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玄参别名元参、黑参、浙玄参等，为我国传统大宗药材，主产地为浙江、安徽、四川、贵州等地[1-2]。玄参，始载于《神农本草经》，被列为中品，味甘、苦、咸，性微寒[3]；归肺、胃、肾经，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效，常用于热病伤阴，舌绛烦渴，津伤便秘、目赤、咽痛等症[4-5]。环烯醚萜苷类是玄参的主要有效成分，包括哈巴苷、哈巴俄苷等，临床上主要用于脑缺血、高血压、糖尿病等疾病，具有抗炎、保护心血管、抗肿瘤、免疫调节等作用[6-9]。
关于不同产地玄参有效成分含量测定的报道较少，仅有的报道也只集中在少数产地[10-11]。玄参药材原植物生长环境差别大，不同的生境因子下药材质量参差不齐，且在栽培过程中，栽培品系繁多混杂，严重阻碍了玄参产业的可持续发展。2020版《中国药典》规定将哈巴苷、哈巴俄苷作为玄参药材的质控成分，现代药理学研究也表明哈巴苷、哈巴俄苷具有保护心血管、保护神经的药理作用[12-13]。因此，课题组以哈巴苷和哈巴俄苷成分为指标性成分，收集全国玄参15个主产区玄参种质资源，建立HPLC法对其进行含量测定，分析不同产地玄参环烯醚萜苷类成分之间的差异性，以期为玄参药材质量控制提供理论依据。
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2019年11月至2019年12月，收集浙江磐安、安徽谯城区、贵州阳溪、河南朱庄、四川陇东等15个产地新鲜玄参种质资源，经浙江中医药大学药学教研室秦路平教授鉴定为玄参科植物玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根，信息见表1。
表 1 不同产地玄参样品信息
编号 产地 经度(°) 纬度(°) 海拔（l/m） 降雨量（l/mm） 年平均温度（t/℃） S1 浙江磐安 120.43 29.05 1020 1440.1 17.4 S2 浙江临安 119.72 30.23 1050 1463.3 16.2 S3 杭州植物园 120.13 30.27 25 1400.3 16.1 S4 安徽涡阳 116.22 33.52 40 809.8 15.1 S5 安徽谯城区 115.77 33.88 35 805.0 14.5 S6 安徽利辛 116.20 33.15 22 823.9 14.8 S7 河南太丘 116.13 33.93 32 740.5 14.3 S8 河南南丰 115.20 33.65 34 738.6 14.6 S9 河南朱庄 114.51 33.01 33 740.5 14.3 S10 四川陇东 102.71 30.48 1428 1000.0 12.6 S11 四川永富 102.65 30.55 1456 984.6 13.4 S12 四川五龙 102.77 30.40 1410 993.4 12.5 S13 贵州洛龙 107.71 29.06 832 1170.4 22.1 S14 贵州阳溪 107.57 29.07 1300 1100.3 16.3 S15 贵州玉溪 107.36 29.05 1324 1070.3 15.6 -
Waters Alliance e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司）；ZORBAX Eclipse C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；XS105型电子分析天平（梅特勒-多利多公司）；超纯水仪（美国Millipore公司）；DXF–60D型中药打粉机（广州市大祥电子机械设备有限公司）；KQ–300DV型超声波（广州颖汉科技有限公司）；DHG–9031A型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信试验仪器有限公司）。哈巴苷（B20481）、哈巴俄苷（B20480）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司。乙腈（色谱级，美国天地公司），磷酸（色谱级，上海阿拉丁公司），其余试剂均为分析纯。
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ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）–0.03%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（1～10 min，3%～10% A；10～20 min，10%～33% A；20～25 min，33%～50% A；25～30 min，50%～80% A；30～35 min，80% A；35～37 min，80%～3% A；37～42 min，3% A）；体积流量1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量为10 μl；检测波长为210、280 nm。色谱图见图1。
图 1 玄参中哈巴苷和哈巴俄苷的色谱图
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精密称取哈巴苷、哈巴俄苷对照品适量，用30%甲醇溶液制备成终质量浓度为每1 ml含哈巴苷0.6 mg、哈巴俄苷0.2 mg的混合对照品溶液，于4 ℃冰箱中保存备用。分别精密吸取哈巴苷、哈巴俄苷混合对照品溶液0.34、0.67、1.00、1.40、1.70 ml置于2 ml容量瓶中，30%甲醇溶液定容至2 ml，吸取上述溶液适量，0.45 μm微孔滤膜过滤，按“1.3.1”项下色谱条件依次进样。哈巴苷的检测波长为210 nm，哈巴俄苷的检测波长为280 nm。以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知哈巴苷与哈巴俄苷在各自范围内线性关系良好。
表 2 线性关系考察
成分 回归方程 线性范围 r 哈巴苷 Y=2964.3X+5156.4 0.1020～0.5100 mg/ml 0.9999 哈巴俄苷 Y=13919X+366.1 0.0340～0.1700 mg/ml 0.9999 -
将洗净后的玄参根切片，置于60 ℃烘箱中烘至恒定质量，粉碎后过3号筛。精密称取玄参根样品粉末0.25 g，置于25 ml具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 ml，密塞，称定重量，浸泡1 h，超声处理45 min（300 W, 40 kHz），放冷，再称定重量，用50%甲醇溶液补足损失的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。按“1.3.1”项下色谱条件平行测定3次。
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精密吸取哈巴苷、哈巴俄苷对照品溶液适量，按“1.3.1”项下色谱条件依次进样6次，测得哈巴苷、哈巴俄苷峰面积RSD分别为0.11%、0.09%，表明仪器精密度良好。
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取浙江磐安样品，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h，按“1.3.1”项下色谱条件进样，测得哈巴苷、哈巴俄苷峰面积RSD分别为0.24%、0.17%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
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取浙江磐安样品6份，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样，测得哈巴苷、哈巴俄苷含量的RSD分别为0.59%、0.50%，表明该方法重复性良好。
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取含量已知的浙江磐安样品，精密称定0.125 g, 加入哈巴苷、哈巴俄苷对照品适量，按“1.3.3”项下方法制备成供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样，计算回收率，结果见表3。
表 3 加样回收率试验结果（n=6）
成分 称样量（m/g） 原有量（m /mg） 加入量（m /mg） 测得量（m /mg） 回收率（%） 平均回收率（RSD）（%） 哈巴苷 0.1251 0.0748 0.0748 0.1478 0.9759 97.44（0.93） 0.1250 0.0748 0.0748 0.1476 0.9733 0.1251 0.0748 0.0748 0.1486 0.9866 0.1254 0.0750 0.0750 0.1482 0.9760 0.1253 0.0749 0.0749 0.1480 0.9760 0.1251 0.0748 0.0748 0.1465 0.9586 哈巴俄苷 0.1250 0.1065 0.1065 0.2093 0.9653 97.08（1.24） 0.1254 0.1068 0.1068 0.2126 0.9906 0.1252 0.1067 0.1068 0.2089 0.9569 0.1251 0.1066 0.1068 0.2109 0.9766 0.1253 0.1068 0.1068 0.2096 0.9625 0.1251 0.1066 0.1068 0.2105 0.9728 -
应用SPSS 19.0软件处理数据。方差分析采用单因素ANOVA分析，聚类分析采用组间连接法[14]。
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15个产地间玄参根中哈巴苷、哈巴俄苷的含量存在统计学差异（P<0.01），结果见表4。哈巴苷、哈巴俄苷含量以及两者总量分别为0.791、0.228、1.265 mg/g。四川陇东产哈巴苷含量最高、安徽谯城区含量最低；浙江磐安产哈巴俄苷含量最高，四川永富含量最低；四川陇东产哈巴苷与哈巴俄苷总量最高，杭州植物园最低,含量范围在0.752～1.529 mg/g之间，均符合《中国药典》2020版质量标准。
表 4 不同产地间玄参样品中各成分含量测定结果（
$\bar x \pm s$ ，n=3，mg/g）样品 哈巴苷含量 哈巴俄苷含量 哈巴苷与哈巴俄苷总量 S1 0.598±0.003 0.852±0.003 1.450±0.006 S2 0.979±0.002 0.520±0.004 1.499±0.006 S3 0.600±0.007 0.152±0.009 0.752±0.013 S4 0.625±0.003 0.542±0.003 1.167±0.004 S5 0.489±0.002 0.831±0.008 1.320±0.009 S6 0.558±0.003 0.615±0.006 1.173±0.009 S7 0.730±0.021 0.626±0.017 1.355±0.038 S8 0.921±0.007 0.563±0.006 1.484±0.002 S9 0.642±0.004 0.655±0.004 1.297±0.008 S10 1.147±0.006 0.382±0.002 1.529±0.008 S11 0.992±0.016 0.036±0.002 1.029±0.017 S12 0.560±0.002 0.422±0.001 0.983±0.002 S13 0.759±0.006 0.385±0.005 1.144±0.009 S14 1.120±0.009 0.234±0.015 1.355±0.024 S15 1.140±0.007 0.297±0.294 1.434±0.010 均值 0.791** 0.228** 1.265** **P<0.01，表示不同产地的哈巴苷或哈巴俄苷含量存在极显著差异。 -
对不同产地之间中的有效成分与生境因子进行相关性分析，结果如表5所示，哈巴苷与海拔、降雨量、年平均温度呈正相关关系，与海拔正相关系数最高为（0.440）；与经度、纬度之间呈负相关关系，与经度负相关系数最高为（–0.419）。哈巴俄苷与经度、纬度呈正相关，与海拔、降雨量、年平均温度呈负相关，与海拔负相关系数最高为（–0.360）。
表 5 玄参中哈巴苷、哈巴俄苷含有量与生境因子相关性分析
项目 哈巴苷 哈巴
俄苷经度 纬度 海拔 年降
雨量年平均
温度哈巴苷 1.000 哈巴俄苷 −0.553 1.000 经度 −0.419 0.572 1.000 纬度 −0.341 0.506 0.370 1.000 海拔 0.440 −0.360 −0.620* −0.768** 1.000 年降雨量 0.098 −0.243 0.184 −0.795** 0.508 1.000 年平均温度 0.079 −0.237 −0.005 −0.507 0.009 0.363 1.000 *P<0.05，表示显著相关；**P<0.01，表示极显著相关。 -
以哈巴苷、哈巴俄苷含量以及两者总量为参考指标，对15个产地玄参进行聚类分析，根据欧式距离D2=19.98将不同产地划分为3个类群，如图2所示。类群I共5个产地，分别为浙江临安，河南南丰，贵州阳溪、玉溪，四川陇东，该类玄参中哈巴苷含量、哈巴苷和哈巴俄苷总量最高；类群II有8个产地、分别为贵州洛龙，四川五龙，安徽利辛、谯城区、涡阳，浙江磐安，河南太丘、朱庄，这些产地哈巴俄苷含量次之；类群III共有2个产地，分别是四川永富和杭州植物园，这两个产地的哈巴俄苷含量、哈巴苷和哈巴俄苷总量最低。
图 2 15批玄参样品聚类树状图
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本试验采用高效液相法测定玄参哈巴苷与哈巴俄苷含量，经PDA检测器对哈巴苷和哈巴俄苷标准品溶液进行波长扫描，结果显示，哈巴苷的最大检测波长是210 nm，与溶剂甲醇的吸收波长一致，此处会有溶剂峰的出现，而哈巴俄苷的最大检测波长是280 nm，此时基线平稳，未与溶剂峰相重叠，因此，确定检测波长为210 nm和280 nm；采用2020版《中国药典》中哈巴苷与哈巴俄苷的含量测定的提取方法及流动相，结果显示，提取、分离效果良好，哈巴苷与哈巴俄苷在甲醇中超声处理45 min即可提取完全，各峰之间的分离度>1.5，理论塔板数>5000，哈巴苷与哈巴俄苷的保留时间分别是10.107、24.116 min。
药用植物的生长环境对次生代谢产物的积累起着非常关键的作用，包括经纬度、海拔、降雨量等[14]。本实验结果显示，15个产地玄参根中哈巴苷、哈巴俄苷的含量存在统计学差异（P<0.01），其中四川陇东、河南南丰、浙江临安、磐安含量最高；海拔、降雨量、年平均温度与哈巴苷之间呈正相关，与哈巴俄苷呈负相关。课题组发现，浙江临安、磐安的海拔分别是1050 m、1020 m，远高于杭州植物园的25 m，因此，临安、磐安哈巴苷的含量要高于植物园，这与实验结果一致；经纬度与哈巴俄苷呈正相关，且相关系数较大，经纬度越高，哈巴俄苷的含量就越大，四川陇东、永富、五龙的经纬度低于安徽利辛、涡阳、谯城区，因此，前者的哈巴俄苷的含量低于后者。结果显示，经纬度越高越有利于哈巴俄苷的积累，降雨量越大，海拔越高，越有利于哈巴苷的积累，故可优先在拥有上述环境条件的种质中选择。本实验只对玄参中哈巴苷、哈巴俄苷的含量进行测定，下一步将继续增加其他活性成分的含量测定，为玄参的质量控制提供参考依据。
Determination of harpagide and harpagoside contents in Scrophularia ningpoensis from 15 origins
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摘要:
目的 建立HPLC法同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷的含量。 方法 采用HPLC-PDA法测定，固定相采用Eclipse Plus C18色谱柱，以乙腈–0.03%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱；体积流量1.0 ml/min；检测波长210、280 nm。 结果 哈巴苷、哈巴俄苷分别在0.1020～0.5100 mg/ml（r=0.9999）、0.0340～0.1700 mg/ml（r=0.9999）范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为97.44%、97.08%，RSD分别为0.93%、1.24%。不同产地之间哈巴苷与哈巴俄苷含量差异大（P<0.01），其中、四川陇东、浙江临安、磐安、河南南丰含量较高。 结论 该方法稳定准确，重复性好，可用于玄参的质量控制。 Abstract:Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of harpagide and harpagoside content in Scrophularia ningpoensis (SN). Methods An Eclipse C18 column was used for determination of methanol extract of S. ningpoensis with a HPLC-PDA method and mobile phase of acetonitrile-0.03% phosphate solution in a gradient elution manner. The flow rate of mobile phase was 1.0 ml/min, and the detection wavelengths were 210 nm and 280 nm. Results Harpagide and harpagoside contents in SN showed good linear relationships within 0.1020-0.5100 mg/ml (r=0.9999) and 0.0340-0.1700 mg/ml (r=0.9999). Their average recovery rates were 97.44% and 97.08%.The RSDs were 0.93% and 1.24%.. There were significant differences in the contents of harpagide and harpagoside in SN from 15 origins (P<0.01). The content of harpagoside in Sichuan Long-dong, Zhejiang Lin-an, Zhejiang Pan-an and Henan Nan-feng is higher. Conclusion This method is stable, accurate and reproducible and can be used for the quality control of SN. -
Key words:
- Scrophularia ningpoensis /
- Harpagide /
- Harpagoside /
- HPLC
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流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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图 1 玄参中哈巴苷和哈巴俄苷的色谱图
A.对照品（210 nm）；B.对照品（280 nm）；C.供试品（210 nm）；D供试品（280 nm）；1. 哈巴苷；2. 哈巴俄苷。
表 1 不同产地玄参样品信息
编号 产地 经度(°) 纬度(°) 海拔（l/m） 降雨量（l/mm） 年平均温度（t/℃） S1 浙江磐安 120.43 29.05 1020 1440.1 17.4 S2 浙江临安 119.72 30.23 1050 1463.3 16.2 S3 杭州植物园 120.13 30.27 25 1400.3 16.1 S4 安徽涡阳 116.22 33.52 40 809.8 15.1 S5 安徽谯城区 115.77 33.88 35 805.0 14.5 S6 安徽利辛 116.20 33.15 22 823.9 14.8 S7 河南太丘 116.13 33.93 32 740.5 14.3 S8 河南南丰 115.20 33.65 34 738.6 14.6 S9 河南朱庄 114.51 33.01 33 740.5 14.3 S10 四川陇东 102.71 30.48 1428 1000.0 12.6 S11 四川永富 102.65 30.55 1456 984.6 13.4 S12 四川五龙 102.77 30.40 1410 993.4 12.5 S13 贵州洛龙 107.71 29.06 832 1170.4 22.1 S14 贵州阳溪 107.57 29.07 1300 1100.3 16.3 S15 贵州玉溪 107.36 29.05 1324 1070.3 15.6 
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表 2 线性关系考察
成分 回归方程 线性范围 r 哈巴苷 Y=2964.3X+5156.4 0.1020～0.5100 mg/ml 0.9999 哈巴俄苷 Y=13919X+366.1 0.0340～0.1700 mg/ml 0.9999
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表 3 加样回收率试验结果（n=6）
成分 称样量（m/g） 原有量（m /mg） 加入量（m /mg） 测得量（m /mg） 回收率（%） 平均回收率（RSD）（%） 哈巴苷 0.1251 0.0748 0.0748 0.1478 0.9759 97.44（0.93） 0.1250 0.0748 0.0748 0.1476 0.9733 0.1251 0.0748 0.0748 0.1486 0.9866 0.1254 0.0750 0.0750 0.1482 0.9760 0.1253 0.0749 0.0749 0.1480 0.9760 0.1251 0.0748 0.0748 0.1465 0.9586 哈巴俄苷 0.1250 0.1065 0.1065 0.2093 0.9653 97.08（1.24） 0.1254 0.1068 0.1068 0.2126 0.9906 0.1252 0.1067 0.1068 0.2089 0.9569 0.1251 0.1066 0.1068 0.2109 0.9766 0.1253 0.1068 0.1068 0.2096 0.9625 0.1251 0.1066 0.1068 0.2105 0.9728
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表 4 不同产地间玄参样品中各成分含量测定结果（
$\bar x \pm s$ ，n=3，mg/g）样品 哈巴苷含量 哈巴俄苷含量 哈巴苷与哈巴俄苷总量 S1 0.598±0.003 0.852±0.003 1.450±0.006 S2 0.979±0.002 0.520±0.004 1.499±0.006 S3 0.600±0.007 0.152±0.009 0.752±0.013 S4 0.625±0.003 0.542±0.003 1.167±0.004 S5 0.489±0.002 0.831±0.008 1.320±0.009 S6 0.558±0.003 0.615±0.006 1.173±0.009 S7 0.730±0.021 0.626±0.017 1.355±0.038 S8 0.921±0.007 0.563±0.006 1.484±0.002 S9 0.642±0.004 0.655±0.004 1.297±0.008 S10 1.147±0.006 0.382±0.002 1.529±0.008 S11 0.992±0.016 0.036±0.002 1.029±0.017 S12 0.560±0.002 0.422±0.001 0.983±0.002 S13 0.759±0.006 0.385±0.005 1.144±0.009 S14 1.120±0.009 0.234±0.015 1.355±0.024 S15 1.140±0.007 0.297±0.294 1.434±0.010 均值 0.791** 0.228** 1.265** **P<0.01，表示不同产地的哈巴苷或哈巴俄苷含量存在极显著差异。
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表 5 玄参中哈巴苷、哈巴俄苷含有量与生境因子相关性分析
项目 哈巴苷 哈巴
俄苷经度 纬度 海拔 年降
雨量年平均
温度哈巴苷 1.000 哈巴俄苷 −0.553 1.000 经度 −0.419 0.572 1.000 纬度 −0.341 0.506 0.370 1.000 海拔 0.440 −0.360 −0.620* −0.768** 1.000 年降雨量 0.098 −0.243 0.184 −0.795** 0.508 1.000 年平均温度 0.079 −0.237 −0.005 −0.507 0.009 0.363 1.000 *P<0.05，表示显著相关；**P<0.01，表示极显著相关。
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