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苦豆子（Sophora alopecuroides）为豆科（Leguminosae）槐属的草本植物，广泛生长于我国西北地区。在宁夏境内，苦豆子分布面积约为25余万公顷，其中，在盐池县分布14万公顷，占宁夏境内苦豆子总分布面积的56%，是宁夏特有的区域性药用植物[1]。苦豆子具有清热解毒、抗菌消炎的药理作用，临床上用于治疗痢疾、外伤化脓、顽癣等疾病[2]。近年来，随着对苦豆子主要活性成分生物碱的广泛研究，发现其具有缓解肝损伤、抗肝纤维化和抑制肝癌等作用[3]。本文主要对苦豆子活性成分及其防治肝脏疾病的研究进展进行综述，为苦豆子活性成分治疗肝脏疾病的进一步研究提供参考。
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苦豆子的化学成分丰富且复杂，目前从苦豆子中分离得出的活性成分主要有生物碱、黄酮、挥发油、甾体、多糖、游离脂肪酸等[4]。
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苦豆子主要活性成分中生物碱含量最高。目前，分离鉴定出的生物碱多达数十种（表1），主要为喹诺里西啶类生物碱，可分为苦参碱型和苦豆碱型。前者主要包含苦参碱（matrine，MT）、氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）、槐果碱（sophocarpine，SCA）、槐定碱（sophoridine，SRI），后者有苦豆碱（aloperine，ALO）[5]，化学结构见图1。药理学研究表明苦参碱型生物碱具有抗肿瘤[6]、抗炎[7]、抗病毒[8]、抗心律失常[9]等作用。
表 1 部分已分离得出的苦豆子生物碱
编号 苦豆子生物碱 文献 1 苦参碱（matrine） [10] 2 氧化苦参碱 (oxymatrine) [11] 3 槐果碱 (sophocarpine) [10] 4 槐定碱 (sophoridine) [10] 5 苦豆碱 (aloperine) [11] 6 莱曼碱 (lehmannine) [12] 7 槐胺碱 (sophoramine) [11] 8 新槐安碱 (neosophoramin) [11] 9 7α-羟基槐胺碱 (7α-hydroxysophoramine) [10] 10 3α-羟基槐定碱 (3α-hydroxy-sophoridine) [11] 11 9α-羟基槐胺碱 (9α-hydroxysophoramine) [10] 12 13,14-去氢槐定碱 ((−)-13,14-dehydrosophoridine) [13] 13 N-羟基槐定碱 (N-hydroxy-sophoridine) [13] 14 12-β羟基槐果碱 (12β-hydroxysophocarpine) [10] 15 9α-羟基苦参碱 (9α-hydroxy-matrine) [13] 16 14-β羟基苦参碱 (14β-hydroxy-matrine) [10] 17 氧化槐定碱 (oxysophoridine) [11] 18 氧化槐果碱 (oxysophocarpine) [11] 19 N-甲基苦豆碱 (N-methyl-aloperine) [11] 20 赝靛叶碱 (baptifoline) [10] 21 臭豆碱 (anagyrine) [11] 22 金雀花碱 (cytisine) [11] 23 甲基金雀花碱 (N-methyl-cytisine) [11] 24 羟乙花碱 (N-2-hydroxyethyl-cytisine) [2] 25 尼古丁 (nicotine) [11] 26 腺荚豆碱 (adenocarpine) [10] 27 三巴豆四胺 (tricrotonytetramine) [13] 
图 1 苦豆子生物碱的化学结构
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黄酮是苦豆子另一主要活性成分。李敏等[14]从新疆苦豆子中分离鉴定出3′，4′-二羟基异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、7，3′-二羟基二氢黄酮-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及芦丁3种成分。卞海涛等[15]从苦豆子中首次分离得到5，6-二羟基-3，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、β-胡萝卜苷、3′-甲氧基木犀草素3种成分。苦豆子黄酮类成分具有抗炎[14]、降血糖[16]、抗病毒和抗菌[17]等药理作用。
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马别厚等[18]采用GC-MS研究苦豆子豆籽油化学成分，分离得到了豆甾醇、麦角甾醇等5种甾体化合物；张建华等[19]从苦豆子中检测出谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、胱氨酸等16种氨基酸。并且苦豆子中谷氨酸可以促进人体内消化液的分泌，具有预防贫血和解毒的作用。除此之外，还有脂肪酸、挥发油、多糖等化学成分，其中，多糖具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性[20-21]。
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病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的传染病，其中，慢性乙型肝炎（CHB）感染是一个非常严峻的世界公共卫生问题，其发病率呈逐年上升趋势。目前，拉米夫定等临床常用药物非但不能彻底清除乙肝病毒（HBV），而且长期使用还会产生明显的耐药问题，难以取得令人满意的治疗效果。近年来，越来越多的研究表明，传统中药苦豆子在抗乙肝药物研究中具有独特优势，从中药宝库中寻找天然抗病毒活性部位或活性成分，已成为发掘新药的重要途径之一。
赵义勇等[17]利用苦豆子总黄酮提取物对鸭乙型肝炎进行治疗，结果发现该提取物在体外能够剂量依赖地抑制细胞内HBV-DNA的表达，表现出较强的体外抗病毒活性；在体内实验中，该提取物可明显降低鸭血清中DHBV-DNA的水平，提示苦豆子总黄酮对鸭乙型肝炎有很好的治疗作用。除此之外，王浩等[22]研究发现，采取拉米夫定联合氧化苦参碱对慢性乙型肝炎患者进行治疗，结果发现患者外周血单核细胞中Toll样受体9（TLR9）信号通路关键分子的mRNA和蛋白表达增加，血清抗病毒细胞因子水平显著升高。该研究提示拉米夫定联合氧化苦参碱能够发挥有效的抗HBV作用，其机制与激活TLR9信号通路、诱导抗病毒细胞因子释放有关。不仅如此，王青等[23]研究还发现氧化苦参碱和阿德福韦酯均可抑制HepG2.2.15细胞HBV-DNA的分泌，抑制乙肝表面抗体HBeAg、HBsAg表达；而氧化苦参碱亦可显著降低HepG2.2.15细胞内HBV rcDNA以及cccDNA的水平，引起pgRNA水平的增加，这些结果提示氧化苦参碱的抗HBV的作用环节可能位于cccDNA转录形成pgRNA之后至子代病毒形成之前，有必要对HBV的复制包装过程进行详细分解做进一步研究。
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非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除酒精和其他明确的损肝因素外所致的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。近年来随着对其发病机制的深入了解，抗NAFLD新药不断发现，科学家从苦豆子中提取的生物碱、黄酮类、酚类等中药成分具有较明确的抗氧化作用，具有毒副作用小等多种独特优势，成为治疗NAFLD的研究热点之一。
宋春艳等[24]利用槐果碱对非酒精性脂肪性肝炎小鼠进行干预，结果发现槐果碱可显著抑制小鼠体内白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达，缓解小鼠非酒精性脂肪性肝炎。该研究提示槐果碱可能通过抑制炎症细胞因子的合成来减轻肝细胞内线粒体的损伤，从而减轻肝细胞的毒性损伤。此外，史丽娟等[25-26]实验研究发现氧化苦参碱可抑制脂质从头合成途径，同时降低了NAFLD大鼠的固醇调节元件结合转录因子1（Srebf1）的mRNA表达，增加过氧化物酶体增殖物激活受体α（Pparα）的mRNA表达。提示氧化苦参碱对NAFLD大鼠肝脏脂肪变性的治疗作用可能与下调Srebf1和上调Pparα介导的代谢途径相关。除了氧化苦参碱，唐彬等[27]通过实验发现苦参碱对NAFLD大鼠同样具有显著疗效，其能够降低高脂饮食大鼠肝组织中三酰甘油、总胆固醇的含量，抑制炎症损伤，降低肝脏环氧化物酶（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达水平。研究结果提示苦参碱对NAFLD大鼠的治疗作用可能与抑制COX-2、iNOS 表达，阻止炎症发生和抗氧化相关。
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肝纤维化是各种病因所致慢性肝损伤的修复反应，其主要特征是细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）在肝内的过度沉积，导致肝脏结构改变和肝功能丧失。目前研究认为，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化是肝纤维化的核心事件，而持续炎症是HSC活化的主要诱因。HSC是肝脏中产生胶原纤维的主要细胞，在肝脏受损时激活，分化成为肌成纤维样细胞，分泌大量细胞因子、趋化因子和生长因子，并产生大量的ECM，从而促进肝纤维化的发生和发展。肝纤维化持续进展会发展为肝硬化甚至肝癌，病死率极高，因此，逆转肝纤维化对于预防肝硬化和肝癌具有重要意义。目前临床上治疗肝纤维化的传统中药包括苦参碱和氧化苦参碱类生物碱。
杨增玺等[28]通过研究发现不同剂量苦参碱作用4周后可减轻CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝脏的纤维化程度，抑制肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润以及胶原纤维沉积。苦参碱可抑制HSC的活化和增殖，减少α-平滑肌激动蛋白的表达，保护肝细胞，同时抑制小鼠肝脏中TGF-β1和血小板衍生生长因子-B（PDGF-B）的表达，从而产生抗肝纤维化作用。此外，闫冰川等[29]研究发现苦参碱联合扁桃苷用药可以改善CCl4肝纤维化模型小鼠的精神、活动、毛色和饮食状况，明显降低小鼠血中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的水平，表明两者联用可以发挥改善肝纤维化的效果。临床研究发现[30]，171位肝炎和肝硬化患者通过静脉注射 400 mg/d苦参素注射液后发现肝纤维化程度降低，表明氧化苦参碱具有逆转肝纤维化作用。除此之外，另一项研究发现氧化苦参碱可降低TGF-β1和TNF-α的水平，抑制HSC的活化，减少ECM的释放，同时增加患者血清中IL-10的水平，进而减轻肝炎症状、改善肝功能，预防肝纤维化[31]。
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肝硬化（liver cirrhosis）是临床常见的慢性进行性肝病，是由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。目前对于肝硬化并没有特效的治疗手段，干扰素α及核苷和核苷酸类抗病毒药物存在应答率低、药物难取得、并发症风险高、耐药和治疗成本高等问题[32]，很难取得良好的治疗效果。药理学研究表明，苦豆子中的生物碱成分可能会对肝硬化起到治疗作用[33]。
毛丽萍等[34]研究发现，乙肝肝硬化患者在经过苦参碱治疗1个月后，其外周血自然杀伤细胞（NK细胞）表面活化性受体NKG2D表达水平有所增加，提示具有免疫调节作用的苦参碱可以上调乙肝肝硬化患者NKG2D的表达水平，从而减少乙肝肝硬化患者发展至肝癌的概率。
此外，祝尔健等[35]通过研究发现，肝硬化患者应用苦参碱治疗8周后，其患者体内ALT、AST、血清总胆红素（TBil）水平均较单纯护肝患者明显降低；苦参碱治疗后患者的HBV-DNA、HBeAg阴转率均高于单纯护肝患者。该研究提示治疗肝硬化过程中，有必要在护肝治疗的同时联用安全、有效的药物苦参碱。
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肝衰竭（hepatic failure）是由多种因素引起的严重肝损伤，临床主要表现为黄疸、凝血功能障碍、肝肾综合征、肝性脑病、腹水等症状。目前治疗肝衰竭的药物有核苷类药物、N-乙酰半胱氨酸、肾上腺皮质激素等[36]。但皮质激素治疗肝衰竭存在不良反应多、药物用量和作用时机难以把握等问题[37]。药物疗效并不理想，因此，肝衰竭治疗药物的研究迫在眉睫，而苦豆子生物碱在肝衰竭防治方面具有开发前景。
张弦等[38]研究发现，氧化苦参碱能够明显改善脂多糖/D-氨基半乳糖（LPS/D-GalN）诱导的大鼠急性肝衰竭肝脏的病变，降低肝脏转氨酶，并通过抑制急性肝衰竭大鼠肝组织TLR4的表达，降低TNF-α、IL-1β和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspases-3）的表达水平以及Bax/Bcl-2的比例，从而产生抑制肝细胞凋亡的作用，保护肝细胞。其另一项研究[39]发现，氧化苦参碱联合复方茵陈颗粒（FYK）预处理可减轻急性肝衰竭大鼠的肝损伤程度，同时降低肝衰竭的发生率。除此之外，向晓星[40]等的研究结果同样证实氧化苦参碱对于肝衰竭具有保护作用。
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据2020年WHO报道，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发病率居全球第6位、病死率居全球第3位。2020年我国发病例数和死亡人数分别多达41万和39万，HCC的发病率约占全球43%，由此看来，我国HCC的病情形势非常严峻。临床上一般采取肝脏切除和移植、局部消融或动脉化疗栓塞等方法治疗[41]。国内外大量研究报道，许多中药成分及天然产物也具有抗肿瘤的作用，其中，苦豆子的生物碱成分便是其中之一。
杨晓娟等[42]将0～4 mg/ml的苦参碱加入到HepG2和BEL-7404肝癌细胞中，结果发现苦参碱能够以时间和浓度依赖性的方式抑制肝癌细胞增殖，并诱导其凋亡。机制研究发现其可能通过激活p38/JNK信号通路，下调抑凋亡基因Bcl-2和上调促凋亡基因Bax及caspases 3的表达来诱导肝癌细胞凋亡。此外，Liu等[43]研究发现苦豆碱能够剂量依赖性地抑制Hep3B和Huh7肝癌细胞的增殖、诱导肝癌细胞凋亡和G2/M细胞周期阻滞。另一项研究报道[44]，0～20 mg/ml槐定碱可通过增强抑癌基因PTEN的表达，抑制PI3K/AKT信号通路的激活，同时增加caspases 3/9）和基质金属蛋白酶3/9（MMP3/9）的蛋白表达，最终抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡。Zhang等[45]报道1000 μmol/L槐果碱能够显著抑制HCC-LM3和MHCC-97H的细胞增殖率，使细胞周期阻滞在G0/G1期。其作用机制是通过抑制AKT/GSK3β/β-catenin轴和TGF-β诱导的肝癌细胞的上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）发挥治疗肝癌的作用。
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近年来，随着新药研发和临床需求的不断扩大，苦豆子作为传统中药，其抗炎、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等药理作用不断被发现。本文就宁夏苦豆子中的主要成分及其在治疗肝脏疾病中的活性作用进行了综述，发现苦豆子在治疗病毒性肝炎、非酒精性肝病、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌等疾病中可能发挥重要作用，其中，苦参碱（斯巴特康）注射液已于临床用于急、慢性肝炎、肝硬化及其他肝胆疾病的治疗。
尽管国内外对苦豆子的研究不断增多，但是关于苦豆子的药物研究和开发仍然存在诸多问题，如黄酮、挥发油类等研究还较少，对苦参碱（素）类药物的临床副反应还不明确，药物和药物之间可能存在的相互作用尚未清楚，对活性成分在不同组织中的分子靶点和作用机制的研究不够深入，对苦豆子药动学的临床研究不够充分等。因此，迫切需要科研力量的投入，系统开展苦豆子基础研究，建立一套以宁夏苦豆子活性成分为主的肝病防治药物创新技术体系和苦豆子产业发展的关键技术体系，为宁夏苦豆子的资源利用和高技术产品开发奠定坚实的技术基础。
Research progresses on the main active components in Ningxia Sophora alopecuroides and the therapeutic activities for liver diseases
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摘要: 苦豆子是豆科槐属植物，为宁夏的道地药材之一。苦豆子有着丰富而复杂的活性成分，主要有生物碱、黄酮、挥发油、甾体、多糖、脂肪酸等。近年来，国内外对苦豆子生物碱开展了大量研究，该类生物碱具有抗肝炎、抗肝纤维化、抗肝硬化、抗肝衰竭、抗肝癌等药理作用，其中，苦参碱相关药物已经获批在临床用于治疗乙型肝炎病毒感染等疾病。鉴于苦豆子在肝脏疾病治疗中的药用价值，对苦豆子主要活性成分进行综述，重点阐述其治疗肝脏疾病的研究进展。Abstract: Sophora alopecuroides, a plant of the family Leguminosae, is one of the Daodi herbs in Ningxia. The active constituents of Sophora alopecuroides are abundant and complex, including alkaloids, flavonoids, volatile oils, steroids, polysaccharides, fatty acids and so on. In recent decades, a great number of domestic and overseas studies have been carried out on Sophora alopecuroides alkaloids, which have anti-hepatitis, anti-liver fibrosis, anti-cirrhosis, anti-liver failure and anti-liver cancer and other pharmacological effects. Clinically, Matrine-related drugs are used to treat hepatitis B virus infection and other diseases. This review aims to summarize the main active ingredients of Sophora alopecuroides, mainly focusing on the research progress in their treatment activities for liver diseases.
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Key words:
- Ningxia Sophora alopecuroides /
- active constituents /
- hepatic disease /
- research progress
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新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是指2019年始发、由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn-drome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的肺炎。截至2020年4月5日，全球共确诊COVID-19患者1 093 349例，死亡58 620例[1]。目前尚无针对COVID-19的特异性治疗药物，一些化学药物包括氯喹/羟氯喹、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦等正在临床开展随机对照研究。临床实践表明，清肺排毒汤和连花清瘟胶囊等多种中药方剂和制剂对COVID-19有良好的治疗效果。据国家卫生健康委员会报道，在我国确诊的COVID-19病例中，有74 187人使用了中医药，占91.5%；中医药能够缓解症状，减少轻型、普通型疾病向重型发展，提高治愈率、降低病死率，总有效率达90%以上[2]。
柴胡达胸合剂，曾用名为“强力肺炎1号”，是国医大师梅国强教授为痰热壅肺证COVID-19患者制定的中药处方[3]。柴胡达胸合剂由小柴胡汤、小陷胸汤、达原饮、止嗽散共同组方，包含柴胡、黄芩、法半夏、全瓜蒌、黄连、枳实、甘草、浙贝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、槟榔、草果、藿香、佩兰、虎杖共十八味中药。由于临床使用疗效显著，2020年2月23日，湖北省药品监督管理局下发制剂备案批件，包括柴胡达胸合剂在内的2个由湖北省中医院研制的医院制剂获批用于防治COVID-19[4]。
网络药理学是基于系统生物学和多向药理学技术和方法，通过构建“药物-基因-疾病”网络，分析药物在网络中与特定节点相互作用的关系，从整体角度探索药物与机体相互作用的一门学科[5]。2007年，Hopkins首次在Nature Biotechnology杂志上发表述评，提出网络药理学这一概念，并认为其为发现新药的新范式[6]。中药通过多成分、多靶点、多通路对疾病产生治疗作用，利用网络药理学方法，可系统阐明中药治疗疾病的药理作用机制[7]。
因此，本研究运用网络药理学方法，筛选柴胡达胸合剂治疗COVID-19的活性成分和作用靶点，构建“药材-活性成分-靶点”网络图，然后对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interac-tion, PPI）、GO基因注释和KEGG信号通路分析，为进一步阐明柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 柴胡达胸合剂药材的性味归经、活性成分和靶点的筛选
通过《中华人民共和国药典》（2015年版）手工检索柴胡达胸合剂的十八味中药材的性味归经，利用Cytoscape 3.7.2软件制作“药材-性味归经”网络图。在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）以柴胡达胸合剂中的十八味中药材名为关键词检索得到所有中药的化学成分。生物利用度（oral bioavailability，OB）和半衰期（half life，HL）是影响药动学的重要参数，而类药性（drug-likeness，DL）可以反映化合物的理化性质与已上市的药物是否类似。根据TCMSP数据库推荐的筛选标准，本研究以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件，筛选得到每味中药材的活性成分。同时，通过 TCMSP 数据库查找各活性成分的作用靶点，归纳整理后利用Uniprot 数据库（
https://www.uniprot.org/ ）标准化靶点名称。1.2 “药材-活性成分-靶点”网络图的构建
以coronavirus为关键词，检索GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）和OMIM（https://omim.org/ ）数据库获得COVID-19潜在相关基因；利用Venn图在线绘制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/ ），将柴胡达胸合剂活性成分的作用靶点和COVID-19相关基因取交集，得到柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点；最后，将得到的药材-活性成分-靶点关联性文本导入Cytoscape 3.7.2软件，构建并分析“药材-活性成分-靶点”网络。1.3 PPI网络构建
将柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点导入STRING 蛋白相互作用数据库（
https://string-db.org/ ），物种选定为Homo sapiens，获得PPI信息并导入Cytoscape 3.7.2软件，利用NetworkAnalyzer功能，分析网络中每个靶点的度值（dgree value），使用R软件Graphics包，绘制条形图展示度值排名前20位的靶点。1.4 GO基因注释和KEGG通路分析
利用R软件的org.Hs.eg.db和clusterProfiler包，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点进行GO基因注释和KEGG通路分析，以P＜0.05进行筛选，得到柴胡达胸合剂对COVID-19发挥治疗作用参与的生物学过程和信号通路，并绘制气泡图展示结果。
2. 结果
2.1 柴胡达胸合剂的药材性味归经
柴胡达胸合剂“药材-性味归经”网络如图1所示，图中节点的大小代表该节点在网络中的度值。由图可知，度值最大的性味归经分别为寒（度值=8）、苦（度值=13）和肺经（度值=14）。
2.2 柴胡达胸合剂的活性成分及其作用靶点
通过TCMSP平台检索到柴胡达胸合剂中的十八味药材共包含1 977个化合物。以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件筛选并去重后，共得到221个活性成分。在TCMSP检索活性成分的作用靶点，并到Uniprot数据库中查找其标准名称，最后共得到259个作用靶点。柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息，结果见表1。
表 1 柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息表中药名称 化合物（个） 活性成分（个） 靶点（个） 柴胡 349 14 165 黄芩 143 32 95 法半夏 116 11 70 全瓜蒌 80 7 8 黄连 48 10 153 枳实 65 14 98 甘草 280 76 198 浙贝母 17 4 29 桔梗 102 7 63 百部 110 18 82 前胡 101 11 157 紫菀 91 13 175 款冬花 148 19 155 槟榔 52 3 10 草果 59 5 136 藿香 94 9 147 佩兰 60 6 73 虎杖 62 8 159 2.3 柴胡达胸合剂治疗 COVID-19的作用靶点
通过检索GeneCards和OMIM数据库，共收集得到COVID-19相关基因352个。将柴胡达胸合剂的作用靶点和COVID-19相关基因取交集制作Venn图，共得到51个交集基因，即柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点（图2）。
2.4 “药材-活性成分-靶点”网络
柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络共包含234个节点（药材节点18个，有效成分节点165个，靶点节点51个）。网络中棱形代表药材节点，倒三角代表有效成分节点，圆形代表靶点节点（图3）。节点的颜色越深或节点图形越大，表明该节点在网络中的度值越高。每一圈的最低点为该圈度值最大的节点，度值沿逆时针方向逐渐减小，且3个有效成分节点圈由外往里节点度值依次减小。网络中化合物节点中位数为4，高于2倍中位数的化合物节点共有12个（表2），这些化合物可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要活性成分。
表 2 高于2倍度值中位数的化合物信息表TCMSP数据库ID 化合物名称 对应药材 度值 MOL000098 槲皮素（quercetin） 草果、柴胡、甘草、虎杖、黄连、藿香、款冬花、前胡、紫菀 46 MOL000006 木犀草素（luteolin） 虎杖、桔梗、佩兰、枳实、紫菀 23 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 柴胡、甘草、款冬花、紫菀 16 MOL000358 β-谷甾醇（beta-sitosterol） 百部、半夏、浙贝母、虎杖、黄芩、款冬花、前胡、紫菀 15 MOL000173 汉黄芩素（wogonin） 黄芩 14 MOL004328 柚皮素（naringenin） 甘草、枳实 13 MOL002714 黄芩素（baicalein） 半夏、黄芩 10 MOL000497 甘草查尔酮A（licochalcone A） 甘草 10 MOL001689 刺槐素（acacetin） 黄芩、桔梗 10 MOL005828 川陈皮素（nobiletin） 枳实 10 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 柴胡、甘草、紫菀 9 MOL005916 葛花苷元（irisolidone） 藿香 9 2.5 PPI网络
在“药材-活性成分-靶点”网络中的靶点节点不包含PPI信息，因此，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19靶点进行PPI分析，结果如图4A所示。图中节点形状越大，表明其度值越高，越可能为柴胡达胸合剂治疗COVID-19的核心作用靶点。对网络中度值前30的节点作条形图，节点度值排名前10的蛋白为CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2 和CCL2（图4B）。
2.6 GO基因注释
GO基因注释将基因的功能分为3个部分：参与的生物学过程（biological process，BP），所处的细胞组分（cellular component，CC），执行的分子功能（molecular function，MF）。对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行GO基因注释，以P＜0.05为条件进行筛选，结果得到GO条目共1 722个，其中BP条目1 612个，CC条目30个，MF条目80个。选取每个部分的前5个条目作气泡图，富集最多基因且P值最小的BP、CC和MF条目分别为脂多糖反应、膜筏和细胞因子受体结合（图5）。
2.7 KEGG信号通路分析
对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行 KEGG 信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路156条，选取富集基因最多的10条通路作气泡图。排名前5的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎（图6）。
3. 讨论
COVID-19隶属于中医的“温疫”、“疫病”范畴，病因为感受“异气”、“疠气”，疠气夹湿，病位在肺、脾[3]。柴胡达胸合剂用于痰热壅肺证患者，其病因为痰热互结，壅闭于肺，致使肺失宣降而表现的肺经实热证候。本研究首先对柴胡达胸合剂的十八味中药材进行性味归经的网络分析，结果发现柴胡达胸合剂组方的性味以“苦寒”最多且主归肺经。“苦寒”药能清热泻火，消除热症，多用于具有实热特征病证[8]。因此，柴胡达胸合剂与COVID-19的病机、病位相符。
利用中药、疾病相关数据库，本研究筛选出柴胡达胸合剂治疗COVID-19的165个活性成分和51个作用靶点，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19具有多成分、多靶点的特点。通过构建和分析“药材-活性成分-靶点”网络图，发现网络中度值较高的12个活性成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺槐素、川陈皮素、异鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外，其余11个成分均属于黄酮类化合物。
黄酮类化合物广泛存在于自然界的多种植物中，具有包括抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理作用[9]。黄酮类化合物还有良好的抗病毒作用，对流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒等都有抑制作用[10]。体外实验研究表明，槲皮素和木犀草素均能够抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性，对SARS-CoV 产生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2与SARS-CoV基因序列有约80%同源性，两者3CL蛋白酶结构有相似性[14]。此外，分子对接结果发现山柰酚、槲皮素、 黄芩素、 木犀草素、 汉黄芩素、β-谷甾醇与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶均有较高的结合活性[15]。因此，通过直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制之一。
通过分析PPI网络发现，CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2、CCL2等在网络中有较高的度值。CASP3基因编码的caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，研究发现caspase-3蛋白在SARS-CoV病毒引起的组织细胞凋亡过程中发挥了重要作用[16]。MAPK基因编码的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物学过程。此外，炎症因子风暴被认为是重症COVID-19患者组织损伤的病理机制之一。SARS-CoV-2病毒在体内激活T细胞，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6等细胞因子，随后GM-CSF会进一步激活CD14+CD16+炎性单核细胞，进一步升高IL-6等炎性因子，形成炎症因子风暴，导致严重的肺部和其他器官免疫损伤[17]。细胞因子根据其在炎性反应中的作用不同可分为促炎性细胞因子（如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等）和抑炎性细胞因子（如 IL-4、IL-10 等）两类。SARS患者的肺部炎症和肺损伤与患者血浆中的IL-1B、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子水平升高引起炎症因子风暴有关[18]。同样地，COVID-19患者血浆IL-1B、IFN-γ、CXC趋化因子-10（CXCL-10）等促炎性细胞因子水平也升高[19]。本研究中，IL-6、IL-10和IL-1B均为核心作用靶点。因此，减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平可能也是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制。
对靶点进行GO基因注释的结果表明，柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要生物学过程为脂多糖反应、对源于细菌的分子的反应和氧化应激反应等。脂多糖是G-菌细胞壁的组成成分，可诱导细胞产生炎性反应，其中促炎性细胞因子发挥了重要介导作用。IL-6可促进B细胞分化，并活化MAPK，激活STAT转录因子，从而加重炎性反应[20]。KEGG分析富集到156条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19多通路的特点。
综上所述，本研究采用网络药理学方法，初步揭示了柴胡达胸合剂可能一方面通过多种黄酮类化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，另一方面通过多成分、多靶点、多通路减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平，从而对COVID-19产生治疗作用。
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表 1 部分已分离得出的苦豆子生物碱
编号 苦豆子生物碱 文献 1 苦参碱（matrine） [10] 2 氧化苦参碱 (oxymatrine) [11] 3 槐果碱 (sophocarpine) [10] 4 槐定碱 (sophoridine) [10] 5 苦豆碱 (aloperine) [11] 6 莱曼碱 (lehmannine) [12] 7 槐胺碱 (sophoramine) [11] 8 新槐安碱 (neosophoramin) [11] 9 7α-羟基槐胺碱 (7α-hydroxysophoramine) [10] 10 3α-羟基槐定碱 (3α-hydroxy-sophoridine) [11] 11 9α-羟基槐胺碱 (9α-hydroxysophoramine) [10] 12 13,14-去氢槐定碱 ((−)-13,14-dehydrosophoridine) [13] 13 N-羟基槐定碱 (N-hydroxy-sophoridine) [13] 14 12-β羟基槐果碱 (12β-hydroxysophocarpine) [10] 15 9α-羟基苦参碱 (9α-hydroxy-matrine) [13] 16 14-β羟基苦参碱 (14β-hydroxy-matrine) [10] 17 氧化槐定碱 (oxysophoridine) [11] 18 氧化槐果碱 (oxysophocarpine) [11] 19 N-甲基苦豆碱 (N-methyl-aloperine) [11] 20 赝靛叶碱 (baptifoline) [10] 21 臭豆碱 (anagyrine) [11] 22 金雀花碱 (cytisine) [11] 23 甲基金雀花碱 (N-methyl-cytisine) [11] 24 羟乙花碱 (N-2-hydroxyethyl-cytisine) [2] 25 尼古丁 (nicotine) [11] 26 腺荚豆碱 (adenocarpine) [10] 27 三巴豆四胺 (tricrotonytetramine) [13] 
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