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海洋生物毒素是一类由海洋生物产生的天然活性物质，具有化学结构新颖，生物活性高，作用于钠、钾、钙等离子通道等特点，有望开发为先导化合物，为新型海洋药物的研发提供新策略，但其强烈毒性和高致死率也对人类健康产生巨大威胁[1]。目前，药物毒性评价多采用细胞模型和动物模型，由于细胞模型不能重现体内真实环境，动物模型存在伦理和物种差异等问题，近年来，在微流控技术基础上发展起来的器官芯片模型，可以模拟体内组织器官的结构和功能，再现体内微环境，在药物毒性评价与检测领域展现出极大潜力。本文构建了一种可模拟心血管结构与功能的心血管芯片模型，用于四种典型的深海毒素，即大田软海绵酸(OA)、芋螺毒素(CTX)、河豚毒素(TTX)和环亚胺毒素(GYM)的致伤评价，并初步探索了雷公藤甲素对毒素致伤的保护作用，旨在为深海毒素的防护提供参考。
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SC-1B匀胶机、BP-2B型烘胶台（北京创世威纳科技有限公司）；JKG-2A光刻机（上海学泽光学机械有限公司）；PDC-32G-2型等离子清洗机（美国Harrick公司）；CKX41型高倍显微镜（日本OLYMPUS公司）；Harris Uni-Corel 15072型打孔器（美国Harris公司）；超净工作台、CO2细胞培养箱、离心机、超低温冰箱（美国Thermo Fisher公司）；Synergy 4多功能酶标仪（美国Bio-TEK公司）；Harvard蠕动泵p-70（美国Harvard仪器公司）；十万分之一电子分析天平（日本A&D公司）。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚剂和固化剂（美国Dow Corning公司）；硅单面抛光片、显影液（苏州汶颢芯片科技有限公司）；SU-82 075光刻胶（美国Microchem公司）、磷酸盐缓冲盐（PBS）、96培养孔板（美国Corning公司）；无菌注射器（江苏恒康公司）；PE/20软管（美国Scientific Commodities公司）；多聚赖氨酸溶液（北京索莱宝科技有限公司）；DMEM/F-12培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（加拿大MULTICELL公司）；青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；CCK-8检测试剂盒（大连美仑生物有限公司）；山羊血清、Tween-20溶液（碧云天生物科技公司）；荧光素异硫氰酸酯标记的小麦胚芽凝集素(WGA-FITC)、二甲基亚砜（DMSO）、大田软海绵酸、河豚毒素、环亚胺毒素（北京普华仕科技发展有限公司）；芋螺毒素（上海楚肽生物科技有限公司）；雷公藤甲素（上海陶素生物科技有限公司）。所有化学试剂除特殊说明外均为分析纯。
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精密称取OA溶解于DMSO，配置浓度为31 μmol/L的储备液；CTX溶解于超纯水中，配置浓度为200 μmol/L的储备液；TTX溶解于0.1%甲酸溶液，配置浓度为313 μmol/L的储备液；5 μmol/L的GYM标准溶液，氮气吹干后培养基复溶，于−20 ℃保存。用培养基稀释至低、中、高三个浓度的溶液：OA（10、50、100 nmol/L）、CTX（0.5、5、20 μmol/L）、TTX（0.04、0.4、4 μmol/L）、GYM（4、10、40 μmol/L）。雷公藤甲素溶解于DMSO，配置浓度为10 mmol/L的储备液，培养基稀释至实验浓度0.5、1、3、10、20、50 μmol/L。
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人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购买自美国ATCC细胞库，培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F-12培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续实验。
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使用AutoCAD软件设计、软光刻技术制备三通道并列的微流控芯片，如图1所示。将凝血酶（4 U/ml）、PBS和纤维蛋白原（100 mg/ml）按25∶22∶3比例混匀加入芯片胶原通道；血管通道加入PBS稀释的基质胶（1∶50，V/V）后加入对数生长期的HUVEC细胞（3×106 cells/ml）；在外部设备上，使用蠕动泵灌注培养基，人体血流剪切应力为5~20 dyn/cm2，参照剪切应力公式τ=6 μQ/h2w计算流体流速（其中τ为流体剪切应力，μ为流体粘滞度，Q为流体流速，h和w分别为芯片内细胞培养腔的高度和宽度），模拟细胞在体内所受的血流剪切应力，于体外重构心血管微环境[2]。
图 1 心血管芯片模拟图
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取对数生长期的HUVEC细胞，按5 000 cells/孔的细胞密度接种于96孔板，空白组不加细胞。24 h后吸除原培养基，空白组与正常对照组各孔中只加入细胞培养液，实验组中加入含有不同浓度的毒素试液，每孔100 μl，每组6个平行。24 h后观察细胞形态，向各组每孔中加入10%的CCK-8溶液，避光孵育1 h。酶标仪检测450 nm处各样品的吸光度值（OD）计算相对细胞活力。
相对细胞活力（%）=[(OD药物−OD空白)/(OD对照−OD空白)]×100
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于心血管芯片模型血管通道加入20 μl不同浓度的毒素，24 h后用PBS缓慢润洗通道内细胞。将4%多聚甲醛缓慢注入到芯片微通道内，固定20 min，PBS润洗去除通道内残留的多聚甲醛。加入10%山羊血清的PBST（PBS+0.1% Tween-20），封闭30 min。在通道内加入适量的WGA-FITC（WGA-FITC∶PBS=1∶200，V/V
），避光孵育1 h。芯片通道PBS润洗3次，每次5 min，荧光倒置显微镜下观察并采集数据。根据毒素损伤前后WGA-FITC染色荧光强度（MFI）变化情况计算糖萼损伤率。 糖萼损伤率(%)=[1−(MFI损伤/MFI正常)]×l00
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考察不同浓度的雷公藤甲素对HUVEC细胞活性的影响，筛选出雷公藤甲素的最佳预保护浓度用于后续实验。取对数生长期的HUVEC细胞接种于96孔板，向实验组、对照组各孔中分别加入雷公藤甲素预保护1 h。实验组加入不同浓度的毒素溶液，CCK-8法评价雷公藤甲素对毒素损伤后HUVEC细胞的保护作用，实验步骤详见“1.5”项。
采用上述构建的心血管芯片模型，于血管通道内加入雷公藤甲素预保护1 h后，实验组加入不同浓度的毒素，考察雷公藤甲素对毒素损伤血管糖萼组织保护作用，实验步骤详见“1.6”项。
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采用Image J软件计算免疫荧光强度表达，GraphPad Prism 7统计学软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01表示差异有统计学意义。
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以1 μl/min的流速动态培养细胞，HUVEC细胞在所构建的心血管器官芯片模型中生长状态良好，存活率高。经WGA-FITC免疫荧光染色，可清楚观察到结构完整的血管内皮糖萼，符合体外心血管模型的要求，如图2所示。
图 2 糖萼免疫荧光染色图
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采用CCK-8法考察不同浓度的雷公藤甲素对HUVEC细胞活力的影响，结果如图3所示，在测试浓度范围内，雷公藤甲素对HUVEC细胞不存在明显的活力抑制，选择浓度为1 μmol/L的雷公藤甲素进行后续实验。
图 3 雷公藤甲素对HUVEC细胞活力评价结果
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采用CCK-8法测定雷公藤甲素预保护前后，低、中、高三个浓度的毒素对HUVEC细胞活力的影响。与对照组相比，OA在中、高浓度下对细胞活力具有较强的抑制作用（P<0.01），其IC50为54.12 nmol/L。GYM在高浓度对细胞活力有较大影响（P<0.05），但是在加入1 μmol/L雷公藤甲素预保护后，OA与GYM对细胞的毒性显著降低，细胞活力与对照组相比无显著性差异，说明雷公藤甲素对OA和GYM损伤HUVEC细胞具有一定的保护作用。而CTX、TTX在雷公藤甲素预保护前后，对HUVEC细胞活力均无显著抑制作用，结果如图4、5所示。
图 4 四种毒素对HUVEC细胞活力评价结果
图 5 四种毒素在雷公藤甲素预保护后对HUVEC细胞活力评价结果
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在所建立的心血管芯片平台上研究雷公藤甲素对四种毒素产生细胞内皮糖萼损伤的保护作用，免疫荧光染色结果如图6和图7所示。OA作用后，HUVEC细胞出现皱缩、变圆、体积变小等形态变化，且随着实验浓度的增大，所呈现的上述细胞形态变化加剧，培养液中可见大量细胞碎片和悬浮的死细胞，说明OA对HUVEC细胞毒性较强，不仅对细胞糖萼有较严重的损伤，还影响了细胞与芯片PDMS基底的贴附水平，心血管芯片结构和功能受损。CTX、TTX和GYM作用后，HUVEC细胞受到不同程度的损伤，内皮细胞糖萼的WGA-FITC染色荧光强度信号与对照组相比均明显降低，具有统计学意义（P<0.01）。经雷公藤甲素预保护后，低浓度OA所产生的细胞损伤得以减轻，糖萼损伤率为28.20%，但是中浓度和高浓度作用下的细胞依旧损伤严重。除OA外，其余三种毒素作用后的糖萼WGA-FITC染色荧光强度均有明显升高，糖萼损伤率见表1。
图 6 毒素对心血管芯片上糖萼的损伤情况
图 7 雷公藤甲素预保护后毒素对心血管芯片上糖萼的损伤情况
表 1 心血管芯片上的糖萼损伤率
毒素 给药浓度(μmol/L) 糖萼损伤率（%） 预保护前 预保护后 CTX 0.5 36.30 14.90 5 48.04 13.47 20 52.28 26.52 TTX 0.04 29.55 6.52 0.4 40.30 6.69 4 41.97 14.60 GYM 4 23.53 0.22 10 25.89 3.65 40 40.41 6.01 -
海洋生物中的活性物质有很多，对海洋生物毒素研究却是冰山一角。海洋生物毒素根据化学结构的不同常分为三类：聚醚类、多肽类和生物碱类毒素[3]。OA是一种聚醚类化合物，是近年来研究最突出的一种海洋生物毒素，研究发现暴露于OA会导致细胞凋亡以及促进肿瘤和癌症的发生，对人体造成很大危害[4]。多肽类毒素以CTX最具代表性，CTX能特异性地作用于神经递质受体以及多种离子通道，不仅可直接作为药物，还可作为分子工具发展新药先导化合物，对神经生物学的研究具有重要意义[5]。TTX是一种生物碱类毒素，可选择性地与钠离子通道受体结合，研究发现，TTX的麻醉效果强，持续时间长，在镇痛、镇静方面应用前景广泛[6]。随着对海洋生物研究的深入，一些新的毒素也陆续被发现。GYM是一种具有环亚胺结构的毒素，相对于其他三种毒素发现较晚、毒性较弱，但其降解速度缓慢，存在长期毒性效应，在生态系统中的潜在风险不容忽视[7]。尽管海洋生物毒素的研究越来越受到人们的重视，但是现有的评价模型限制了毒素研究工作的进一步开展。
微流控器官芯片模型利用微流控技术对流体进行精确调控，模拟生物体内环境，在体外进行器官生理及病理状态的复制，到目前为止，已经实现肝、肾、肠道等多种器官芯片的构建，在药物筛选、药效和毒性评价方面显示出良好的应用前景[8]。大量研究表明，血液循环流动产生的剪切应力对内皮细胞分化、生长状态和功能表达有着重要作用[9]。本研究基于微流控技术构建心血管芯片模型，将HUVEC细胞接种于三通道的微流控芯片中，通过蠕动泵控制培养基流动速度为1 μl/min，有利于营养物质的输送和废物排出，与静态培养相比，细胞所处的动态环境更接近体内生理条件，心血管芯片模型中的细胞生长状态良好，形态呈铺路石样。
糖萼是存在于内皮细胞表面的多糖-蛋白复合物，参与调节炎症反应、血管通透性、凝血平衡在内的多种生理过程，是血管内皮细胞发挥生物功能的重要结构[10]。本研究采用免疫荧光染色法，通过FITC-WGA与HUVEC细胞中糖萼的葡萄糖胺基团选择性结合，测量其荧光强度以反映细胞糖萼损伤情况。结果显示，在实验浓度范围内，OA对细胞具有较大毒性，对糖萼组织损害严重；40 μmol/L的GYM对细胞活力有较强的抑制作用，糖萼损伤率高达40.41%；而TTX和CTX两种毒素对HUVEC细胞无明显活力抑制，但是其糖萼组织受损严重，可见这两种毒素虽然本身对细胞不存在明显的毒性作用，但是通过其他途径与细胞上的结构组织相互作用，从而影响细胞的功能表达。
雷公藤甲素是卫矛科植物雷公藤的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理作用，但是对心血管的作用尚未完全明确。张诗雨等[11]发现雷公藤甲素可作用于血管内皮细胞核转录因子NF-κB，改善脂多糖(LPS)刺激HUVEC细胞所产生的炎症反应。宗佳琪等[12]在LPS诱导的内毒血症大鼠的心血管功能损伤研究中，同样也发现雷公藤甲素对血管内皮相似的保护作用。本研究初步探索了雷公藤甲素对毒素致伤的保护作用，结果显示，经1 μmol/L雷公藤甲素预保护后，四种毒素作用下的细胞活力与对照组相当，对实验浓度范围内CTX、TTX、GYM以及低浓度OA所产生的糖萼损伤具有一定保护作用。
综上，本文构建了一种心血管芯片模拟心血管结构与功能，包括血管表面的糖萼组织。应用该芯片考察了OA、TTX、CTX和GYM四种深海毒素的毒性效应，发现四种毒素对HUVEC细胞活力以及表面的糖萼组织具有损伤，且呈一定的剂量关系，而雷公藤甲素对上述毒素致伤具有保护作用。
Evaluation of toxin-induced injury and protective effect of triptolide based on a cardiovascular chip model
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摘要:
目的 构建一种心血管芯片模型，评估四种海洋毒素即大田软海绵酸(OA)、芋螺毒素(CTX)、河豚毒素(TTX)和环亚胺毒素(GYM)对血管糖萼组织的损伤，初步探索雷公藤甲素对毒素致伤的保护作用。 方法 将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于三通道结构的微流控芯片，并对所构建的心血管芯片模型进行表征。采用CCK-8法和免疫荧光染色法分析低、中、高三个浓度的海洋毒素对细胞活力和糖萼组织损伤情况，以及雷公藤甲素对毒素致伤的保护作用。 结果 所构建心血管器官芯片中的细胞生长状态良好，具有结构完整的糖萼组织，与对照组相比，OA中、高浓度以及GYM高浓度均对细胞活力具有一定抑制（P<0.05)，CTX和TTX在所测浓度下对细胞没有明显活力抑制，但是四种毒素均引起细胞表面糖萼组织的严重损伤（P<0.01)，且随着浓度增加，糖萼损伤率升高。经雷公藤甲素预保护后，四种毒素对HUVEC的毒性显著降低，糖萼组织损伤率下降。 结论 四种毒素对HUVEC细胞活力以及表面的糖萼组织具有损伤，且呈一定的剂量关系，而雷公藤甲素对毒素损伤后的HUVEC细胞具有保护作用。 Abstract:Objective To construct a cardiovascular chip model for evaluating the damage of vascular glycocalyx induced by four marine toxins: okadaic acid (OA), conotoxin (CTX), tetrodotoxin (TTX) and gymnodimine (GYM), and explore the protective effect of triptolide on toxin-induced injury. Methods Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC) were inoculated into a three-channel microfluidic chip. CCK-8 method and immunofluorescence staining were used to analyze the damage of cell viability and glycocalyx tissue induced by low, middle and high concentrations of marine toxin, as well as the protective effect of triptolide on toxin-induced injury. Results The cells in the cardiovascular chip grew well and had structurally intact glycocalyx. Compared with the control group, the activity of HUVEC cells were inhibited in group of the medium and high concentration of OA and high concentration of GYM (P<0.05). The activity of cells had not been inhibited by CTX and TTX significantly , but all the four toxins caused serious damage to the glycocalyx tissue (P<0.01). After pre-protection with triptolide, the toxicity of the four toxins to HUVEC cells and the damage rate of glycocalyx decreased significantly. Conclusion The four marine biotoxins could damage the activity and glycocalyx of HUVEC cells in a dose-dependent manner, while triptolide has a protective effect on HUVEC cells injured by toxin. -
Key words:
- cardiovascular chip /
- marine biotoxins /
- glycocalyx damage /
- triptolide
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流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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图 7 雷公藤甲素预保护后毒素对心血管芯片上糖萼的损伤情况
A.糖萼免疫荧光染色图; B~D.分别为芋螺毒素、河豚毒素、环亚胺毒素的糖萼量化分析结果，*P<0.05，与对照组比较
表 1 心血管芯片上的糖萼损伤率
毒素 给药浓度(μmol/L) 糖萼损伤率（%） 预保护前 预保护后 CTX 0.5 36.30 14.90 5 48.04 13.47 20 52.28 26.52 TTX 0.04 29.55 6.52 0.4 40.30 6.69 4 41.97 14.60 GYM 4 23.53 0.22 10 25.89 3.65 40 40.41 6.01 
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