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新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎，COVID-19），具有较强的人际传播能力，传播速度快[1-3]。COVID-19患者会出现与流感类似的症状，包括发烧、咳嗽、乏力、腹泻等，重症患者出现呼吸困难或低氧血症，可发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、多器官功能衰竭等导致死亡[4]。中医药早期干预可有效预防病情向重、危重方向恶化[5]。目前，中医药控制COVID-19的疗效普遍受到重视[6]，业界提倡结合不同疾病阶段使用不同的处方[2]。寒湿郁肺汤为武汉火神山医院依据国家卫健委印发的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》所引进的四种肺炎诊疗中药汤剂处方之一，用于新型冠状病毒初期治疗，该汤剂由苍术、陈皮、厚朴、藿香、草果、生麻黄、羌活、生姜共八味中药组方而成。
UHPLC-MS/MS因具有分离能力强，检测限低，高灵敏度，高选择性等特点，易于开发为临床检测项目的参考方法[7]。本研究应用UHPLC-MS/MS法，依照2015版中国药典对寒湿郁肺汤中11种主成分进行含量测定，为后续的质量研究奠定基础。
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Agilent1290超高效液相色谱仪（包括G4220A二元高压泵、G4226A自动进样器、G1330B控温箱、G1316C柱温箱）、Agilent G6460A型三重四极杆串联质谱仪、电喷雾离子源、Mass Hunter化学工作站B.06.00（美国Agilent公司）；BSA124S-CW型天平、CPA225D型天平（德国Sartorius公司）；Mini spin型离心机、移液枪（德国Eppendorf公司）；Labnet VX-200型定时可调速涡旋混合器（美国Labnet公司）；SK7200H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；UNIVERSAL32R型台式冷冻离心机（德国Hettich公司）。
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香草酸（批号：H11J9Z65318）、厚朴酚（批号：Y27J10C91584）、和厚朴酚（批号：T28O6B5149）、汉黄芩素（批号：T11J11R108209）、刺槐素（批号：C12O8Q45551）、6-姜酚（批号：P29O10F101611）、桔皮素（批号：H24F11K108893）、羌活醇（批号：R28M9F57295）、川陈皮素（批号：N10J10R90249）、紫花前胡苷（批号：W07A10Z94862）、利血平（批号：Y02M11Y17235）、橙皮苷（批号：P06D9F77001）均为对照品，纯度均≥97%，购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇（批号：10951907818，质谱级）、乙腈（批号：JA075930，质谱级）购自德国默克公司；甲酸（批号：17033D，分析纯）、乙酸铵（批号：H1709024，色谱纯）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；水为屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司），其余试剂均为分析纯。
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寒湿郁肺汤中苍术（批号：20092108）、陈皮（批号：20010181）、厚朴（批号：20061903）、藿香（批号：20031708）、草果（批号：19092902）、生麻黄（批号：20200301）、羌活（批号：20070709）等中药材均由上海长征医院药材科提供，生姜（批号：19062404）购于广西壮族自治区。
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分别取各对照品适量，精密称定，用甲醇配制成含1.01 mg/ml香草酸、0.99 mg/ml厚朴酚、1.03 mg/ml和厚朴酚、1.00 mg/ml汉黄芩素、1.00 mg/ml刺槐素、1.01 mg/ml 6-姜酚、1.02 mg/ml桔皮素、1.01 mg/ml羌活醇、1.03 mg/ml川陈皮素、1.00 mg/ml紫花前胡苷、1.00 mg/ml利血平（IS）和1.00 mg/ml橙皮苷的对照品溶液，于−20 ℃冰箱保存，备用。
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取寒湿郁肺汤中苍术15 g、陈皮10 g、厚朴10 g、藿香10 g、草果6 g、生麻黄6 g、羌活10 g、生姜10 g，精密称定，置锅中，加水500 ml，浸泡30 min，加热至煮沸后调至文火煎20 min，取药液；第二次加水300 ml，加热至煮沸后调至文火煎20 min，取药液，与第一次药液混匀，取出，放冷。精密量取药液1 ml，加入1 μg/ml的利血平10 μl，涡旋3 min，14 500 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液。
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Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱( 3.5 μm，2.1 mm×150 mm )，流动相为0.2%甲酸水−10 mmol/L醋酸铵溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～0.6 min, 80%～40% A; 0.6～1 min, 40%～30% A; 1～4.3 min, 30%～5% A；流速：0.3 ml/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μl，每个样品的分析周期为4.3 min。
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采用电喷雾离子源（ESI）和多反应监测模式（MRM）。正负离子同时扫描；氮气作为雾化气和干燥气；高纯氮气为碰撞气，毛细管电压为4 000 V；碰撞气压为40 psi；鞘流气温为350 ℃，干燥气温为325 ℃，干燥气流速为12 L/min；将一定浓度的标准溶液和内标溶液进样，在ESI电离方式下进行产物离子全扫描分析（见图1），定量分析质荷比详见表1。
图 1 寒湿郁肺汤中11个主成分及内标的二级产物离子图
表 1 寒湿郁肺汤中11个主成分及内标的质谱检测参数
测定成分 母离子
（m/z）子离子
（m/z）裂解电压
(V)碰撞能量
(V)ESI
模式香草酸 167.1 152.3 70 10 − 厚朴酚 265.1 247 148 29 − 和厚朴酚 265.2 223.4 135 29 − 汉黄芩素 283.1 268.1 105 13 − 刺槐素 284.9 241.9 140 34 − 6-姜酚 293.2 293.2 130 0 − 桔皮素 373.1 343.2 135 28 + 羌活醇 377.3 377.3 130 0 + 川陈皮素 403.3 373.3 130 26 + 紫花前胡苷 409.2 247.2 95 11 + 利血平（IS） 609.2 195 240 35 − 橙皮苷 609.2 300.9 135 15 − -
分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各10 μl，按“2.1.2”项下方法制样，再按照“2.2”项下色谱与质谱条件进样测定，记录图谱。结果显示，专属性符合相关要求（图2）。
图 2 寒湿郁肺汤中11个主成分及内标的MRM色谱图
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精密量取对照品溶液适量，浓度稀释为如下的混合对照品溶液：香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、桔皮素、羌活醇、紫花前胡苷的线性浓度为20、50、100、200、500、1 000、1 500、2 000 ng/ml；6-姜酚、川陈皮素、橙皮苷的线性浓度为200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、15 000、20 000 ng/ml。采用内标定量法按“2.2”项下色谱与质谱条件进行测定，并记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（C），绘制标准曲线，并进行线性回归，结果见表2。
表 2 寒湿郁肺汤中11种成分的线性考察
测定成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 香草酸 Y=9.023C-1.345 0.99 0.02~2.00 厚朴酚 Y=0.023C+0.002 0.99 0.02~2.00 和厚朴酚 Y=0.028C-0.060 0.98 0.02~2.00 汉黄芩素 Y=0.701C+1.802 0.98 0.02~2.00 刺槐素 Y=0.488C+0.205 0.99 0.02~2.00 6-姜酚 Y=0.003C+1.510 0.99 0.20~20.00 桔皮素 Y=4.291C+70.573 0.99 0.02~2.00 羌活醇 Y=0.173C+3.849 0.98 0.02~2.00 川陈皮素 Y=0.576C+277.012 0.99 0.20~20.00 紫花前胡苷 Y=0.362C-0.081 0.99 0.02~2.00 橙皮苷 Y=0.011C+0.061 0.99 0.20~20.00 -
将母液稀释10倍，按“2.2”项下色谱与质谱条件进行测定，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果显示，香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11种成分的峰面积RSD分别为1.83%、5.57%、4.39%、3.14%、4.25%、4.01%、1.26%、1.40%、1.75%、3.29%、2.55%，表明该方法精密度良好。
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取同一份寒湿郁肺汤供试品溶液，按“2.1.2”项下方法平行制备6份，按“2.2”项下色谱与质谱条件进行测定，记录峰面积，计算RSD。结果显示，香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11种化学成分的峰面积RSD分别为4.78%、8.40%、5.55%、3.27%、1.51%、3.30%、1.30%、3.37%、1.21%、1.98%、2.46%，表明该方法重复性良好。
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取同一份供试品溶液，按“2.1.2”项下方法制备，室温放置，按“2.2”项下色谱与质谱条件，分别于0、2、4、6、12、16、24 h进样测定，记录峰面积，计算RSD。结果显示，香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11种化学成分在4 h内的峰面积RSD分别为5.81%、4.68%、3.17%、13.09%、13.20%、8.99%、6.19%、5.19%、4.18%、5.55%、9.47%，表明供试品溶液在室温放置4 h内稳定性良好。
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精密称取已知含量的寒湿郁肺汤样品，加入各对照品适量，平行制备6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱与质谱条件进样测定，进行UHPLC-MS/MS分析，计算各待测物的平均回收率及其RSD。11种待测物：香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷的平均加样回收率分别为111.73%、102.96%、108.94%、102.90%、99.36%、104.83%、100.55%、100.27%、105.49%、96.92%、93.11%，RSD分别为2.44%、2.37%、4.44%、1.92%、4.60%、2.57%、1.79%、2.36%、4.99%、3.08%、3.59%，表明该方法的准确度良好。
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取9批寒湿郁肺汤药材，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱与质谱条件进行测定，计算寒湿郁肺汤9批样本中11种成分：香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷的含量，测定结果为香草酸0.07～0.09 μg/ml、厚朴酚0.06～0.07 μg/ml、和厚朴酚0.26～0.57 μg/ml、汉黄芩素0.07～0.09 μg/ml、刺槐素0.27～0.29 μg/ml、6-姜酚0.55～0.58 μg/ml、桔皮素0.31～0.33 μg/ml、羌活醇0.54～0.58 μg/ml、川陈皮素3.78～3.81 μg/ml、紫花前胡苷0.31～0.33 μg/ml、橙皮苷1.58～1.61 μg/ml。
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在预实验中分别考察了Agilent ZORBAX SB C18（3.5 μm，2.1 mm ×100 mm）、Agilent ZORBAX SB-C18（3.5 μm，2.1 mm×150 mm）、Waters Xbridge®HILIC（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters Atlantis®T3（3 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent Eclipse XDB-C18（3.5 μm，2.1 mm×150 mm）等色谱柱对11个待测成分含量测定的影响，结果显示，当色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（3.5 μm，2.1mm×150 mm）时，11个待测成分及内标的峰形最佳。
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实验中分别考察了水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈、0.15%甲酸水-乙腈、0.2%甲酸水-乙腈、5 mmol/L醋酸铵溶液-乙腈、10 mmol/L醋酸铵水-乙腈、0.2%甲酸-10 mmol/L醋酸铵水溶液-甲醇、0.2%甲酸-10 mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈等流动相对11个成分含量测定的影响，结果显示，此11个待测成分在0.2%甲酸-10 mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈中，采用梯度洗脱，响应与峰形均佳。
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在预实验中分别考察了培美曲塞、利血平、卡马西平三个标准品作为内标时的响应和出峰时间，最终选用了出峰时间居中、响应好、稳定性高的利血平作为内标。本实验中所选取的化学成分以药典为基础，结合文献调研，舍弃挥发油类成分及违禁成分，最终选取了11个能代表药材的化学成分进行研究。
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本研究基于UHPLC-MS/MS同时测定寒湿郁肺汤中11个成分含量的方法，经色谱柱、流动相的优化和全面的方法学考察，成功应用于样品中寒湿郁肺汤11种成分的测定。该法简便可靠，可为寒湿郁肺汤中的成分检测提供一定的方法参考，也为寒湿郁肺汤的质量控制及质量标准研究奠定了基础。
Determination of 11 main components in Hanshi Yufei decoction, a COVID-19 empirical prescription by UHPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立测定寒湿郁肺汤中11个主成分含量的方法。 方法 采用超高效液相色谱串联质谱法（UHPLC-MS/MS），色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（3.5 μm，2.1 mm×150 mm ），流动相为0.2%甲酸-10 mmol/L醋酸铵水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱(0～0.6 min, 80%～40%A; 0.6～1 min, 40%～30%A; 1～4.3 min, 30%～5%A)，流速0.3 ml/min，柱温40 ℃。以利血平为检测内标，采用多反应监测模式同时测定香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11个化学主成分的含量。 结果 寒湿郁肺汤中11个主成分在各自浓度范围内线性关系良好（r>0.98），平均回收率在93.11%～111.73%。 结论 该实验所建立的方法操作简便、重复性好，为寒湿郁肺汤的质量控制提供了实验室依据。 -
关键词:
- 超高效液相色谱串联质谱法 /
- 含量测定 /
- 新型冠状病毒肺炎 /
- 寒湿郁肺汤
Abstract:Objective To establish a method to determine 11 main components in Hanshi yufei decoction. Methods The method adopted UHPLC-MS/MS with an Agilent ZORBAX SB-C18 (3.5 μm, 2.1 mm×150 mm) column. The mobile phase was consisted of 0.2% formic acid plus 10 mmol/L ammonium acetate aqueous solution(A) - acetonitrile(B) and gradient elution (0–0.6 min, 80%–40%A; 0.6–1 min, 40%–30%A; 1–4.3 min, 30%–5%A) at 0.3 ml/min. The column temperature was 40 ℃ and 11 main components including vanillic acid, magnolol, honokiol, wogonin, sophorin, 6-gingerol, citrinin, qianghuo alcohol, nobiletin, nodakenin, and hesperidin were quantified in a multiple reaction monitoring mode. The reserpine was the standard. Results The 11 main components in Hanshi Yufei decoction had a good linear relationship within their concentration range (r>0.98), and the average recovery was 93.11%～111.73%. Conclusion The UHPLC-MS/MS method established in this experiment is easy to operate and has good reproducibility, which provides a laboratory basis for the quality control of Hanshi Yufei decoction. -
Key words:
- UHPLC-MS/MS /
- content determination /
- COVID-19 /
- Hanshi Yufei decoction
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新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是指2019年始发、由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn-drome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的肺炎。截至2020年4月5日，全球共确诊COVID-19患者1 093 349例，死亡58 620例[1]。目前尚无针对COVID-19的特异性治疗药物，一些化学药物包括氯喹/羟氯喹、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦等正在临床开展随机对照研究。临床实践表明，清肺排毒汤和连花清瘟胶囊等多种中药方剂和制剂对COVID-19有良好的治疗效果。据国家卫生健康委员会报道，在我国确诊的COVID-19病例中，有74 187人使用了中医药，占91.5%；中医药能够缓解症状，减少轻型、普通型疾病向重型发展，提高治愈率、降低病死率，总有效率达90%以上[2]。
柴胡达胸合剂，曾用名为“强力肺炎1号”，是国医大师梅国强教授为痰热壅肺证COVID-19患者制定的中药处方[3]。柴胡达胸合剂由小柴胡汤、小陷胸汤、达原饮、止嗽散共同组方，包含柴胡、黄芩、法半夏、全瓜蒌、黄连、枳实、甘草、浙贝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、槟榔、草果、藿香、佩兰、虎杖共十八味中药。由于临床使用疗效显著，2020年2月23日，湖北省药品监督管理局下发制剂备案批件，包括柴胡达胸合剂在内的2个由湖北省中医院研制的医院制剂获批用于防治COVID-19[4]。
网络药理学是基于系统生物学和多向药理学技术和方法，通过构建“药物-基因-疾病”网络，分析药物在网络中与特定节点相互作用的关系，从整体角度探索药物与机体相互作用的一门学科[5]。2007年，Hopkins首次在Nature Biotechnology杂志上发表述评，提出网络药理学这一概念，并认为其为发现新药的新范式[6]。中药通过多成分、多靶点、多通路对疾病产生治疗作用，利用网络药理学方法，可系统阐明中药治疗疾病的药理作用机制[7]。
因此，本研究运用网络药理学方法，筛选柴胡达胸合剂治疗COVID-19的活性成分和作用靶点，构建“药材-活性成分-靶点”网络图，然后对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interac-tion, PPI）、GO基因注释和KEGG信号通路分析，为进一步阐明柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 柴胡达胸合剂药材的性味归经、活性成分和靶点的筛选
通过《中华人民共和国药典》（2015年版）手工检索柴胡达胸合剂的十八味中药材的性味归经，利用Cytoscape 3.7.2软件制作“药材-性味归经”网络图。在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）以柴胡达胸合剂中的十八味中药材名为关键词检索得到所有中药的化学成分。生物利用度（oral bioavailability，OB）和半衰期（half life，HL）是影响药动学的重要参数，而类药性（drug-likeness，DL）可以反映化合物的理化性质与已上市的药物是否类似。根据TCMSP数据库推荐的筛选标准，本研究以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件，筛选得到每味中药材的活性成分。同时，通过 TCMSP 数据库查找各活性成分的作用靶点，归纳整理后利用Uniprot 数据库（
https://www.uniprot.org/ ）标准化靶点名称。1.2 “药材-活性成分-靶点”网络图的构建
以coronavirus为关键词，检索GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）和OMIM（https://omim.org/ ）数据库获得COVID-19潜在相关基因；利用Venn图在线绘制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/ ），将柴胡达胸合剂活性成分的作用靶点和COVID-19相关基因取交集，得到柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点；最后，将得到的药材-活性成分-靶点关联性文本导入Cytoscape 3.7.2软件，构建并分析“药材-活性成分-靶点”网络。1.3 PPI网络构建
将柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点导入STRING 蛋白相互作用数据库（
https://string-db.org/ ），物种选定为Homo sapiens，获得PPI信息并导入Cytoscape 3.7.2软件，利用NetworkAnalyzer功能，分析网络中每个靶点的度值（dgree value），使用R软件Graphics包，绘制条形图展示度值排名前20位的靶点。1.4 GO基因注释和KEGG通路分析
利用R软件的org.Hs.eg.db和clusterProfiler包，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点进行GO基因注释和KEGG通路分析，以P＜0.05进行筛选，得到柴胡达胸合剂对COVID-19发挥治疗作用参与的生物学过程和信号通路，并绘制气泡图展示结果。
2. 结果
2.1 柴胡达胸合剂的药材性味归经
柴胡达胸合剂“药材-性味归经”网络如图1所示，图中节点的大小代表该节点在网络中的度值。由图可知，度值最大的性味归经分别为寒（度值=8）、苦（度值=13）和肺经（度值=14）。
2.2 柴胡达胸合剂的活性成分及其作用靶点
通过TCMSP平台检索到柴胡达胸合剂中的十八味药材共包含1 977个化合物。以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件筛选并去重后，共得到221个活性成分。在TCMSP检索活性成分的作用靶点，并到Uniprot数据库中查找其标准名称，最后共得到259个作用靶点。柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息，结果见表1。
表 1 柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息表中药名称 化合物（个） 活性成分（个） 靶点（个） 柴胡 349 14 165 黄芩 143 32 95 法半夏 116 11 70 全瓜蒌 80 7 8 黄连 48 10 153 枳实 65 14 98 甘草 280 76 198 浙贝母 17 4 29 桔梗 102 7 63 百部 110 18 82 前胡 101 11 157 紫菀 91 13 175 款冬花 148 19 155 槟榔 52 3 10 草果 59 5 136 藿香 94 9 147 佩兰 60 6 73 虎杖 62 8 159 2.3 柴胡达胸合剂治疗 COVID-19的作用靶点
通过检索GeneCards和OMIM数据库，共收集得到COVID-19相关基因352个。将柴胡达胸合剂的作用靶点和COVID-19相关基因取交集制作Venn图，共得到51个交集基因，即柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点（图2）。
2.4 “药材-活性成分-靶点”网络
柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络共包含234个节点（药材节点18个，有效成分节点165个，靶点节点51个）。网络中棱形代表药材节点，倒三角代表有效成分节点，圆形代表靶点节点（图3）。节点的颜色越深或节点图形越大，表明该节点在网络中的度值越高。每一圈的最低点为该圈度值最大的节点，度值沿逆时针方向逐渐减小，且3个有效成分节点圈由外往里节点度值依次减小。网络中化合物节点中位数为4，高于2倍中位数的化合物节点共有12个（表2），这些化合物可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要活性成分。
表 2 高于2倍度值中位数的化合物信息表TCMSP数据库ID 化合物名称 对应药材 度值 MOL000098 槲皮素（quercetin） 草果、柴胡、甘草、虎杖、黄连、藿香、款冬花、前胡、紫菀 46 MOL000006 木犀草素（luteolin） 虎杖、桔梗、佩兰、枳实、紫菀 23 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 柴胡、甘草、款冬花、紫菀 16 MOL000358 β-谷甾醇（beta-sitosterol） 百部、半夏、浙贝母、虎杖、黄芩、款冬花、前胡、紫菀 15 MOL000173 汉黄芩素（wogonin） 黄芩 14 MOL004328 柚皮素（naringenin） 甘草、枳实 13 MOL002714 黄芩素（baicalein） 半夏、黄芩 10 MOL000497 甘草查尔酮A（licochalcone A） 甘草 10 MOL001689 刺槐素（acacetin） 黄芩、桔梗 10 MOL005828 川陈皮素（nobiletin） 枳实 10 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 柴胡、甘草、紫菀 9 MOL005916 葛花苷元（irisolidone） 藿香 9 2.5 PPI网络
在“药材-活性成分-靶点”网络中的靶点节点不包含PPI信息，因此，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19靶点进行PPI分析，结果如图4A所示。图中节点形状越大，表明其度值越高，越可能为柴胡达胸合剂治疗COVID-19的核心作用靶点。对网络中度值前30的节点作条形图，节点度值排名前10的蛋白为CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2 和CCL2（图4B）。
2.6 GO基因注释
GO基因注释将基因的功能分为3个部分：参与的生物学过程（biological process，BP），所处的细胞组分（cellular component，CC），执行的分子功能（molecular function，MF）。对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行GO基因注释，以P＜0.05为条件进行筛选，结果得到GO条目共1 722个，其中BP条目1 612个，CC条目30个，MF条目80个。选取每个部分的前5个条目作气泡图，富集最多基因且P值最小的BP、CC和MF条目分别为脂多糖反应、膜筏和细胞因子受体结合（图5）。
2.7 KEGG信号通路分析
对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行 KEGG 信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路156条，选取富集基因最多的10条通路作气泡图。排名前5的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎（图6）。
3. 讨论
COVID-19隶属于中医的“温疫”、“疫病”范畴，病因为感受“异气”、“疠气”，疠气夹湿，病位在肺、脾[3]。柴胡达胸合剂用于痰热壅肺证患者，其病因为痰热互结，壅闭于肺，致使肺失宣降而表现的肺经实热证候。本研究首先对柴胡达胸合剂的十八味中药材进行性味归经的网络分析，结果发现柴胡达胸合剂组方的性味以“苦寒”最多且主归肺经。“苦寒”药能清热泻火，消除热症，多用于具有实热特征病证[8]。因此，柴胡达胸合剂与COVID-19的病机、病位相符。
利用中药、疾病相关数据库，本研究筛选出柴胡达胸合剂治疗COVID-19的165个活性成分和51个作用靶点，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19具有多成分、多靶点的特点。通过构建和分析“药材-活性成分-靶点”网络图，发现网络中度值较高的12个活性成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺槐素、川陈皮素、异鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外，其余11个成分均属于黄酮类化合物。
黄酮类化合物广泛存在于自然界的多种植物中，具有包括抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理作用[9]。黄酮类化合物还有良好的抗病毒作用，对流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒等都有抑制作用[10]。体外实验研究表明，槲皮素和木犀草素均能够抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性，对SARS-CoV 产生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2与SARS-CoV基因序列有约80%同源性，两者3CL蛋白酶结构有相似性[14]。此外，分子对接结果发现山柰酚、槲皮素、 黄芩素、 木犀草素、 汉黄芩素、β-谷甾醇与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶均有较高的结合活性[15]。因此，通过直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制之一。
通过分析PPI网络发现，CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2、CCL2等在网络中有较高的度值。CASP3基因编码的caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，研究发现caspase-3蛋白在SARS-CoV病毒引起的组织细胞凋亡过程中发挥了重要作用[16]。MAPK基因编码的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物学过程。此外，炎症因子风暴被认为是重症COVID-19患者组织损伤的病理机制之一。SARS-CoV-2病毒在体内激活T细胞，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6等细胞因子，随后GM-CSF会进一步激活CD14+CD16+炎性单核细胞，进一步升高IL-6等炎性因子，形成炎症因子风暴，导致严重的肺部和其他器官免疫损伤[17]。细胞因子根据其在炎性反应中的作用不同可分为促炎性细胞因子（如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等）和抑炎性细胞因子（如 IL-4、IL-10 等）两类。SARS患者的肺部炎症和肺损伤与患者血浆中的IL-1B、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子水平升高引起炎症因子风暴有关[18]。同样地，COVID-19患者血浆IL-1B、IFN-γ、CXC趋化因子-10（CXCL-10）等促炎性细胞因子水平也升高[19]。本研究中，IL-6、IL-10和IL-1B均为核心作用靶点。因此，减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平可能也是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制。
对靶点进行GO基因注释的结果表明，柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要生物学过程为脂多糖反应、对源于细菌的分子的反应和氧化应激反应等。脂多糖是G-菌细胞壁的组成成分，可诱导细胞产生炎性反应，其中促炎性细胞因子发挥了重要介导作用。IL-6可促进B细胞分化，并活化MAPK，激活STAT转录因子，从而加重炎性反应[20]。KEGG分析富集到156条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19多通路的特点。
综上所述，本研究采用网络药理学方法，初步揭示了柴胡达胸合剂可能一方面通过多种黄酮类化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，另一方面通过多成分、多靶点、多通路减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平，从而对COVID-19产生治疗作用。
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表 1 寒湿郁肺汤中11个主成分及内标的质谱检测参数
测定成分 母离子
（m/z）子离子
（m/z）裂解电压
(V)碰撞能量
(V)ESI
模式香草酸 167.1 152.3 70 10 − 厚朴酚 265.1 247 148 29 − 和厚朴酚 265.2 223.4 135 29 − 汉黄芩素 283.1 268.1 105 13 − 刺槐素 284.9 241.9 140 34 − 6-姜酚 293.2 293.2 130 0 − 桔皮素 373.1 343.2 135 28 + 羌活醇 377.3 377.3 130 0 + 川陈皮素 403.3 373.3 130 26 + 紫花前胡苷 409.2 247.2 95 11 + 利血平（IS） 609.2 195 240 35 − 橙皮苷 609.2 300.9 135 15 − 
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表 2 寒湿郁肺汤中11种成分的线性考察
测定成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 香草酸 Y=9.023C-1.345 0.99 0.02~2.00 厚朴酚 Y=0.023C+0.002 0.99 0.02~2.00 和厚朴酚 Y=0.028C-0.060 0.98 0.02~2.00 汉黄芩素 Y=0.701C+1.802 0.98 0.02~2.00 刺槐素 Y=0.488C+0.205 0.99 0.02~2.00 6-姜酚 Y=0.003C+1.510 0.99 0.20~20.00 桔皮素 Y=4.291C+70.573 0.99 0.02~2.00 羌活醇 Y=0.173C+3.849 0.98 0.02~2.00 川陈皮素 Y=0.576C+277.012 0.99 0.20~20.00 紫花前胡苷 Y=0.362C-0.081 0.99 0.02~2.00 橙皮苷 Y=0.011C+0.061 0.99 0.20~20.00
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