30 d（低浓度RE=8.24%，中浓度RE=−12.62%，高浓度RE=−10.89%），有效避免了苯磺酸顺阿曲库铵的降解。
残余肌松导致患者出现主观不适，导致低氧或高二氧化碳血症、咽部肌肉无力，严重的出现上呼吸道梗阻影响患者生命安全[7]。国内一项多中心的纳入1 571例腹部手术患者的研究提示，术后肌松残余率高达52.8%[8]，而国外一项使用新斯的明拮抗残余肌松的研究显示，拮抗后仍有63.5%的患者在拔除气管导管时存在残余肌松[9]。ANH常规在麻醉诱导后采集稀释血液，所以其中含有一定量的麻醉药物，本研究中亦检测到离体自体血在回输时刻血袋内含有较高浓度的苯磺酸顺阿曲库铵。回输采集自体血后，患者体内苯磺酸顺阿曲库铵浓度较未进行ANH自体血回输的患者浓度下降缓慢，存在残余肌松的风险。尹磊等[10]研究亦显示，针对老年患者在术毕回输ANH采集自体血存在肌松恢复延迟的现象。因此，针对ANH回输自体血的患者，有必要监测苯磺酸顺阿曲库铵的血浆药物浓度，避免围术期不良事件发生。而本研究建立的检测方法有效、稳定，可以用于临床监测苯磺酸顺阿曲库铵的浓度。
Monitoring of residual cisatracurium besylate in elderly patients plasma at post operation by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵的含量，并应用于临床治疗中监测老年患者手术后血浆中的药物残留。 方法 样品经含0.1%甲酸的乙腈溶液蛋白沉淀处理后，采用SHISEIDO（资生堂）ADME（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相以含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈溶液（30 : 70，V/V），等度洗脱。质谱检测选择AJS-ESI离子源正离子模式，多反应监测（MRM）检测离子对为：苯磺酸顺阿曲库铵464.3→358.2（m/z）、维库溴铵（IS）557.4→356.3（m/z）。收集老年脊柱手术患者麻醉诱导后、手术结束、术后0.5 h、术后1 h以及自体血回输时刻血袋内的血浆样品，于事先加入2%甲酸水溶液的冻存管中保存，测定样本中的苯磺酸顺阿曲库铵的含量，评估自体血回输对老年患者术后血浆苯磺酸顺阿曲库铵浓度的影响。 结果 人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵在20~5 000 ng/ml范围内线性良好，r=0.999 7；批内和批间的精密度RSD<10%、准确度RE<±10%；低中高3个浓度的基质效应为71.88%~80.64%、提取回收率为83.62%~88.87%，内标维库溴铵的提取回收率为125.91%，符合方法学要求。老年患者手术后血浆中有一定程度残留的苯磺酸顺阿曲库铵，需严格掌握拔管时间，适当延长患者在麻醉复苏室的停留时间。 结论 该方法灵敏、准确、高效，适用于临床治疗中老年患者手术后血浆中苯磺酸顺阿曲库铵的含量测定。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 苯磺酸顺阿曲库铵 /
- 含量测定 /
- 残余肌松
Abstract:Objective To establish a method for the determination of cisatracurium besylate in human plasma by UPLC-MS/MS which could be used in the monitoring of drug residual in plasma of elderly patients after operation. Methods The samples were precipitated with 0.1% formic acid-acetonitrile solution and separated by an SHISEIDO ADME column(3.0 mm×100 mm, 2.7 μm) for isocratic elution with the mobile phase of water containing 0.1% formic acid with 2 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile (30 : 70, V/V). MS condition was optimized in the positive ion detection mode by multiple reaction monitoring (MRM), along with the Agilent jet stream electrospray source interface (AJS-ESI). The precursors to the product ion transitions were m/z 464.3→358.2 for cisatracurium besylate and m/z 557.4→356.3 for vecuronium bromide (the internal standard, IS). Plasma samples of elderly patients undergoing spinal surgery were collected after anesthesia induction, at the end of surgery, 0.5 h and 1 h after surgery, and from the blood bags while autologous blood transfusion, and stored in cryopreservation tubes with 2% formic acid solution. Then the contents of cisatracurium besylate were determined. The effects of autogenous blood transfusion on plasma concentration of cisatracurium besylate in elderly patients after surgery evaluated. Results The calibration curve was linear in the range of 20-5 000 ng/ml for cisatracurium besylate in human plasma, r=0.999 7. The intra-day and inter-day precision and accuracy were good (RSD<10%, RE<±10%). The matrix effect of different concentrations was 71.88%~80.64%. The recovery of different concentrations was 83.62%~88.87%. The recovery of vecuronium bromide (IS) was 125.91%, which conformed with the requirement of methodological validation. There was a certain degree of residual cisatracurium besylate in the plasma of elderly patients, so the extubation time should be strictly controlled and the stay time of patients in the anesthesia recovery room should be appropriately extended. Conclusion The method is sensitive, accurate, and efficient, which could be used for the determination of cisatracurium besylate in human plasma of elderly patients after operation. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- cisatracurium besylate /
- content determination /
- residual curarization
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流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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表 1 苯磺酸顺阿曲库铵精密度和准确度考察结果
浓度(ng/ml) 批内（n=6） 批间（n=18） 精密度
（RSD,%）准确度
（RE,%）精密度
（RSD,%）准确度
（RE,%）40 3.10 1.34 7.66 −7.67 2 000 8.27 −5.98 5.23 −7.75 4 000 6.47 4.62 9.34 −5.17 
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表 2 苯磺酸顺阿曲库铵基质效应和提取回收率考察结果
品名 浓度
（ng/ml）内标归一化的
基质效应（%）提取回收率
（%）苯磺酸顺阿曲库铵 40 71.88 83.62 2 000 77.67 83.40 4 000 80.64 88.87 维库溴铵 125.91
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表 3 血浆样品稳定性考察结果
浓度
(ng/ml)室温（n=6） 进样器（n=6） 冻融（n=18） 长期（n=6） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 40 6.23 7.30 6.75 −1.86 3.89 −2.19 2.23 8.24 2 000 1.38 0.33 2.57 −7.87 4.72 −8.99 3.62 −12.62 4 000 6.75 −2.25 2.40 −6.04 4.38 −10.96 3.48 −10.89
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表 4 血浆样品中苯磺酸顺阿曲库铵的含量测定结果（ng/ml）
时间点（t/h） 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 受试者7 受试者8 T1 332.0 362.3 556.8 388.9 289.5 328.1 359.9 348.3 T2 228.4 190.9 363.6 205.9 65.71 180.3 170.1 158.5 T3 81.66 99.30 174.4 145.9 41.60 68.56 73.07 61.64 T4 50.11 58.34 125.9 84.42 24.72 35.21 40.14 34.22 LT 270.8 338.0 489.9 316.3
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