下载:
下载:
-
组织蛋白酶K(CTSK) 属于半胱氨酸蛋白酶，是细胞内重要的溶酶体酶，在很多组织中有表达，如肺、脑、皮肤、骨骼和甲状腺等。CTSK在体内主要发挥降解骨胶原蛋白、弹性纤维蛋白、甲状腺球蛋白及细胞外基质的作用，与人类多种疾病密切相关，如肿瘤[1]、骨疾病、心血管疾病和肺纤维化等[2]。CTSK最早发现在破骨细胞特异性高表达，主要发挥降解骨基质中含量达95%的Ⅰ型胶原[2]。基于生物化学和结构分析研究发现CTSK与黏多糖（GAGs)可形成一种复合物，如硫酸软骨素(chondroitin-4-sulfate, C4S或CSA)，且只有这种复合物形成下才能更好发挥降解胶原作用[3]。
二至丸是治疗肾阴虚症的经典名方，由女贞子和墨旱莲组成，经考证出自明代吴曼辑所著的《扶寿精方》，收载于2020版《中国药典》，具补益肝肾，滋阴止血功效[4]。药理研究发现二至丸具有保肝降酶、增强免疫调节、改善血液系统功能、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗衰老、抗氧化、抗变态反应性炎症和植物雌激素样等作用[5]。临床报道，二至丸常用于治疗骨质疏松[6-8]，药理发现二至丸显著降低去卵巢骨质疏松大鼠血清中CTSK水平[5]。我们前期研究发现墨旱莲的正丁醇提取部位和活性成分墨旱莲皂苷IX能显著抑制CTSK的胶原降解活性[9]。因此，二至丸很有可能存在抑制组织蛋白酶K的活性成分，故有可能从中筛选组织蛋白酶K抑制剂。本研究采用荧光偏振法考察CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性，荧光光度法考察CTSK与合成荧光底物benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)结合活性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳法考察CTSK降解生理底物胶原蛋白和明胶的活性，以期从二至丸不同提取部位和活性成分中筛查具有抑制CTSK活性的抑制剂，最终阐明二至丸抑制CTSK酶活性的物质基础。
-
墨旱莲、酒女贞子药材购自上海华宇药业有限公司, 经海军军医大学生药学教研室韩婷教授鉴定墨旱莲为菊科植物鳢肠 Ecliptaprostrata L. 的干燥地上部分，女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。其活性成分异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、蟛蜞菊内酯、熊果酸、齐暾果酸、蒙花苷、槲皮苷、木樨草苷、异去甲基蟛蜞菊内酯、松果菊苷、特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13等24种标准品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。
Z-FR-MCA购自日本WAKO公司；E-64 (L-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane)和硫酸软骨素A (CSA)购自美国Sigma公司；荧光标记硫酸软骨素A(CSA*)购自日本株式会社Cosmo Bio公司；人I型胶原蛋白(Human collagen I)购自美国Affymetrix公司，牛不溶性I型胶原蛋白(Bovine type I insoluble collagen) 购自生工生物工程(上海)公司。
-
墨旱莲500 g，加入10倍量水(W/V)，煎煮2次，每次1 h，合并提取液，煎煮浓缩，冷冻干燥，粉碎得墨旱莲水提取物。酒女贞子按照2020版药典二至丸制备方法，粉碎过80目筛。将酒女贞子粉末500 g与墨旱莲水提取物粉末混匀，用10倍量正丁醇(W/V)回流提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥得正丁醇部位提取物。滤渣挥干，按照正丁醇方法依次分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液对滤渣进行萃取，冷冻干燥得到二至丸的正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物。
研究报道二至丸的活性成分，主要包括墨旱莲三萜皂苷类和女贞子环烯醚萜苷类成分，及一些黄酮类、苯乙醇苷类等成分[10-12]。本研究30个成分中墨旱莲皂苷 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ) 和刺囊酸是由墨旱莲正丁醇部位经凝胶柱层析分离得到[9]，墨旱莲中蟛蜞菊内酯、异去甲基蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷和女贞子中异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、熊果酸、齐暾果酸、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷、松果菊苷、特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、大黄素甲醚、β-谷甾醇、3, 4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇等成分为购买标准品。
-
二至丸不同提取部位和化合物用DMSO溶解分别配置40 mg/ml和10 mmol/L的储备溶液，并在分析之前用100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA) 分别稀释至浓度为25 µg/ml和 25 µmol/ml (DMSO低于１%)，加入黑色荧光96孔板，最终反应容量为0.2 ml。加入终浓度为5 nmol/L的CTSK孵育5 min，加入Z-FR-MCA底物(终浓度1 mmol/L)，孵育30 s，实时检测5 min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长460 nm，吸收光波长355 nm)。所有测量均使用荧光仪Tecan spark（美国）在96孔板中进行，单孔体积为200 µl。实验设阴性对照组(无抑制剂)，阳性对照组(E-64，活性位点抑制剂)。计算公式：抑制率(%)= 100−(1−Vi /V0)。Vi和V0分别表示存在和不存在抑制剂情况下的荧光信号。
-
将100 µg/ml不同部位或25 µmol/ml有效成分与200 nmol/L的CTSK在含有2.5 mmol/L DTT和EDTA的100 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.5）中，混匀放置5 min，然后添加20 nmol/L CSA*，混匀放置15 min，室温下实时检测5 min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长485 nm，吸收光波长520 nm)，所有测量均使用荧光仪Tecan spark（美国）在黑色荧光96孔板中进行，总体积为100 µl。设置不使用抑制剂（阴性对照）和300 mmol/L NaCl（阳性对照）。CTSK和FP之间的关系使用抑制百分比进行分析，计算公式：抑制率(%)=100− [（100×（FPCTSK/抑制剂/CSA*−FP CSA*）/（FPCTSK/CSA*−FP CSA*）]其中，FPCTSK/抑制剂/CSA*和FPCTSK/CSA*分别是在存在和不存在抑制剂的情况下测定荧光信号。
-
人I型胶原0.6 mg/ml溶解于100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)中，依次加入CTSK (最终浓度400 nmol/L)、CSA (最终浓度200 nmol/L) 和400 μg/ml二至丸不同提取部位或不同浓度潜在抑制剂(100、80、60、40、20、10 μmol/L)，加入到含有I型胶原蛋白的缓冲液，单孔体积50 μl，混匀，28 ℃孵育4 h。取出后加入1μl的 100 μmol/L E64终止反应。采用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，考马斯亮蓝染色20 min，用乙酸-甲醇(4∶1)脱色。I型胶原的α1条带的灰度用ImageJ 2软件进行定量分析。
-
称取1 mg不溶性牛I型胶原蛋白置于1.5 ml EP管中，加入1 μmol/L CTSK酶和25 μmol/L潜在抑制剂于40 μl缓冲液中(100 mmol/L醋酸盐缓冲液，pH值5.5，含有2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)。采用Z-FR-MCA底物结合活性方法在T0 min测定CTSK活性，在37 ℃下孵育30 min后，检测T30 min时的CTSK活性。从中取出40 μl上清液，添加2.0 μl NaCl（最终300 mmol/L），然后再次检查CTSK活性，记录为T30salt min。计算公式：结合率(%)=[1−(T0 min−T30salt min)/(T0 min−T30 min)]×100%。
-
用Discovery studio 2016软件中的libdock分子对接方法考察活性成分和组织蛋白酶K(1ATK) 蛋白进行刚性对接。利用LibDock得分作为表征化合物与活性位点结合的核心指标。LibDock得分分数越高，小分子与受体结合的活性越高。
-
每组实验重复3次。采用SPSS软件经ANOVA方差分析检验，若有显著性差异(α=0.05)，再采用Student's t检验进行两组比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
-
本研究考察了DMSO浓度(10%、5%、2%和1%)对CTSK的Z-FR-MCA活性和CTSK/CSA*复合物形成活性高通量筛查方法，及SDS-PAGE胶原降解活性筛选方法的影响。结果发现，10%、5%、2%的DMSO显著抑制CTSK的Z-FR-MCA底物结合(图1A)和CTSK/CSA*复合物形成活性(图1B)。10%的DMSO显著抑制CTSK的胶原降解，1%和2%的DMSO对胶原降解无明显抑制作用。因此，本研究筛查二至丸的抑制CTSK活性方法将DMSO浓度控制在1%以下。
图 1 DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响
-
对二至丸的不同提取部位(正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷) 进行了抑制CTSK活性筛选，其中Z-FR-MCA底物结合实验结果显示，二至丸的石油醚部位抑制作用明显，为96.3%，正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷提取部位抑制率分别为26.1%、50.8%和43.5%（见图2A）。二至丸正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取部位提取物对CTSK/CSA*复合物形成的抑制率分别为99.6%、52.0%、94.8%和59.8%（见图2B），胶原降解活性结果显示二至丸的正丁醇部位抑制作用最明显，达到100%，石油醚提取部位抑制作用为58%，二氯甲烷和乙酸乙酯提取部位作用也不明显，分别为33.1%和6.7%（见图2C和2D）。
图 2 二至丸的不同部位提取物抑制CTSK活性作用
-
本研究对30种二至丸中的活性成分进行了体外筛选，结果发现25 μmol/L的墨旱莲皂苷Ⅸ、异毛蕊花糖苷、蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、女贞苷、特女贞苷、3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇抑制CTSK/CSA*复合物形成的抑制率超过50%，表儿茶素没食子酸酯为51.2%。而在25 μmol/L时，仅有齐墩果酸、3-0-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇对CTSK与Z-FR-MCA结合活性有超过50%的抑制率，熊果酸为47.1%抑制率。采用libdock技术发现仅有3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇与CTSK活性位点对接有得分。因此，这些超过50%抑制率的二至丸活性成分被认为具有潜在抑制胶原降解活性。 针对以上12种活性成分，进行胶原降解抑制实验，结果显示在100 μmol/L时，墨旱莲皂苷Ⅸ，对胶原降解抑制率达70.3%，女贞苷53.2%，蟛蜞菊内酯达50.1%和表儿茶素没食子酸酯为60.2%。异毛蕊花糖苷、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、特女贞苷、熊果酸、齐墩果酸、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇均显示无抑制胶原降解活性(表1)。
表 1 二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选
化合物成分 英文名称 CTSK/CSA*
抑制率(%)ZFR-MCA
抑制率(%)Libdock
得分胶原降解
抑制率(%)来源 墨旱莲皂苷Ⅴ eclalbasaponin Ⅴ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅰ eclalbasaponin Ⅰ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅱ eclalbasaponin Ⅱ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅶ eclalbasaponin Ⅶ 11.3±1.3 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅸ eclalbasaponinⅨ 88.6±9.2 0 / 70.3 M 红景天苷 Salidroside 27.8±3.1 0 / N 异毛蕊花糖苷 Isoacteoside 65.3±4.7 0 / / N 橄榄苦苷 Oleuroprin 35.9±2.4 0 / N 蟛蜞菊内酯 Wedelolactone 58.7±5.8 2.81 / 50.1 M 熊果酸 Ursolic Acid 0 59.7 / N 齐暾果酸 Oleanic acid 0 47.1 / N 刺囊酸 Echinocystic acid 0 0 / M 木樨草素 Luteolin 62.1±8.6 0 / M、N 蒙花苷 linarin 37.2±3.1 0 / M 槲皮素 quercitrin 68.5±5.9 0 / M、N 木樨草苷 galuteolin 33.2±3.7 0 / M、N 异去甲基蟛蜞菊内酯 Isowedelolactone 0 7.0 / M 松果菊苷 Echinacoside 55.9±6.5 9.7 / N 女贞苷 Nuezhenoside 51.2±4.7 0.10 / 53.2 N 特女贞苷 Specneuzhenide 58.6±6.4 17.9 / 49.7 N 女贞苷G13 Nuezhenoside G13 23.7±2.4 0.16 / N 3-O-乙酰基齐墩果酸 3-O-acetyl oleanolic acid 0 66.7 / N 19α-羟基熊果酸 19α-OH Ursolic Acid 0 53.2 / N 儿茶素 catechin 11.3 15.3 / M 表儿茶素 L-Epicatechin 12.7 18.7 / M 表儿茶素没食子酸酯 (-)-Epicatechin gallate 51.2±5.4 10.5 / 60.2 M 大黄素甲醚 Emodin monomethyl ether 19.8±1.7 0 / N β-谷甾醇 β- Sitosterol 0 0 / N 3’ 4-二羟基苯乙醇 3,4-dihydroxyphenethyl 70.3±8.4 83.2 76.4848 N 对羟基苯乙醇 p-hydroxyphenethyl 62.4±6.7 79.5 73.9225 N 注：M：墨旱莲；N：女贞子。 -
不溶性胶原、抑制剂和CTSK共培养15 min，通过检测培养液中剩余CTSK的Z-FR-MCA活性，来验证潜在CTSK抑制剂在体外抑制与CTSK的结合实验，结果显示100 μmol/L的墨旱莲皂苷IX（ES-IX）、表儿茶素没食子酸酯（EGCG）、女贞苷(NZG)和蟛蜞菊内酯(WED)抑制率分别为54.8%、64.1%、36.4%和51.4% (图3)。
图 3 4种潜在活性化合物抑制CTSK和胶原结合作用
-
CTSK抑制剂的高通量筛选方法，多采用合成底物Z-FR-MCA结合活性来筛选，其原理是CTSK可裂解底物端FR-MCA基团, 释放游离的MCA 发色荧光基团, 通过抑制剂引起荧光信号变化差异来检测评价抑制剂活性。基于骨胶原降解需要CTSK与CSA结合发挥作用，采用荧光标记CSA*，形成CTSK/CSA*复合物，其原理为抑制剂与CTSK酶结合形成CTSK/抑制剂/CSA*复合物，导致荧光偏振信号差异，评价抑制剂与CTSK结合活性，可快速、灵敏和准确的判断化合物是否与CTSK存在相互作用。SDS-PAGE凝胶电泳法是常用蛋白质分类技术，将胶原蛋白及其降解产物按照分子量大小迁移，考马斯染色溶液染色，对α1胶原蛋白条带定量，计算胶原蛋白降解率。
二至丸的正丁醇提取部位抑制CTSK/CSA*复合物形成和胶原降解活性最强，超过95%，但对CTSK的Z-FR-MCA抑制率只有26%。Z-FR-MCA作为CTSK活性位点的合成底物，活性成分对Z-FR-MCA抑制率越高，证明对CTSK的活性位点抑制效率越高。基于Bromme教授提出的非活性位点抑制剂的概念[13]，活性成分具有显著的抑制胶原降解活性，但对活性位点Z-FR-MCA底物无抑制活性，可称为非活性位点 (exosite) 抑制剂。结果发现，二至丸的正丁醇提取部位可显著抑制胶原降解，而对Z-FR-MCA无显著影响，证明正丁醇提取部位可能存在抑制 CTSK胶原降解活性的活性成分, 而不影响CTSK 活性位点的生理活性。二至丸的正丁醇提取部位的化学成分主要为墨旱莲皂苷类成分和女贞子三萜酸类成分，其中墨旱莲皂苷Ⅸ（ES-Ⅸ）、表儿茶素没食子酸酯（EGCG）、女贞苷(NZS)和蟛蜞菊内酯(WED)可能是潜在的CTSK非活性位点抑制剂。熊果酸和齐墩果酸具有较强的Z-FR-MCA活性，表明可作用CTSK活性位点，而女贞子乙醇提取物、熊果酸、齐墩果酸和墨旱莲的蟛蜞菊内脂均报道显著抑制破骨细胞的骨吸收活性和CTSK的mRNA表达[14-15]，可能通过在细胞内直接作用CTSK酶，使其失去活性。
CTSK是抗骨质疏松药物研发的关键靶标，有报道，中草药尤其是补肾中药含有丰富的治疗骨质疏松的活性物质，但不清楚这些化合物是否能够抑制CTSK活性，或者特异性抑制胶原酶的活性。除了胶原降解活性，CTSK在甲状腺细胞中发挥降解甲状腺球蛋白，释放甲状腺激素[16]，在成纤维细胞中发挥降解纤维蛋白的功能[17]。二至丸中有抑制CTSK活性的化合物，可进一步考察其对甲状腺球蛋白降解和纤维蛋白降解的作用活性，为中医药开发CTSK抑制剂提供新的思路。
Study on material basis of cathepsin K targeted inhibitor in Erzhi Wan
-
摘要:
目的 考察传统补肾经典名方二至丸中抑制组织蛋白酶K的活性部位和活性成分。 方法 采用高通量荧光方法筛选二至丸中正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚提取部位，以及二至丸主要活性成分对组织蛋白酶K(CTSK)与荧光合成底物Z-FR-MCA结合活性的抑制率，和对CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性抑制率。进而考察二至丸不同提取部位和活性成分抑制CTSK生理底物I型胶原蛋白降解活性，并采用分子对接和底物结合实验验证潜在CTSK抑制剂。 结果 二至丸的正丁醇和石油醚提取部位对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过90%，石油醚提取部位对CTSK与底物Z-FR-MCA结合抑制率超过90%，正丁醇提取部位对CTSK的胶原降解抑制率超过95%、石油醚提取部位为58.6%。30个有效成分中11个显示对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过50%，有5个成分对CTSK与荧光底物Z-FR-MCA结合活性抑制率超过50%。最终筛选确定4个成分墨旱莲皂苷Ⅸ、表儿茶素没食子酸酯、女贞苷和蟛蜞菊内酯，对胶原降解抑制率超过50%，其中墨旱莲皂苷Ⅸ抑制胶原纤维与CTSK的结合率最高达60%，但均与CTSK活性位点分子对接不成功。 结论 二至丸中存在抑制组织蛋白酶K的活性物质，主要存在于正丁醇部位，但活性成分不是活性位点抑制剂，可能通过与其他位点结合，间接抑制CTSK与寡多糖结合，进而降低了CTSK的胶原降解活性。 Abstract:Objective To investigate the active ingredients and components that inhibiting cathepsin K activity in Erzhi Wan, a classic kidney-tonifying formula. Methods Then-butanol, dichloromethane, ethyl acetate and petroleum ether parts and 30 active components in Erzhi Wan were screened by established high throughput fluorescence methods of inhibit the binding activity of CTSK with Z-FR-MCA substrate, the formation of CTSK and chondroitin sulfate A (CSA) complex activity, and the activity of substrate type I collagen degradation by CTSK. Molecular docking and insoluble collagen substrate binding assays were applied to verify the potential CTSK inhibitors. Results The n-butanol and petroleum ether parts of Erzhi Wan inhibited the formation of CTSK and CSA* complex by more than 90%, the petroleum ether part inhibited the binding of CTSK to substrate Z-FR-MCA by more than 90%, the collagen degradation inhibition rate of CTSK in n-butanol part was more than 95% and that in petroleum ether part was 58.6%. Among the 30 active components, 11 showed that the inhibition rate of CTSK and CSA* complex formation was more than 50%, and 5 components with the inhibition rate of Z-FR-MCA binding activity more than 50%. Finally, there were four components including eclalbasaponin Ⅸ, (-)-epicatechin gallate, nuezhenoside and wedelolactone. The inhibition rate of collagen degradation was more than 50%. Eclipta saponin IX inhibited the binding rate between collagen fibers and CTSK, up to 60%, but all of them failed to dock with CTSK active site. Conclusion There are active components that inhibiting cathepsin K in Erzhi Wan, which mainly exists in the n-butanol ingredients, but the active components is not an active-site inhibitor. It might inhibit the binding of CTSK with oligosaccharides by binding to other sites of CTSK, and then reduce the collagen degradation activity of CTSK. -
Key words:
- Erzhi Wan /
- osteoporosis /
- cathepsin K /
- active fraction /
- potential inhibitor
-
人口老龄化、慢性病发病率增加、高价新药持续推出等因素使得全球医疗卫生支出迅速增长。为了控制药品费用，降低医疗费用开支，各国政府纷纷出台鼓励仿制药品研发和使用的政策[1]。研究显示，2003年—2012年，仿制药的替代为美国节省了超过1.5万亿美元的费用[2]。2018年，我国三级医院的患者门诊年人均费用为322.1元，其中药品费用占42.2%[3]，通常发达国家药品费用占20%[4]。而我国，广大公众的医疗消费水平还不高，质优价廉的仿制药仍是满足我国公众基本用药的重要来源和手段。近年来，国务院从国家战略层面提出开展仿制药质量一致性评价，以提高仿制药质量和用药可及性。尤其是在2018年11月，为了降低医疗开支，控制药品费用，国家组织了在北京、天津、上海、重庆4个直辖市和沈阳、大连、厦门、广州、深圳、成都、西安7个城市(简称“4+7”城市)试点药品集中带量采购。各试点城市委派代表组成联合采购办公室，代表公立医疗机构实施集中采购，兼顾药品采购数量和中标价格，通过以“量”换“价”的方式，促进仿制药替代原研药使用，达到合理降低药品费用的目的[5]。2019年2月29日，上海市发布了《关于本市执行“4+7”城市药品集中采购中选结果的通知》，正式公布了“4+7”中选品种及执行时间，要求上海市所有医保定点医疗机构于3月20日正式统一执行。
本研究通过评估该政策实施对上海市某公立三级综合医院门诊治疗心血管疾病的仿制药与原研药的利用情况的影响，分析仿制药替代策略带来的经济效益，为完善相关药物政策提供实证依据。
1. 资料与方法
1.1 目标疾病与目标药物
本研究根据《中国高血压防治指南2018年修订版》[6]中常用降压药及《冠心病合理用药指南第2版》[7]中常用治疗冠心病药对照该院药品使用目录，选择使用比例高，既有仿制药又有对应原研药的口服固体制剂品种。由于缓、控释剂型与普通制剂成本不同，所以本研究均选取相同剂型药物。另外，为了进行对比，单独选取了中选带量采购品种的原研药福辛普利作为对照（该药品没有对应仿制药品种），分析其在带量采购政策实施前后的药物利用状况的变化，并与其他仿制药进行比较。
共选取高血压和冠心病的目标药物11种，分别是治疗高血压的降压药物：硝苯地平、氨氯地平、缬沙坦、厄贝沙坦氢氯噻嗪、坎地沙坦、替米沙坦、替米沙坦氢氯噻嗪、奥美沙坦；治疗冠心病的药物：氯吡格雷、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀。其中氨氯地平、厄贝沙坦氢氯噻嗪、氯吡格雷、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀5个仿制药品种为带量采购目录品种（其对应原研药未中选带量采购），即中选品种，其余6个仿制药及其对应的原研药品种均为非带量采购目录品种，即未中选品种。
1.2 数据来源
数据来源于上海市某三级医院的药品信息管理系统，分别抽取2018年4月1日至9月30日及2019年4月1日至9月30日该院用药数据，包括药品使用量、销售金额等。本研究采用世界卫生组织（WHO）官方网站提供的药物限定日剂量（defined daily dose, DDD）确定各药物的DDD值。因为高血压的复方制剂厄贝沙坦氢氯噻嗪和替米沙坦氢氯噻嗪无法在WHO网站直接查询到DDD值，所以根据WHO发布的《ATC分类和DDD分配指南（2020）》[8]分配原则，可以采用日维持剂量，且DDD值为每日给药的片数。
1.3 方法
1.3.1 使用数量和使用金额占比
医院药品零加成后，医院销售价等于采购价，统一采用药品采购价作为研究对象。研究时间分两组：政策实施前（2018年4月至9月）和政策实施后（2019年4月至9月）。研究中某一种药物的使用数量可以标化为该药品的用量(DDDs)，DDDs =某药品的消耗总剂量(mg)/该药DDD值(mg), DDDs反映了某药物的使用人数和人均使用频率，该值越大，表明使用人数越多或人均使用率越高[9]；用一个DDD的购买费用作为该药物的日费用，以此反映该药物的可负担性。日费用(DDDc)=[某药品采购价/该药每盒的剂量(mg)]×该药DDD值(mg)。
中选和未中选原研药或者仿制药的使用数量和金额占比为该组内对应类型原研药或仿制药的DDDs和使用金额，分别除以原研药和仿制药的使用数量总DDDs和使用总金额。原研药或者仿制药的使用数量和金额占比为两种类型的原研或仿制药使用数量和金额占比的总和。
1.3.2 日费用及使用数量
以每组中选和未中选原研药或仿制药DDDc的加权平均费用作为研究对象，观察政策实施前后两种类型原研药及仿制药的日费用和使用数量的变化情况。原研药和仿制药DDDc是所有原研或仿制药DDDc的加权平均价格。
1.3.3 潜在费用节省率
因为药品的品种一直处于动态变化之中，而且每年的就诊人数在不断增长，本研究分别将政策实施前后的仿制药及原研药的数据进行分析，得到每个目标药品的日费用比及潜在费用节省情况。
仿制药与原研药的日费用比=仿制药DDDc/原研药DDDc×100%。
潜在节省的药品费用是指如果药物使用量不变，以仿制药替代原研药可以节省的费用。潜在费用节省率是指某药品节省的费用除以该原研药在4月至9月的使用金额。
节省费用(P)=Σ(原研药DDDc-仿制药DDDc)×原研药DDDs
潜在费用节省率=（P/原研药4月至9月使用金额）×100%
2. 结果
2.1 使用数量和使用金额占比
政策实施前后原研药和仿制药使用数量及使用金额占比见表1。
表 1 带量采购政策实施前后原研药和仿制药使用数量及使用金额占比(%)时间 未中选药品数量占比 中选药品数量占比 未中选药品金额占比 中选药品金额占比 原研 仿制 原研 仿制 原研 仿制 原研 仿制 2018.04-09 38.74 6.08 45.58 9.60 26.44 2.39 59.59 11.59 2019.04-09 33.89 7.95 24.22 33.94 38.93 4.76 39.23 17.07 由表1可知，政策实施后，未中选和中选的原研药使用数量占比都呈现下降趋势，分别下降了12.52%和46.86%。未中选原研药使用金额占比呈现上升趋势，上升了47.24% ，而中选原研药使用金额占比下降了34.17%。未中选和中选的仿制药使用数量占比和金额占比都呈上升趋势，使用数量占比分别上升了30.76%、253.54%，使用金额占比分别上升了99.16%、47.28%。所有目标药物原研药使用数量和使用金额占比呈现下降趋势，使用数量占比下降更快。使用数量占比由84.32%下降至58.12%，降幅为31.07%；使用金额占比由86.02%下降至78.16%，降幅为9.14%。仿制药的使用数量和使用金额占比都呈现上升趋势，其中使用数量占比上升更快，上升了167.09%，使用金额占比上升了56.22%。
2.2 日费用及使用数量
带量采购政策实施前后目标药品原研药和仿制药DDDc、DDDs及使用总金额见表2和表3。
表 2 带量采购政策实施前后原研药和仿制药的日费用(单位：元)时间 未中选药品的DDDc 中选药品的DDDc 仿制药DDDc 原研药DDDc 仿制药/原研药价格比(%) 原研 仿制 原研 仿制 2018.04-09 4.61 2.65 8.83 8.16 6.02 6.89 0.87 2019.04-09 4.46 2.33 6.29 1.95 2.02 5.22 0.39 表 3 带量采购政策实施前后原研药和仿制药的总用量及总金额时间 未中选药品DDDs 中选药品DDDs 仿制药DDDs 原研药DDDs 使用总金额（万元） 原研 仿制 原研 仿制 2018.04-09 633 248 99 460 745 059 156 859 256 319 1 378 307 1 104.35 2019.04-09 611 842 143 490 437 290 612 604 756 095 1 049 132 700.72 由表2和表3可知，政策实施后，总的药品使用数量增加了10.44%，使用总金额却下降了36.55%。11种目标药物原研和仿制品种的DDDc均呈下降趋势，但是仿制药下降幅度更大，降幅达到66.45%，而原研药价格降幅为24.24%；仿制药与原研药在两组中加权平均日费用的比值从0.87下降到0.39，费用差距明显变大。未中选的原研药DDDc下降了3.25%，中选的下降28.77%；而仿制药则分别下降了12.08%、76.10%。相比于政策实施前，原研药使用量呈现下降趋势，下降了23.88%；而仿制药使用量呈现上升趋势，上升了194.98%，仿制药使用率明显提高。其中未中选和中选的原研药使用数量分别下降3.38%、41.31%；仿制药分别增加44.27%、290.54%。对照药品中选原研品种福辛普利的DDDs由3099增加到5451，增加了75.90%，DDDc由4.20元下降至1.26元，下降了70.00%。福辛普利日费用下降幅度与中选仿制药品种相似，且远高于未中选原研药的下降幅度，但其使用量的增加幅度不如中选仿制药品种，可能与该药本身临床应用较少有关。
2.3 仿制药与原研药日费用比和潜在费用节省率
带量采购政策实施前后各目标药物仿制药与原研药日费用比和潜在费用节省率见表4和表5（表格中药企名称为简称）。
表 4 带量采购政策实施前11种药物仿制药与原研药日费用比及潜在费用节省率药品名 仿制药DDDc（元） 原研药DDDc（元） 原研药企 仿制药/原研药日费用比 原研药DDDs 潜在节省费用（万元） 硝苯地平控释片 2.64 4.02 拜耳 0.66 151 130 20.79 氨氯地平片① 1.95 4.43 辉瑞 0.44 165 592 41.18 缬沙坦胶囊 2.58 5.17 诺华 0.50 165 494 42.89 厄贝沙坦氢氯噻嗪片① 2.62 4.53 赛诺菲 0.58 70 791 13.52 坎地沙坦酯片 2.18 5.17 武田制药 0.42 51 107 15.26 替米沙坦片 2.00 2.66 勃林格殷格翰 0.75 132 790 8.82 替米沙坦氢氯噻嗪片 4.60 5.49 勃林格殷格翰 0.84 21 644 1.93 奥美沙坦酯片 4.66 6.49 第一三共制药 0.72 111 083 20.30 氯吡格雷片① 10.08 17.13 赛诺菲 0.59 151 375 106.83 阿托伐他汀钙片① 6.12 8.53 辉瑞 0.72 240 765 57.99 瑞舒伐他汀钙片① 6.88 7.53 阿斯利康 0.91 116 536 7.52 潜在节省费用总计 337.03 费用节省率，% 35% 注：①表示该药品为“4+7”带量采购目录中药品 表 5 带量采购政策实施后11种药物仿制药与原研药日费用比及潜在费用节省率药品名 仿制药DDDc（元） 原研药DDDc（元） 原研药企 仿制药/原研药
日费用比原研药DDDs 2019年实际
总节省
费用（万元）潜在节省费用
（万元）硝苯地平控释片 1.62 4.02 拜耳 0.40 172 242 –8.19 41.26 氨氯地平片① 0.59 3.26 辉瑞 0.18 102 340 40.45 27.28 缬沙坦胶囊 2.53 5.01 诺华 0.51 153 188 6.96 37.92 厄贝沙坦氢氯噻嗪片① 2.18 3.67 赛诺菲 0.59 42 280 15.96 6.31 坎地沙坦酯片 2.18 4.45 武田制药 0.49 49 105 4.48 12.56 替米沙坦片 1.54 2.54 勃林格殷格翰 0.61 119 014 3.64 11.82 替米沙坦氢氯噻嗪片 4.60 5.39 勃林格殷格翰 0.85 16 639 1.37 1.31 奥美沙坦酯片 4.59 6.49 第一三共制药 0.71 101 654 3.89 19.27 氯吡格雷片① 3.34 13.10 赛诺菲 0.25 74 032 191.82 72.26 阿托伐他汀钙片① 0.94 6.11 辉瑞 0.15 137 977 123.19 71.29 瑞舒伐他汀钙片① 1.31 5.54 阿斯利康 0.24 80 661 20.07 34.13 节省费用总计 403.63 333.99 费用节省率，% 61% 注：①表示该药品为“4+7”带量采购目录中药品 政策实施前后，11种目标药物仿制药与原研药的日费用比分别在0.42～0.91、0.15～0.85之间。两组中日费用比差异最大的分别是坎地沙坦酯片和阿托伐他汀钙片，最小的是瑞舒伐他汀钙片和替米沙坦氢氯噻嗪片。该政策实施后，原研药和仿制药销售总金额减少了403.63万元。如果将政策实施前后目标药品原研药全部替换成仿制药，则该医院分别可节省潜在费用为337.03、333.99万元；潜在费用节省率为35%、61%。由于带量采购政策实施后，除硝苯地平、替米沙坦、阿托伐他汀和瑞舒伐他汀外，原研药品种使用数量下降，而原研药与仿制药DDDc差值下降并不明显，导致潜在节省费用减少了66.41万元，故政策实施后潜在节省费用下降不是十分明显。因为潜在节省费用变化不大，而原研药使用金额却大幅下降，所以潜在费用节省率相对于政策实施前变化十分明显。
3. 讨论
3.1 带量采购政策对仿制药替代和药品费用的影响
带量采购政策实施后，仿制药使用数量DDDs大幅增加，原研药使用数量下降，患者的药品费用明显减少。仿制药使用数量急剧上升是因为大部分中选品种为仿制药，该政策执行下，医院每月必须要完成约定额度的中选品种使用数量，否则将受到处罚，如政府部门减少对医院改革的奖励资金、取消医院的医保定点资格以及降低医院的等级等[10]。同时对医生处方用药产生一定的行政压力，如医院对未优先使用带量采购药品的医生进行经济惩罚和约谈等，利用行政措施促使医生使用中选品种。由于以量换价政策的实施，药品价格降低，在医生和药师的用药教育下，部分患者愿意接受效果相同而价格更低的仿制药进行治疗。并且中选药品价格下降对未中选的药品产生“波纹效应”[11]，导致药品的整体价格下降。
3.2 带量采购政策对仿制药使用的数量和金额占比产生影响
政策实施后，11种目标药品仿制药使用数量及金额占比上升明显，如仿制药使用金额占比分别由13.98%上升到21.84%，这一结果与北京市85家二、三级公立医院调查的结果相似，其心血管类仿制药金额占比为18.93%[12]。然而，长期以来，在医师和患者中业已形成了仿制药质量和疗效远不及原研药的认知。只有保证仿制药质量和效果与原研药相同，仿制药才能真正的替代原研药，因此我国仍需要加快仿制药一致性评价。研究中发现仿制药使用率低于原研药，可能与医生的处方习惯和患者对仿制药的态度有关。本文未中选品种有一半以上，医生受到的带量采购政策的约束较少，在临床诊疗过程中，可能会优先选择同样治疗心血管疾病且存在原研产品的药物。虽然药监部门宣称仿制药与原研药拥有相同的质量和疗效，但临床疗效评价的真实世界证据的缺乏，使医生和患者对于仿制药的效果仍然有很多顾虑[13]。因此，政府部门应鼓励相关企业和医疗机构开展仿制药与原研药一致性研究，确证仿制药在临床实际使用过程中是否能够真正有效替代原研药，并及时公布相关研究结果。同时，需要制定更详细的临床用药指南来规范医师的处方行为；完善奖励机制，鼓励医生和药师优先使用仿制药，如向医生和患者普及仿制药的相关知识，提高仿制药的替代使用率。对仿制药宣传教育活动进行适当的资金支持；扩大在权威媒体上的宣传；积极进行社区教育，帮助患者了解仿制药和一致性评价制度，减少医患之间的矛盾。
3.3 带量采购政策对原研药与仿制药价格差异的影响
政策实施后11种目标药物的原研药比仿制药价格高出548.03%～17.15%，大部分药品超过了原研与仿制药价格差应在30%以下的规定[14]。这一结果与我国某省198个样本药品调查结果吻合，该省原研药与仿制药价格差异倍数的均值为3.6倍[15]。原研药因其质量优势通常与仿制药实行区别定价，缺乏竞争导致价格水平较高，仿制药竞争激烈导致价格较低。并且带量采购政策实施后，仿制药价格下降明显，原研药价格降幅较小，导致原研药与仿制药价格差进一步增大。因此，政府应该发挥主导作用，加强对原研和仿制药品价格的监管力度；药品企业在降价时，应该以保证药品质量为前提，遵循经济规律，避免出现过去集中招标采购的断供和弃标现象。
综上，带量采购政策实施后，心血管类原研药使用数量和金额下降，仿制药使用数量上升，患者的药品费用支出减少；仿制药的替代率仍然较低，存在很大的费用节省空间；原研药与仿制药价格差距增大。本文中，带量采购政策实施对药物利用的经济性方面产生了积极影响。带量采购的目的，通过促进竞争，推动药品降价和仿制药替代，通过量价挂钩、及时回款降低医药企业销售费用和财务成本，进一步降低药品价格。通过设定质量门槛，让患者以更低廉的价格用上质量高效的药品。本文发现政策实施后药品价格下降，仿制药替代效应明显， DDDc下降的同时DDDs上涨，总体使用金额下降，改革基本达到预期目标。当然，带量采购还面临着如何保障质量、如何提升药品企业参与一致性评价的积极性、医院使用中选药品的积极性等挑战，需要配套政策加以完善。比如，应当进一步加大仿制药替代原研药的政策宣传，扩大政策实施的范围，加快仿制药一致性评价进程和采取措施避免原研药与仿制药价格差距的扩大。
本研究不足之处是在上海市的1家公立三级医院进行的研究，仅选择了治疗心血管疾病的11种药物，分析范围有一定局限性。未来的研究可以进一步扩大研究范围，将该城市不同级别医院都作为研究对象，按照治疗的不同疾病，分析各药品的原研药和仿制药使用情况，提供更全面的参考。
-
图 1 DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响
A. Z-FR-MCA活性；B.CTSK/CSA*复合物；C.胶原降解活性；*P<0.05, ***P<0.001，与不加DMSO组比较
表 1 二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选
化合物成分 英文名称 CTSK/CSA*
抑制率(%)ZFR-MCA
抑制率(%)Libdock
得分胶原降解
抑制率(%)来源 墨旱莲皂苷Ⅴ eclalbasaponin Ⅴ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅰ eclalbasaponin Ⅰ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅱ eclalbasaponin Ⅱ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅶ eclalbasaponin Ⅶ 11.3±1.3 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅸ eclalbasaponinⅨ 88.6±9.2 0 / 70.3 M 红景天苷 Salidroside 27.8±3.1 0 / N 异毛蕊花糖苷 Isoacteoside 65.3±4.7 0 / / N 橄榄苦苷 Oleuroprin 35.9±2.4 0 / N 蟛蜞菊内酯 Wedelolactone 58.7±5.8 2.81 / 50.1 M 熊果酸 Ursolic Acid 0 59.7 / N 齐暾果酸 Oleanic acid 0 47.1 / N 刺囊酸 Echinocystic acid 0 0 / M 木樨草素 Luteolin 62.1±8.6 0 / M、N 蒙花苷 linarin 37.2±3.1 0 / M 槲皮素 quercitrin 68.5±5.9 0 / M、N 木樨草苷 galuteolin 33.2±3.7 0 / M、N 异去甲基蟛蜞菊内酯 Isowedelolactone 0 7.0 / M 松果菊苷 Echinacoside 55.9±6.5 9.7 / N 女贞苷 Nuezhenoside 51.2±4.7 0.10 / 53.2 N 特女贞苷 Specneuzhenide 58.6±6.4 17.9 / 49.7 N 女贞苷G13 Nuezhenoside G13 23.7±2.4 0.16 / N 3-O-乙酰基齐墩果酸 3-O-acetyl oleanolic acid 0 66.7 / N 19α-羟基熊果酸 19α-OH Ursolic Acid 0 53.2 / N 儿茶素 catechin 11.3 15.3 / M 表儿茶素 L-Epicatechin 12.7 18.7 / M 表儿茶素没食子酸酯 (-)-Epicatechin gallate 51.2±5.4 10.5 / 60.2 M 大黄素甲醚 Emodin monomethyl ether 19.8±1.7 0 / N β-谷甾醇 β- Sitosterol 0 0 / N 3’ 4-二羟基苯乙醇 3,4-dihydroxyphenethyl 70.3±8.4 83.2 76.4848 N 对羟基苯乙醇 p-hydroxyphenethyl 62.4±6.7 79.5 73.9225 N 注：M：墨旱莲；N：女贞子。 
下载: 导出CSV
-
[1] CALIÒ A N, BRUNELLI M, GOBBO S, et al. Cathepsin K: a novel diagnostic and predictive biomarker for renal tumors[J]. Cancers,2021,13(10):2441. doi: 10.3390/cancers13102441 [2] DAI R C, WU Z T, CHU H Y, et al. Cathepsin K: the action in and beyond bone[J]. Front Cell Dev Biol,2020,8:433. doi: 10.3389/fcell.2020.00433 [3] LI Z Q, HOU W S, ESCALANTE-TORRES C R, et al. Collagenase activity of cathepsin K depends on complex formation with chondroitin sulfate[J]. J Biol Chem,2002,277(32):28669-28676. doi: 10.1074/jbc.M204004200 [4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典一部: 2020年版[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020. [5] 梁文娜, 李西海, 胡柳, 等. 二至丸抑制绝经后骨质疏松大鼠骨代谢紊乱的作用机制研究[J]. 中医正骨, 2017, 29(11):1-7,14. doi: 10.3969/j.issn.1001-6015.2017.11.001 [6] 胡科. 二至丸对骨质疏松性股骨颈骨折术后愈合及髋关节功能的影响[J]. 现代中西医结合杂志, 2017, 26(4):384-386. doi: 10.3969/j.issn.1008-8849.2017.04.014 [7] 俞益火, 陈久毅, 王建. 二至丸治疗绝经后骨质疏松症的疗效观察[J]. 中国中医骨伤科杂志, 2011(4):42-43. [8] 蔡秀江, 黄美艳, 丁安伟, 等. 二至丸考源及药理作用研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(23):272-275. doi: 10.3969/j.issn.1005-9903.2011.23.080 [9] 蒋益萍, 吴岩斌, 秦路平, 等. 墨旱莲组分中组织蛋白酶K非活性位点抑制剂研究[J]. 药学学报, 2017, 52(6):936-942. doi: 10.16438/j.0513-4870.2016-1234 [10] 钟询龙, 王若伦, 段炼, 等. 基于UPLC/Q-TOF-MS技术分析女贞子与墨旱莲配伍协同增效的物质基础[J]. 中国医院药学杂志, 2017, 37(19):1887-1891. doi: 10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2017.19.02 [11] 李雯, 庞旭, 韩立峰, 等. 中药墨旱莲化学成分研究[J]. 中国中药杂志, 2018, 43(17):3498-3505. doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20180625.001 [12] 刘美红, 邹峥嵘. 女贞子化学成分, 药理作用及药动学研究进展[J]. 热带亚热带植物学报, 2022(003):030.446-460. [13] SHARMA V, PANWAR P, O'DONOGHUE A J, et al. Structural requirements for the collagenase and elastase activity of cathepsin K and its selective inhibition by an exosite inhibitor[J]. Biochem J,2015,465(1):163-173. doi: 10.1042/BJ20140809 [14] XU D, LYU Y, CHEN X W, et al. Fructus Ligustri Lucidi ethanol extract inhibits osteoclastogenesis in RAW264.7 cells via the RANKL signaling pathway[J]. Mol Med Rep,2016,14(5):4767-4774. doi: 10.3892/mmr.2016.5849 [15] LIU Y Q, HONG Z L, ZHAN L B, et al. Wedelolactone enhances osteoblastogenesis by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway but suppresses osteoclastogenesis by NF-κB/c-fos/NFATc1 pathway[J]. Sci Rep,2016,6:32260. doi: 10.1038/srep32260 [16] TEPEL C, BRÖMME D, HERZOG V, et al. Cathepsin K in thyroid epithelial cells: sequence, localization and possible function in extracellular proteolysis of thyroglobulin[J]. J Cell Sci, 2000, 113 Pt 24: 4487-4498. [17] VASSALLE C, IERVASI G. Cathepsin K: a classical bone biomarker in cardiovascular disease: the heart is not alone anymore[J]. Atherosclerosis,2013,228(1):36-37. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2013.01.042 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 3729
- HTML全文浏览量: 1380
- PDF下载量: 17
- 被引次数: 0
