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盐酸安罗替尼（AL3818）商品名福可维，是我国自主研发的1.1类新药。安罗替尼是一种以血管内皮生长因子受体（VEGFR）、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生生长因子（PDGFR）、干细胞因子（c-kit）受体为靶点的新型口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）[1]。截止目前安罗替尼已获国家药品监督管理局(NMPA)批准，用于三线治疗非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），以及二线治疗软组织肉瘤（STS）。同时，安罗替尼单药或联合放化疗、PD-1/PDL-1治疗恶性肿瘤的多个临床试验正在开展中。预计会有越来越多的患者使用安罗替尼，因此亟需了解其不良反应特性。
与大部分VEGFR抑制剂相同，高血压也是安罗替尼常见的不良反应之一，然而，在临床试验中高血压发生率报道具有很大的差异。先前的荟萃分析(Meta-analysis)表明，使用VEGFR抑制剂与高血压发生风险增加相关[2-7]，但目前国内外暂无关于安罗替尼高血压发生率和发生风险的Meta分析报道。由于高血压控制不佳可能导致剂量下调、严重的心血管事件甚至危及生命的后果，所以确定与安罗替尼相关的高血压发生率和发生风险十分重要。本研究拟对已发表的临床试验进行Meta分析，以确定其总体发生率和风险。同时探索VEGFR抑制剂之间高血压发生的差异，这可能会为理解其潜在机制以及制定治疗策略提供更多的参考依据。
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英文以“anlotinib”“AL3818”“clinical trial”等为检索词，检索Pubmed、Cochrane Library、Embase数据库，同时检索美国临床肿瘤学会（ASCO）获得会议论文，通过ClinicalTrials.gov网站获得相关临床试验信息。中文以“安罗替尼”“福可维”“AL3818”“临床试验”等为检索词，检索中国知网、万方、维普和中国生物医学文献服务系统数据库。检索时间为建库至2020年7月，收集国内外公开发表的与安罗替尼相关的临床试验。
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纳入标准：①前瞻性Ⅱ期和Ⅲ期临床试验；②受试者经病理组织学或细胞学检查证实为癌症患者；③试验组使用安罗替尼单药；④结局指标至少包含以下其中一种：发生所有等级或高等级（≥3级）高血压事件。
排除标准：①重复发表的文献；②动物实验；③Ⅰ期临床试验；④回顾性研究；⑤观察性研究；⑥病例报道；⑦试验组联合用药；⑧未详细报道本研究定义的结局指标；⑨通讯或评论；⑩同一试验的亚组分析。
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由2名研究者独立进行文献筛选和数据提取，并进行交叉核对，如出现分歧则通过讨论或咨询第三方解决。对于每一项研究提取以下信息：第一作者姓名、恶性肿瘤种类、试验阶段和类型、治疗方案和对照方案、纳入分析的患者人数及总人数以及发生高血压事件的人数等。纳入的研究根据美国国家癌症研究所的统一评价标准（3.0或4.0版本；http://ctep.cancer.gov）对高血压事件进行评估和记录，高等级（≥3级）为严重的不良事件。
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采用R软件（3.6.0版本）中的meta程序包进行Meta分析，根据提取到的数据，计算与安罗替尼相关的高血压发生率及其95%置信区间（CI）。为了准确计算相对风险（RR）及其95% CI，仅纳入对照组为安慰剂的随机对照试验（RCT）的数据。采用I2和Q统计量评估纳入研究的异质性，I2≥50%，P<0.05表明异质性较大，采用随机效应模型进行合并分析，反之，使用固定效应模型进行合并分析。应用SPSS软件（26.0版本），分析比较安罗替尼与各种VEGFR抑制剂的高血压发生率。双侧P<0.05表示差异具有统计学意义。
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初筛后共获得文献170篇，经阅读文题和摘要后筛选出15篇文献，仔细阅读全文后，纳入符合入选标准的文献13篇。文献筛选流程见图1。
图 1 文献筛选流程图
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纳入的13项研究均为英文文献，包括6篇前瞻性单臂Ⅱ期临床试验，6篇Ⅱ期RCT临床试验，1篇Ⅲ期RCT临床试验，共纳入1387名（安罗替尼：1187人，安慰剂：200人）癌症患者进行Meta分析。纳入研究的基本特征详见表1。
表 1 纳入的13项研究的基本信息
纳入文献 肿瘤类型 试验设计 药物名称 患者数 高血压发生数 试验组 对照组 试验组 对照组 试验组 ≥G3① 对照组 ≥G3② Wu[8] 小细胞肺癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 45 NA 6 3 NA NA Han[9] 非小细胞肺癌 Ⅲ期RCT 安罗替尼 安慰剂 294 143 199 40 24 0 Ma[10] 转移性肾细胞癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 42 NA 19 2 NA NA Chi[11] 软组织肉瘤 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 166 NA 70 8 NA NA Sun[12] 甲状腺髓样癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 58 NA 23 3 NA NA Tang[13] 骨癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 42 NA NR 8 NA NA Shan[14] 卵巢癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 14 NA 8 0 NA NA Zhou[15] 转移性肾细胞癌 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 舒尼替尼 90 43 45 12 29 11 Han[16] 非小细胞肺癌 Ⅱ期RCT 安罗替尼 安慰剂 60 57 33 6 3 0 Chi[17] 软组织肉瘤 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 安慰剂 158 75 99 30 NR NR Huang[18] 食管鳞状细胞癌 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 安慰剂 110 55 NR 17 NR NR Wang[19] 小细胞肺癌 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 安慰剂 46 22 18 7 NR NR Chi[20] 甲状腺髓样癌 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 安慰剂 62 NR 29 NR NR NR 注：NA：不适用；NR：未报道；①试验组高血压≥G3的发生数；②对照组高血压≥G3的发生数。 -
纳入11项研究共1035例病例用于分析，各个研究所有等级高血压发生率在13.3%～67.7%，发生率最低的是用于SCLC的Ⅱ期RCT临床试验[8]，发生率最高的是用于NSCLC的Ⅲ期RCT临床试验[9]。Meta分析显示纳入研究之间具有异质性(I2=88%, P<0.01)，因此使用随机效应模型合并，接受安罗替尼治疗的患者所有等级高血压的总发生率约为47.1%(95%CI:37.7%～56.6%)，结果见图2。
图 2 安罗替尼所有等级高血压不良反应发生率的森林图
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12项研究报道了接受安罗替尼的患者（合计1 125例）高等级高血压发生率，各项研究的高等级高血压发生率在0%～19.0%之间。Meta分析结果显示纳入研究之间存在异质性(I2=64%, P<0.01)，因此采用随机效应模型，合并得到安罗替尼高等级高血压总发生率约为10.6%(95%CI:7.4%～14.2%)，结果见图3。
图 3 安罗替尼高等级高血压不良反应发生率的森林图
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3项RCT研究详细记录了试验组和对照组高血压发生情况，2项对照组为安慰剂，1项对照组为舒尼替尼，为了明确安罗替尼与安慰剂相比高血压发生风险，仅纳入对照组为安慰剂的2项RCT研究。Meta分析结果如图4所示，I2=60%，P=0.11提示研究存在中等异质性，使用随机效应模型合并（RR=5.58, 95%CI:2.29～13.60, P<0.01）。图5为安罗替尼与安慰剂相比发生高等级高血压的相对危险度及Meta分析森林图，I2=0%，P=0.54，提示纳入的2项研究之间无异质性，采用固定效应模型合并（RR=27.78, 95%CI: 3.56～216.86, P<0.01）。
图 4 安罗替尼与安慰剂相比发生所有等级高血压的相对危险度的森林图
图 5 安罗替尼与安慰剂相比发生高等级高血压的相对危险度的森林图
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比较已发表的6个VEGFR抑制剂药物高血压发生率的Meta分析文献，进一步探讨了安罗替尼与其他VEGFR抑制剂高血压发生率的差异，表明安罗替尼高等级高血压发生率与阿昔替尼（RR=0.79, 95%CI:0.61, 1.02, P=0.066）和卡赞替尼（RR=0.87, 95%CI:0.67, 1.13, P=0.290）相似（见表2）。
表 2 安罗替尼与其他VEGFR抑制剂高血压发生率的比较
序号 比较组别 所有等级高血压 高等级高血压 发生率（样本量） RR（90% CI） P 发生率（样本量） RR（90% CI） P 1 安罗替尼 47.1%(1035) 10.6% (1175) 2 索拉非尼 23.4% (3363) 2.91(2.51～3.37) <0.001 5.7% (3567) 1.96(1.50～2.31) <0.001 3 舒尼替尼 21.6% (4609) 3.23(2.80～3.72) <0.001 6.8% (4407) 1.62(1.30～2.03) <0.001 4 帕唑帕尼 35.9% (1242) 1.59(1.34～1.88) <0.001 6.5% (1286) 1.71(1.28～2.30) <0.001 5 凡德他尼 24.2% (1815) 2.78(2.37～3.28) <0.001 6.4% (1190) 1.73(1.28～2.34) <0.001 6 阿昔替尼 40.1% (1148) 1.33(1.12～1.58) <0.001 13.1% (1148) 0.79(0.61～1.02) 0.066 7 卡赞替尼 27.8% (1083) 2.31(1.93～2.76) <0.001 12.0% (1083) 0.87 (0.67～1.13) 0.290 注：表中RR值和P值均为安罗替尼与其他VEGFR抑制剂相比较；其他VEGFR抑制剂高血压发生率数据从已发表文献中提取。 -
Egger检验和Begg检验结果显示，纳入分析的发生所有等级高血压事件（Egger检验：P=0.050，Begg检验：P=0.243）和高等级高血压事件（Egger检验：P=0.366,Begg检验：P=0.243）的相关文献未见明显发表偏倚。
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血管内皮生长因子（VEGF）是参与肿瘤血管生成的关键因子，目前VEGFR抑制剂是多种癌症的一线治疗药物。然而，在使用其治疗癌症的同时可能会诱发高血压，高血压不仅会增加心血管系统不良事件的发生风险，还可能累及其他系统，如导致肾脏损害、高血压性视网膜病变等[21]。
本研究共纳入1387例病例，研究结果提示接受安罗替尼治疗的癌症患者高血压发生率较高（所有等级47.1%, 95%CI:37.7%～56.6%；高等级10.6%, 95%CI:7.4%～14.2%）；与安慰剂相比，安罗替尼高血压发生风险显著增加（所有等级RR=5.58, 95%CI:2.29～13.60, P<0.01；高等级RR=27.78, 95%CI:3.56～216.86, P<0.01）。因此，在临床应用过程中应重视监测患者的血压，并根据血压的分级及时进行处理。
尽管有实验和临床证据表明VEGFR抑制剂与其发生高血压有直接的关系，但具体病理生理学和分子生物学机制尚不明确。其可能的机制包括：①VEGF通过促进内皮细胞释放一氧化氮（NO）从而产生血管扩张的效应，VEGFR抑制剂则会导致NO合成减少促进血管收缩，导致外周阻力增加和血压升高[22]；②内皮素-1分泌增加，导致全身血管阻力增加和高血压效应[23]；③VEGF可维持毛细血管网的完整性，当受到抑制时，可能会导致毛细血管的密度下降或结构疏松从而导致高血压[24]。
目前尚无关于使用VEGFR抑制剂治疗的患者血压管理的正式指南，美国国家癌症研究所药物研究委员会的心血管毒性小组建议[25]：①在开始VEGFR抑制剂治疗之前进行正式的心血管风险评估；②在整个治疗过程中监测血压和心脏毒性，在治疗初期更应密切监测；③积极管理早期出现的高血压和心脏毒性以预防长期心血管系统损害。
VEGFR抑制剂诱导血压升高治疗药物的选择应注意避免使用非二氢吡啶钙离子拮抗剂，因为其抑制CYP450 3A4，可能导致VEGFR抑制剂血药浓度升高，加剧VEGFR抑制剂诱导的高血压[26]。应避免同时使用CYP3A4抑制剂（如维拉帕米或地尔硫䓬等）。肾损害也是VEGFR抑制剂常见的不良反应，因此，控制安罗替尼所致的高血压最常用的是血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素II受体拮抗剂（ARB），若控制不佳，可以加用其他降压药（如钙离子拮抗剂、利尿剂、β阻滞剂等）[27]。
不同VEGFR抑制剂高血压发生率有较大的区别，因此，笔者进一步分析了使用安罗替尼与其他VEGFR抑制剂发生高血压的差异。从表2可以看出，使用安罗替尼的患者高血压发生率均高于其他大部分VEGFR抑制剂（包括索拉非尼[2]、舒尼替尼[3]、帕唑帕尼[4]、凡德他尼[5]、阿昔替尼[6]和卡赞替尼[7]）。对于高等级高血压发生率，安罗替尼与阿昔替尼和卡赞替尼相似，高于其他VEGFR抑制剂。不同VEGFR抑制剂高血压发生率具有较大差异的原因可能是由于部分VEGFR抑制剂还作用于其他靶点，如安罗替尼作用于VEGFR、FGFR、PDGFR和c-kit[1]，而卡赞替尼作用于VEGFR和间质表皮转化因子受体[7]。然而，缺乏安罗替尼与其他VEGFR抑制剂大样本量的头对头临床研究，而且患者的基线特征可能会影响结局指标，所以应该谨慎解释这些结果。
本研究的局限性：①本研究为Meta分析，不是基于患者的原始数据进行分析，因此可能存在一些混杂因素；②纳入研究未描述基线的高血压发病率，这可能是导致Meta分析后高血压总体发生率较高的原因之一，然而，我们使用了RCT研究的数据进行RR值的合并，从而减少误差；③纳入的研究之间存在潜在的差异，如不同的肿瘤类型等，但纳入计算RR值的临床试验的癌种均为NSCLC；④纳入研究的数量有限；⑤大多数临床试验会排除控制不佳的高血压或重大心血管疾病的患者，因此高血压的发生率和严重程度在真实世界中可能会更高。
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本文首次对癌症患者接受安罗替尼治疗相关的高血压总体发生率和风险进行Meta分析，使用安罗替尼会显著增加发生高血压的风险，建议临床用药前进行系统的心血管风险评估，用药期间密切监测血压并根据其分级进行适当管理，特别是对于高危患者。选择治疗高血压药物时，需注意药物相互作用。安罗替尼为多靶点TKI，临床应用过程中也应关注与其他靶点相关的不良反应。仍需进一步开展大样本量的研究，以明确其可能发生的机制和与其相关的危险因素。
Incidence and risk of hypertension in cancer patients receiving anlotinib: Review and Meta-analysis
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摘要:
目的 为了明确癌症患者应用安罗替尼后高血压发生率和发生风险，同时比较安罗替尼与其他血管内皮生长因子受体（VEGFR）抑制剂之间高血压发生率的差异。 方法 检索Pubmed、Cochrane Library、Embase、ASCO、中国知网、万方、维普和中国生物医学文献服务系统数据库，收集与安罗替尼相关的前瞻性Ⅱ期和Ⅲ期且有准确记录高血压不良反应发生情况的临床试验，采用R软件（3.6.0版本）对安罗替尼高血压不良反应发生率和发生风险进行Meta分析，使用SPSS软件（26.0版本）比较安罗替尼与其他VEGFR抑制剂之间高血压发生率的差异。 结果 来自13项研究的1387名癌症患者被纳入Meta分析。使用安罗替尼的高血压总发生率约为47.1%（95% CI: 37.7%～56.6%），高等级高血压发生率约为10.6%（95% CI: 7.4%～14.2%），与安慰剂相比，安罗替尼可显著增加高血压发生风险（RR=5.58, 95% CI: 2.29～13.60, P<0.01）以及高等级高血压发生风险（RR=27.78, 95% CI: 3.56～216.86, P<0.01）。另外，安罗替尼高等级高血压发生率与阿昔替尼（RR=0.79, 95% CI: 0.61～1.02, P=0.066）和卡赞替尼（RR=0.87, 95% CI: 0.67～1.13, P=0.290）相似，其余均高于其他VEGFR抑制剂。 结论 在使用安罗替尼的癌症患者中，高血压发生率较高，且显著增加发生高血压风险，建议临床对血压进行密切监测并及时治疗。 -
关键词:
- 安罗替尼 /
- 癌症 /
- 血管内皮生长因子受体抑制剂 /
- 高血压 /
- 荟萃分析
Abstract:Objective To investigate the overall incidence and risk of hypertension in the treatment of cancer patients who receive anlotinib and compare the differences between anlotinib and other VEGFR inhibitors. Methods Pubmed, Embase, Cochrane Library, ASCO, CNKI, Wangfang, VIP and CBM databases were searched. Eligible studies were phase II and III prospective clinical trials on cancer patients who received anlotinib and had the hypertension data available. Meta-analysis for the incidence and risk of anlotinib was performed by using R software (version 3.6.0). SPSS software (version 26.0) was used to compare the difference between anlotinib and other VEGFR inhibitors. Results A total of 1387 cancer patients from 13 clinical trials were included in the Meta-analysis. The overall incidences of all grade and high grade hypertension in cancer patients who received anlotinib were about 47.1% (95%CI: 37.7%−56.6%) and 10.6% (95%CI: 7.4%−14.2%). The use of anlotinib was associated with significantly increased risk of all grade (RR=5.58, 95%CI: 2.29−13.60, P<0.01) and high grade hypertension (RR=27.78, 95%CI: 3.56−216.86, P<0.01). In addition, the incidence of high grade hypertension associated with anlotinib was similar to axitinib (RR=0.79, 95%CI: 0.61−1.02, P=0.066) and cabozantinib (RR=0.87, 95%CI: 0.67−1.13, P=0.290). The incidences of rest of other VEGFR inhibitors were lower than that of anlotinib. Conclusions There is a high incidence and significant risk of developing hypertension in cancer patients receiving anlotinib. Adequate monitoring and timely treatment of hypertension is recommended. -
Key words:
- anlotinib /
- cancer /
- VEGFR inhibitors /
- hypertension /
- Meta-analysis
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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表 1 纳入的13项研究的基本信息
纳入文献 肿瘤类型 试验设计 药物名称 患者数 高血压发生数 试验组 对照组 试验组 对照组 试验组 ≥G3① 对照组 ≥G3② Wu[8] 小细胞肺癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 45 NA 6 3 NA NA Han[9] 非小细胞肺癌 Ⅲ期RCT 安罗替尼 安慰剂 294 143 199 40 24 0 Ma[10] 转移性肾细胞癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 42 NA 19 2 NA NA Chi[11] 软组织肉瘤 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 166 NA 70 8 NA NA Sun[12] 甲状腺髓样癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 58 NA 23 3 NA NA Tang[13] 骨癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 42 NA NR 8 NA NA Shan[14] 卵巢癌 Ⅱ期 单臂 安罗替尼 NA 14 NA 8 0 NA NA Zhou[15] 转移性肾细胞癌 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 舒尼替尼 90 43 45 12 29 11 Han[16] 非小细胞肺癌 Ⅱ期RCT 安罗替尼 安慰剂 60 57 33 6 3 0 Chi[17] 软组织肉瘤 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 安慰剂 158 75 99 30 NR NR Huang[18] 食管鳞状细胞癌 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 安慰剂 110 55 NR 17 NR NR Wang[19] 小细胞肺癌 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 安慰剂 46 22 18 7 NR NR Chi[20] 甲状腺髓样癌 Ⅱ期 RCT 安罗替尼 安慰剂 62 NR 29 NR NR NR 注：NA：不适用；NR：未报道；①试验组高血压≥G3的发生数；②对照组高血压≥G3的发生数。 
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表 2 安罗替尼与其他VEGFR抑制剂高血压发生率的比较
序号 比较组别 所有等级高血压 高等级高血压 发生率（样本量） RR（90% CI） P 发生率（样本量） RR（90% CI） P 1 安罗替尼 47.1%(1035) 10.6% (1175) 2 索拉非尼 23.4% (3363) 2.91(2.51～3.37) <0.001 5.7% (3567) 1.96(1.50～2.31) <0.001 3 舒尼替尼 21.6% (4609) 3.23(2.80～3.72) <0.001 6.8% (4407) 1.62(1.30～2.03) <0.001 4 帕唑帕尼 35.9% (1242) 1.59(1.34～1.88) <0.001 6.5% (1286) 1.71(1.28～2.30) <0.001 5 凡德他尼 24.2% (1815) 2.78(2.37～3.28) <0.001 6.4% (1190) 1.73(1.28～2.34) <0.001 6 阿昔替尼 40.1% (1148) 1.33(1.12～1.58) <0.001 13.1% (1148) 0.79(0.61～1.02) 0.066 7 卡赞替尼 27.8% (1083) 2.31(1.93～2.76) <0.001 12.0% (1083) 0.87 (0.67～1.13) 0.290 注：表中RR值和P值均为安罗替尼与其他VEGFR抑制剂相比较；其他VEGFR抑制剂高血压发生率数据从已发表文献中提取。
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