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患者，女性，23岁，身高162 cm，体重75 kg，BMI 28.6 Kg/m2，肥胖，因“下肢疼痛，抬腿有沉重、酸胀感，肿痛2 d余”，于2017年3月20日来我院心内科就诊。患者自述：2016年11月因月经功能紊乱，服用屈螺酮/炔雌醇片，1片po qd；复方玄驹胶囊，1.26 g po tid；以及维生素C片和维生素E胶囊。服用近4个月后，月经基本正常，性激素六项指标：睾酮、雌二醇、孕酮、促卵泡成熟素、促黄体生成素、垂体泌乳素均在正常范围内。否认吸烟、饮酒史，否认食物、药物过敏史。查体：T 36.7 ℃、P 65次/min、R16次/min、BP 120/68 mmHg；双侧颈静脉充盈，双侧甲状腺未及肿大；双肺听诊呼吸音粗，右侧肺可闻及哮鸣音，左下肺可闻及湿罗音；双下肢中度凹陷性水肿。下肢静脉B超显示：下肢深静脉血栓。凝血功能显示：凝血酶原时间（PT）10.8 s、凝血酶原时间活动度101.3%、凝血酶原时间比值（PTR）0.92、国际标准化比值(INR) 0.96、纤维蛋白原1.98 g/L、纤维蛋白降解产物2.2 µg/ml。诊断：①下肢静脉血栓；②月经功能紊乱。
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2016年11月27日，由于“月经周期和出血量异常，伴月经周期前后出现腹痛”，诊断为月经功能紊乱。给予屈螺酮/炔雌醇×21片，1片po qd；复方玄驹胶囊0.42 g×180粒，1.68 g po tid；维生素C片，0.1 g po tid；维生素E软胶囊×30丸，0.1 g po qd。12月4日至2017年3月18日，给予雌二醇/雌二醇地屈孕酮×28片（前14 d服用雌二醇2 mg，后14 d口服雌二醇地屈孕酮片），1片po qd；复方玄驹胶囊0.42 g×180粒，1.68 g po tid。3月18日，患者出现下肢肿胀伴有轻度疼痛症状，3月20日至我院心内科门诊就诊，诊断为下肢静脉血栓。给予华法林钠片5 mg po qd；比索洛尔片5 mg po qd。3月27日，门诊复查凝血功能：凝血酶原时间11.7 s，PT活动度101.3%，PTR值0.98，国际标准化比值INR 1.01，纤维蛋白原2.02 g/L，纤维蛋白降解产物1.8 µg/ml。继续给予华法林钠2.5 mg po qd；比索洛尔片5 mg po qd。4月24日，复查凝血功能：凝血酶原时间19 s，PT活动度37.3%，PTR值1.58，国际标准化比值INR 1.61，纤维蛋白原2.26 g/L，纤维蛋白降解产物1.3 µg/ml。继续给予华法林钠2.5 mg po qd，随访患者3个月，下肢静脉血栓好转。
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根据caprini评分标准，该患者为静脉血栓(VTE)高危人群。患者此次因下肢疼痛合并水肿来我院就诊，确诊为下肢深静脉血栓，深静脉血栓(DVT)发生风险与多种因素关，包括高龄、高血压、肥胖、妊娠或产后、凝血因子基因变、静脉血栓家族和个人史、使用雌激素和孕激素等[1]。患者具有深静脉血栓的高危因素：口服屈螺酮/炔雌醇21 d、雌二醇/雌二醇地屈孕酮治疗近4个月余、肥胖（BMI 28.6）、父亲有肺栓病史、口服激素治疗病史。Caprini评估量表将患者分为极低危（0分）、低危（1～2分）、中危（3～4分）、高危（5～8分）、极高危（9分）5个等级，该患者Caprini评分为5分，属于VTE的高危人群。
流行病学数据显示：静脉血栓在20岁左右非孕期女性及20～40岁女性的发生率分别为0.01%和0.05%，在口服避孕药女性的发生率为0.04%～0.12%[2]。临床药师考虑雌二醇/雌二醇地屈孕酮导致该患者下肢静脉血栓的可能性较大。目前全球约有10亿女性患者口服复方口服避孕药（COC）。COC的主要药物是乙烯基雌二醇，由于它能减缓肝脏代谢，促进其在体内蓄积，最终导致抑制纤维蛋白溶解和血栓行程，因此，COC的使用增加了VTE的风险。2019年美国伊立诺伊州芝加哥拉什大学医学中心的学者，发表了口服避孕药是否为深静脉血栓和肺栓形成的危险因素的队列研究[2]。研究对象为2007—2016年国家医保数据库中577727例关节镜肩部手术患者，分别对26365例关节镜手术服用、不服用COC女性患者的VTE发生率分析，结果显示：男性和女性患者行关节镜肩部手术，女性患者服用和不服用COC的VTE发生率无显著差别，高血压和肥胖是VTE的独立危险因素。Ibrahim对苏丹136名女性下肢深静脉血栓形成的遗传和获得性危险因素进行分析，结果发现18～45岁女性发生DVT的危险因素主要为怀孕与口服避孕药的使用[3]。66～90岁的女性患者发生DVT的危险因素主要为制动、心脏病和既往DVT病史。该患者肥胖，口服COC、家族有肺栓病史，显然具有发生深静脉血栓的高危因素。
该患者是VTE高危人群，在2016年口服雌二醇/雌二醇地屈孕酮时，也许应对其进行门诊筛查、评估危险因素并进行必要的防治。下肢静脉血栓的发生与雌激素含量、孕激素种类相关。目前，常用的COC由雌激素与孕激素配伍而成。静脉血栓一般发生在COC开始使用1～2年内。停药后VTE风险约为未服用者的4倍。COC中雌激素<50 µg时VTE风险明显降低。第三代COC致VTE风险通常高于第二代。导致VTE的机制可能是与其雌激素促进纤维蛋白原活化/增高凝血酶原水平和增强凝血功能有关[4]。1961年至今COC和VTE风险的关系研究了近60年。研究发现口服避孕药与静脉血栓存在关联，并与雌激素含量、孕激素种类有关。雌二醇/雌二醇地屈孕酮为雌孕激素组成的复方制剂，含雌二醇4 mg，地屈孕酮片10 mg；屈螺酮/炔雌醇片为复方口服避孕药，含屈螺酮3 mg、炔雌醇0.03 mg。众所周知，雌激素避孕药会增加VTE风险。COC不同配方与VTE风险不同：与不口服COC患者相比，血栓风险不同，全球首个COC-Enovid被美国FDA批准上市已有50多年，现已发展到第三代。第一代孕激素有较强的雄激素现临床应用较少；第二代避孕抑制排卵作用较强；第三代与第二代相比其抑制排卵的作用更强，且几乎无雄激素作用。新型孕激素有类似于天然孕酮的生理活性，并具有抗雄激素的作用，有些还具有抗盐皮质激素的作用。
雌二醇/雌二醇地屈孕酮导致的下肢静脉血栓的作用机制主要为血管内皮细胞损伤、血液成分改变和血流动力学异常。该患者系VTE的高危人群，因在门诊问诊时间有限，患者未曾提及血栓家族史，应首选不易引起血栓事件的药物，如乌鸡白凤丸、逍遥丸、当归丸、七制香附丸等。特殊情况如无替代治疗药物应尽量缩短疗程、减少联合用药，并定期监测D-二聚体水平。一旦发生药源性血栓栓塞事件，应立即停用药物。对于深静脉血栓形成可采用普通肝素、低分子肝素、磺达肝葵钠、华法林钠。研究表明选用低分子肝素抗凝治疗3～6个月效果优于华法林[5]。应用肝素后一旦出现肝素诱导的血小板减少（HITT）须立即停药，肾功能正常患者可使用阿加曲班、重组水蛭素或达那肝素钠治疗；伴有肾功能不全的可用阿加曲班治疗。根据该案例，临床药师建议：在对女性患者服用雌二醇/雌二醇地屈孕酮前，行DVT风险评估；必要时对VTE家族史、曾经患有VTE和(或)有不良孕产史、肥胖等患者，在服用COC前，进行凝血系统遗传易感性检测，以确定是否携带VTE易患因素，在用药过程定期检测评估，做到事前、事中动态干预避免不良事件的发生；对于门诊患者而言，可持续的药师门诊服务的作用不可或缺。
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关键词:
- 下肢静脉血栓 /
- 雌孕激素复方制剂 /
- 复方口服避孕药 /
- 屈螺酮/炔雌醇 /
- 雌二醇/雌二醇地屈孕酮
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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