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苦豆子（Sophora alopecuroides）为豆科（Leguminosae）槐属的草本植物，广泛生长于我国西北地区。在宁夏境内，苦豆子分布面积约为25余万公顷，其中，在盐池县分布14万公顷，占宁夏境内苦豆子总分布面积的56%，是宁夏特有的区域性药用植物[1]。苦豆子具有清热解毒、抗菌消炎的药理作用，临床上用于治疗痢疾、外伤化脓、顽癣等疾病[2]。近年来，随着对苦豆子主要活性成分生物碱的广泛研究，发现其具有缓解肝损伤、抗肝纤维化和抑制肝癌等作用[3]。本文主要对苦豆子活性成分及其防治肝脏疾病的研究进展进行综述，为苦豆子活性成分治疗肝脏疾病的进一步研究提供参考。
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苦豆子的化学成分丰富且复杂，目前从苦豆子中分离得出的活性成分主要有生物碱、黄酮、挥发油、甾体、多糖、游离脂肪酸等[4]。
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苦豆子主要活性成分中生物碱含量最高。目前，分离鉴定出的生物碱多达数十种（表1），主要为喹诺里西啶类生物碱，可分为苦参碱型和苦豆碱型。前者主要包含苦参碱（matrine，MT）、氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）、槐果碱（sophocarpine，SCA）、槐定碱（sophoridine，SRI），后者有苦豆碱（aloperine，ALO）[5]，化学结构见图1。药理学研究表明苦参碱型生物碱具有抗肿瘤[6]、抗炎[7]、抗病毒[8]、抗心律失常[9]等作用。
表 1 部分已分离得出的苦豆子生物碱
编号 苦豆子生物碱 文献 1 苦参碱（matrine） [10] 2 氧化苦参碱 (oxymatrine) [11] 3 槐果碱 (sophocarpine) [10] 4 槐定碱 (sophoridine) [10] 5 苦豆碱 (aloperine) [11] 6 莱曼碱 (lehmannine) [12] 7 槐胺碱 (sophoramine) [11] 8 新槐安碱 (neosophoramin) [11] 9 7α-羟基槐胺碱 (7α-hydroxysophoramine) [10] 10 3α-羟基槐定碱 (3α-hydroxy-sophoridine) [11] 11 9α-羟基槐胺碱 (9α-hydroxysophoramine) [10] 12 13,14-去氢槐定碱 ((−)-13,14-dehydrosophoridine) [13] 13 N-羟基槐定碱 (N-hydroxy-sophoridine) [13] 14 12-β羟基槐果碱 (12β-hydroxysophocarpine) [10] 15 9α-羟基苦参碱 (9α-hydroxy-matrine) [13] 16 14-β羟基苦参碱 (14β-hydroxy-matrine) [10] 17 氧化槐定碱 (oxysophoridine) [11] 18 氧化槐果碱 (oxysophocarpine) [11] 19 N-甲基苦豆碱 (N-methyl-aloperine) [11] 20 赝靛叶碱 (baptifoline) [10] 21 臭豆碱 (anagyrine) [11] 22 金雀花碱 (cytisine) [11] 23 甲基金雀花碱 (N-methyl-cytisine) [11] 24 羟乙花碱 (N-2-hydroxyethyl-cytisine) [2] 25 尼古丁 (nicotine) [11] 26 腺荚豆碱 (adenocarpine) [10] 27 三巴豆四胺 (tricrotonytetramine) [13] 
图 1 苦豆子生物碱的化学结构
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黄酮是苦豆子另一主要活性成分。李敏等[14]从新疆苦豆子中分离鉴定出3′，4′-二羟基异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、7，3′-二羟基二氢黄酮-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及芦丁3种成分。卞海涛等[15]从苦豆子中首次分离得到5，6-二羟基-3，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、β-胡萝卜苷、3′-甲氧基木犀草素3种成分。苦豆子黄酮类成分具有抗炎[14]、降血糖[16]、抗病毒和抗菌[17]等药理作用。
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马别厚等[18]采用GC-MS研究苦豆子豆籽油化学成分，分离得到了豆甾醇、麦角甾醇等5种甾体化合物；张建华等[19]从苦豆子中检测出谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、胱氨酸等16种氨基酸。并且苦豆子中谷氨酸可以促进人体内消化液的分泌，具有预防贫血和解毒的作用。除此之外，还有脂肪酸、挥发油、多糖等化学成分，其中，多糖具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性[20-21]。
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病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的传染病，其中，慢性乙型肝炎（CHB）感染是一个非常严峻的世界公共卫生问题，其发病率呈逐年上升趋势。目前，拉米夫定等临床常用药物非但不能彻底清除乙肝病毒（HBV），而且长期使用还会产生明显的耐药问题，难以取得令人满意的治疗效果。近年来，越来越多的研究表明，传统中药苦豆子在抗乙肝药物研究中具有独特优势，从中药宝库中寻找天然抗病毒活性部位或活性成分，已成为发掘新药的重要途径之一。
赵义勇等[17]利用苦豆子总黄酮提取物对鸭乙型肝炎进行治疗，结果发现该提取物在体外能够剂量依赖地抑制细胞内HBV-DNA的表达，表现出较强的体外抗病毒活性；在体内实验中，该提取物可明显降低鸭血清中DHBV-DNA的水平，提示苦豆子总黄酮对鸭乙型肝炎有很好的治疗作用。除此之外，王浩等[22]研究发现，采取拉米夫定联合氧化苦参碱对慢性乙型肝炎患者进行治疗，结果发现患者外周血单核细胞中Toll样受体9（TLR9）信号通路关键分子的mRNA和蛋白表达增加，血清抗病毒细胞因子水平显著升高。该研究提示拉米夫定联合氧化苦参碱能够发挥有效的抗HBV作用，其机制与激活TLR9信号通路、诱导抗病毒细胞因子释放有关。不仅如此，王青等[23]研究还发现氧化苦参碱和阿德福韦酯均可抑制HepG2.2.15细胞HBV-DNA的分泌，抑制乙肝表面抗体HBeAg、HBsAg表达；而氧化苦参碱亦可显著降低HepG2.2.15细胞内HBV rcDNA以及cccDNA的水平，引起pgRNA水平的增加，这些结果提示氧化苦参碱的抗HBV的作用环节可能位于cccDNA转录形成pgRNA之后至子代病毒形成之前，有必要对HBV的复制包装过程进行详细分解做进一步研究。
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非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除酒精和其他明确的损肝因素外所致的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。近年来随着对其发病机制的深入了解，抗NAFLD新药不断发现，科学家从苦豆子中提取的生物碱、黄酮类、酚类等中药成分具有较明确的抗氧化作用，具有毒副作用小等多种独特优势，成为治疗NAFLD的研究热点之一。
宋春艳等[24]利用槐果碱对非酒精性脂肪性肝炎小鼠进行干预，结果发现槐果碱可显著抑制小鼠体内白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达，缓解小鼠非酒精性脂肪性肝炎。该研究提示槐果碱可能通过抑制炎症细胞因子的合成来减轻肝细胞内线粒体的损伤，从而减轻肝细胞的毒性损伤。此外，史丽娟等[25-26]实验研究发现氧化苦参碱可抑制脂质从头合成途径，同时降低了NAFLD大鼠的固醇调节元件结合转录因子1（Srebf1）的mRNA表达，增加过氧化物酶体增殖物激活受体α（Pparα）的mRNA表达。提示氧化苦参碱对NAFLD大鼠肝脏脂肪变性的治疗作用可能与下调Srebf1和上调Pparα介导的代谢途径相关。除了氧化苦参碱，唐彬等[27]通过实验发现苦参碱对NAFLD大鼠同样具有显著疗效，其能够降低高脂饮食大鼠肝组织中三酰甘油、总胆固醇的含量，抑制炎症损伤，降低肝脏环氧化物酶（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达水平。研究结果提示苦参碱对NAFLD大鼠的治疗作用可能与抑制COX-2、iNOS 表达，阻止炎症发生和抗氧化相关。
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肝纤维化是各种病因所致慢性肝损伤的修复反应，其主要特征是细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）在肝内的过度沉积，导致肝脏结构改变和肝功能丧失。目前研究认为，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化是肝纤维化的核心事件，而持续炎症是HSC活化的主要诱因。HSC是肝脏中产生胶原纤维的主要细胞，在肝脏受损时激活，分化成为肌成纤维样细胞，分泌大量细胞因子、趋化因子和生长因子，并产生大量的ECM，从而促进肝纤维化的发生和发展。肝纤维化持续进展会发展为肝硬化甚至肝癌，病死率极高，因此，逆转肝纤维化对于预防肝硬化和肝癌具有重要意义。目前临床上治疗肝纤维化的传统中药包括苦参碱和氧化苦参碱类生物碱。
杨增玺等[28]通过研究发现不同剂量苦参碱作用4周后可减轻CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝脏的纤维化程度，抑制肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润以及胶原纤维沉积。苦参碱可抑制HSC的活化和增殖，减少α-平滑肌激动蛋白的表达，保护肝细胞，同时抑制小鼠肝脏中TGF-β1和血小板衍生生长因子-B（PDGF-B）的表达，从而产生抗肝纤维化作用。此外，闫冰川等[29]研究发现苦参碱联合扁桃苷用药可以改善CCl4肝纤维化模型小鼠的精神、活动、毛色和饮食状况，明显降低小鼠血中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的水平，表明两者联用可以发挥改善肝纤维化的效果。临床研究发现[30]，171位肝炎和肝硬化患者通过静脉注射 400 mg/d苦参素注射液后发现肝纤维化程度降低，表明氧化苦参碱具有逆转肝纤维化作用。除此之外，另一项研究发现氧化苦参碱可降低TGF-β1和TNF-α的水平，抑制HSC的活化，减少ECM的释放，同时增加患者血清中IL-10的水平，进而减轻肝炎症状、改善肝功能，预防肝纤维化[31]。
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肝硬化（liver cirrhosis）是临床常见的慢性进行性肝病，是由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。目前对于肝硬化并没有特效的治疗手段，干扰素α及核苷和核苷酸类抗病毒药物存在应答率低、药物难取得、并发症风险高、耐药和治疗成本高等问题[32]，很难取得良好的治疗效果。药理学研究表明，苦豆子中的生物碱成分可能会对肝硬化起到治疗作用[33]。
毛丽萍等[34]研究发现，乙肝肝硬化患者在经过苦参碱治疗1个月后，其外周血自然杀伤细胞（NK细胞）表面活化性受体NKG2D表达水平有所增加，提示具有免疫调节作用的苦参碱可以上调乙肝肝硬化患者NKG2D的表达水平，从而减少乙肝肝硬化患者发展至肝癌的概率。
此外，祝尔健等[35]通过研究发现，肝硬化患者应用苦参碱治疗8周后，其患者体内ALT、AST、血清总胆红素（TBil）水平均较单纯护肝患者明显降低；苦参碱治疗后患者的HBV-DNA、HBeAg阴转率均高于单纯护肝患者。该研究提示治疗肝硬化过程中，有必要在护肝治疗的同时联用安全、有效的药物苦参碱。
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肝衰竭（hepatic failure）是由多种因素引起的严重肝损伤，临床主要表现为黄疸、凝血功能障碍、肝肾综合征、肝性脑病、腹水等症状。目前治疗肝衰竭的药物有核苷类药物、N-乙酰半胱氨酸、肾上腺皮质激素等[36]。但皮质激素治疗肝衰竭存在不良反应多、药物用量和作用时机难以把握等问题[37]。药物疗效并不理想，因此，肝衰竭治疗药物的研究迫在眉睫，而苦豆子生物碱在肝衰竭防治方面具有开发前景。
张弦等[38]研究发现，氧化苦参碱能够明显改善脂多糖/D-氨基半乳糖（LPS/D-GalN）诱导的大鼠急性肝衰竭肝脏的病变，降低肝脏转氨酶，并通过抑制急性肝衰竭大鼠肝组织TLR4的表达，降低TNF-α、IL-1β和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspases-3）的表达水平以及Bax/Bcl-2的比例，从而产生抑制肝细胞凋亡的作用，保护肝细胞。其另一项研究[39]发现，氧化苦参碱联合复方茵陈颗粒（FYK）预处理可减轻急性肝衰竭大鼠的肝损伤程度，同时降低肝衰竭的发生率。除此之外，向晓星[40]等的研究结果同样证实氧化苦参碱对于肝衰竭具有保护作用。
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据2020年WHO报道，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发病率居全球第6位、病死率居全球第3位。2020年我国发病例数和死亡人数分别多达41万和39万，HCC的发病率约占全球43%，由此看来，我国HCC的病情形势非常严峻。临床上一般采取肝脏切除和移植、局部消融或动脉化疗栓塞等方法治疗[41]。国内外大量研究报道，许多中药成分及天然产物也具有抗肿瘤的作用，其中，苦豆子的生物碱成分便是其中之一。
杨晓娟等[42]将0～4 mg/ml的苦参碱加入到HepG2和BEL-7404肝癌细胞中，结果发现苦参碱能够以时间和浓度依赖性的方式抑制肝癌细胞增殖，并诱导其凋亡。机制研究发现其可能通过激活p38/JNK信号通路，下调抑凋亡基因Bcl-2和上调促凋亡基因Bax及caspases 3的表达来诱导肝癌细胞凋亡。此外，Liu等[43]研究发现苦豆碱能够剂量依赖性地抑制Hep3B和Huh7肝癌细胞的增殖、诱导肝癌细胞凋亡和G2/M细胞周期阻滞。另一项研究报道[44]，0～20 mg/ml槐定碱可通过增强抑癌基因PTEN的表达，抑制PI3K/AKT信号通路的激活，同时增加caspases 3/9）和基质金属蛋白酶3/9（MMP3/9）的蛋白表达，最终抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡。Zhang等[45]报道1000 μmol/L槐果碱能够显著抑制HCC-LM3和MHCC-97H的细胞增殖率，使细胞周期阻滞在G0/G1期。其作用机制是通过抑制AKT/GSK3β/β-catenin轴和TGF-β诱导的肝癌细胞的上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）发挥治疗肝癌的作用。
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近年来，随着新药研发和临床需求的不断扩大，苦豆子作为传统中药，其抗炎、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等药理作用不断被发现。本文就宁夏苦豆子中的主要成分及其在治疗肝脏疾病中的活性作用进行了综述，发现苦豆子在治疗病毒性肝炎、非酒精性肝病、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌等疾病中可能发挥重要作用，其中，苦参碱（斯巴特康）注射液已于临床用于急、慢性肝炎、肝硬化及其他肝胆疾病的治疗。
尽管国内外对苦豆子的研究不断增多，但是关于苦豆子的药物研究和开发仍然存在诸多问题，如黄酮、挥发油类等研究还较少，对苦参碱（素）类药物的临床副反应还不明确，药物和药物之间可能存在的相互作用尚未清楚，对活性成分在不同组织中的分子靶点和作用机制的研究不够深入，对苦豆子药动学的临床研究不够充分等。因此，迫切需要科研力量的投入，系统开展苦豆子基础研究，建立一套以宁夏苦豆子活性成分为主的肝病防治药物创新技术体系和苦豆子产业发展的关键技术体系，为宁夏苦豆子的资源利用和高技术产品开发奠定坚实的技术基础。
Research progresses on the main active components in Ningxia Sophora alopecuroides and the therapeutic activities for liver diseases
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摘要: 苦豆子是豆科槐属植物，为宁夏的道地药材之一。苦豆子有着丰富而复杂的活性成分，主要有生物碱、黄酮、挥发油、甾体、多糖、脂肪酸等。近年来，国内外对苦豆子生物碱开展了大量研究，该类生物碱具有抗肝炎、抗肝纤维化、抗肝硬化、抗肝衰竭、抗肝癌等药理作用，其中，苦参碱相关药物已经获批在临床用于治疗乙型肝炎病毒感染等疾病。鉴于苦豆子在肝脏疾病治疗中的药用价值，对苦豆子主要活性成分进行综述，重点阐述其治疗肝脏疾病的研究进展。Abstract: Sophora alopecuroides, a plant of the family Leguminosae, is one of the Daodi herbs in Ningxia. The active constituents of Sophora alopecuroides are abundant and complex, including alkaloids, flavonoids, volatile oils, steroids, polysaccharides, fatty acids and so on. In recent decades, a great number of domestic and overseas studies have been carried out on Sophora alopecuroides alkaloids, which have anti-hepatitis, anti-liver fibrosis, anti-cirrhosis, anti-liver failure and anti-liver cancer and other pharmacological effects. Clinically, Matrine-related drugs are used to treat hepatitis B virus infection and other diseases. This review aims to summarize the main active ingredients of Sophora alopecuroides, mainly focusing on the research progress in their treatment activities for liver diseases.
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Key words:
- Ningxia Sophora alopecuroides /
- active constituents /
- hepatic disease /
- research progress
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近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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表 1 部分已分离得出的苦豆子生物碱
编号 苦豆子生物碱 文献 1 苦参碱（matrine） [10] 2 氧化苦参碱 (oxymatrine) [11] 3 槐果碱 (sophocarpine) [10] 4 槐定碱 (sophoridine) [10] 5 苦豆碱 (aloperine) [11] 6 莱曼碱 (lehmannine) [12] 7 槐胺碱 (sophoramine) [11] 8 新槐安碱 (neosophoramin) [11] 9 7α-羟基槐胺碱 (7α-hydroxysophoramine) [10] 10 3α-羟基槐定碱 (3α-hydroxy-sophoridine) [11] 11 9α-羟基槐胺碱 (9α-hydroxysophoramine) [10] 12 13,14-去氢槐定碱 ((−)-13,14-dehydrosophoridine) [13] 13 N-羟基槐定碱 (N-hydroxy-sophoridine) [13] 14 12-β羟基槐果碱 (12β-hydroxysophocarpine) [10] 15 9α-羟基苦参碱 (9α-hydroxy-matrine) [13] 16 14-β羟基苦参碱 (14β-hydroxy-matrine) [10] 17 氧化槐定碱 (oxysophoridine) [11] 18 氧化槐果碱 (oxysophocarpine) [11] 19 N-甲基苦豆碱 (N-methyl-aloperine) [11] 20 赝靛叶碱 (baptifoline) [10] 21 臭豆碱 (anagyrine) [11] 22 金雀花碱 (cytisine) [11] 23 甲基金雀花碱 (N-methyl-cytisine) [11] 24 羟乙花碱 (N-2-hydroxyethyl-cytisine) [2] 25 尼古丁 (nicotine) [11] 26 腺荚豆碱 (adenocarpine) [10] 27 三巴豆四胺 (tricrotonytetramine) [13] 
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