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过程分析技术（process analytical technology，PAT）通过对关键质量数据包括原始物料质量、中间物料质量和工艺过程参数进行实时监测以确保成品质量[1]。其中，近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIRS）分析技术是PAT的核心技术之一，其独特优势在于测试方便、分析速度快、分析效率高，非常适用于在线分析[2]。目前该技术在国外药企已有很多应用，如对流化过程中干燥终点的控制[3]、监测包衣过程[4]、测定片剂中原料药和辅料的含量[5]等。
硫酸羟氯喹是临床上治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮的常用药物[6-8]。硫酸羟氯喹制粒工艺为湿法制粒，而湿法制粒的产品质量控制主要在制粒过程中。为缩小批间差异和改善工艺，利用PAT技术建立定量或定性模型以检测颗粒水分、混合均匀度和粒径等一系列指标，而水分含量既影响粒径分布也影响混匀程度，故需要优先测量[9]。目前，硫酸羟氯喹颗粒在干燥过程中使用快速水分测定仪测定水分含量，以监测干燥终点。这种分析方法在干燥过程中取样测定水分，会带来人为干扰因素，且水分测定仪的测量时间较长，在等待测量结果时，流化床内的物料水分仍在不断变化。使用NIR分析技术对硫酸羟氯喹颗粒的水分含量进行实时监测，将有助于提高硫酸羟氯喹的生产效率、降低因等待测量结果时物料水分仍在不断降低带来的生产风险，以及提高产成品的质量，有助于向生产全自动化发展。目前，国内使用NIR分析技术监测物料水分含量的报道以离线方式居多[10-13]。课题组之前建立了硫酸羟氯喹颗粒离线水分定量模型[10]，本研究在此基础上先在小试部分建立在线水分定量模型，并在试运行情况良好的基础上将模型转移到车间生产线。结果表明该模型能满足生产过程在线监测硫酸羟氯喹颗粒水分的需求。
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Thermo Antaris MX近红外光谱仪、TQ Analyst 9.5软件（美国Thermo Fisher公司），HX204卤素水分测定仪（瑞士Mettler-Toledo公司），硫酸羟氯喹颗粒（上海上药中西制药有限公司），MATLAB 2014a（美国MathWorks公司），DPL-0.5型多功能制粒/包衣机（重庆精工制药机械有限责任公司），DG400流化床（上海东富龙科技股份有限公司）。
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在流化床锅体的下半部分安装蓝宝石窗口，并将Thermo Antaris MX近红外光谱仪的探头固定于窗口上，取样口在流化床的另一侧。将制粒后的湿颗粒倒入流化床中进行干燥，实验所用样品是在流化床干燥过程中从取样口实时取出得到的样品：流化床开始进风干燥并开始连续采集样品光谱，光谱采集完成后立即取样。因物料温度在30 ℃前样品水分变化较快，故取样间隔时间较短，每隔30 s取一次样品；在物料温度高于35 ℃时水分变化较慢，取样的间隔时间延长，每隔2 min取一次样品，待物料温度继续上升到55 ℃时停止干燥（覆盖了工艺范围以得到全面的样品光谱信息）。一批物料需分成4锅流化床完成，每做一锅流化床采集约10个样本，一批可采集约40个样品，共12批采集519个样品建立模型。
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用水分测定仪测定样品的水分质量含量为1.00%～7.50%（涵盖了工艺优化值1.00%～4.00%）。
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使用近红外光谱仪以漫反射光纤探头的采集方式连续采集干燥过程中的样品的近红外光谱。光谱的扫描范围为10 000～4 500 cm−1，扫描次数为64次，分辨率为8 cm−1，增益值为8×，每次采集光谱前均进行背景光谱的采集，采集得到的近红外光谱如图1所示。
图 1 硫酸羟氯喹颗粒近红外光谱对数图
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利用TQ Analyst 9.5软件结合化学计量学的PLS算法，建立硫酸羟氯喹颗粒含水量的定量分析模型。首先采用Chauvenet准则检验结合杠杆值-学生化残差图鉴别并剔除异常样本[14]，进而采用SPXY分类算法将其余样本划分为校正集和验证集。通过一系列参数，包括校正集误差均方根(RMSEC)、验证集误差均方根（RMSEP）和相关系数R等评价模型进行考察[15]。当模型相关系数R越接近1，说明模型拟合效果好，分析准确度越高。当RMSEC和RMSEP值越小且越彼此接近，即|RMSEP-RMSEC|趋近0，表明模型具有好的稳定性，且当RMSEP值较小时，模型具有较高预测能力。
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异常样本会对NIR模型产生很大的影响，例如误导光谱变量的选择，影响模型的参数估计，降低模型的预测准确度和稳定性[16-18]。采用Chauvenet准则检验结合杠杆值-学生化残差图，鉴别并剔除13个异常样本：23、58、61、70、79、95、96、97、139、223、276、350和473。
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在NIR模型建立的过程中如何挑选具有代表性的样本，对最终模型的预测准确性与稳定性有很大影响。SPXY[19]分类方法是近红外样本分类中一种常用的方法，同时考虑了样本的光谱和浓度特征。进行模型建立的样本共有519份，在“2.4.1”项下剔除了13份样品，将剩余506份样品使用SPXY分类法进行分类，344份样品作为校正集，162份样品作为验证集。主成分分析结果表明，样本的验证集均匀分布在校正集中。
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光谱预处理方法包括MSC、SNV及求导等一系列算法。MSC通过数学方法将光谱中的散射信号与化学信息进行分离，用于消除由于样品颗粒分布不均及颗粒大小不同所产生的散射对其光谱的影响。SNV的作用与MSC基本相同，均是用于消除由于颗粒散射及光程差异给光谱带来的影响[15]。
对光谱进行求导，同时运用Savitzky-Golay(S-G)平滑滤波，或者Karl Norris平滑滤波对光谱进行平滑。求导可以增强光谱信号，平滑可以滤除噪声。从表1可以看出NIR光谱经过MSC、一阶导数以及Karl Norris平滑，能得到较好的数据处理结果。
表 1 不同光谱预处理方法得到的模型参数
预处理方法 RMSEC
（%）RMSEP
（%）RMSECV
（%）R 无预处理方法 0.457 0.499 0.489 0.9206 MSC1 0.467 0.409 0.481 0.9309 SNV2 0.469 0.411 0.483 0.9306 MSC+一阶导数 0.537 0.506 0.585 0.8962 MSC+二阶导数 0.457 0.745 0.867 0.7647 MSC+一阶导数+Norris3 0.408 0.435 0.446 0.9372 SNV+一阶导数 0.537 0.506 0.585 0.8962 SNV+二阶导数 0.456 0.745 0.867 0.7647 SNV+一阶导数+Norris 0.405 0.436 0.446 0.9372 注：1表示多元散射校正；2表示标准归一化变换；3表示平滑滤波。 -
选择合适的波段用于模型的建立，对最终所建模型的预测准确度和稳定性有重要的影响。为了得到NIR光谱的特征信息，首先对前3个主成分的载荷向量进行分析[20]，图2A为前3个主成分全光谱范围的载荷图。由PC1载荷图可知，光谱在4 935～5 336 cm−1和6 911～7 297 cm−1附近的波段范围包含更多的特征信息。由PC2和PC3载荷图可知，在上述波段附近也包含较多的光谱信息。同时，与得到求导后的一阶光谱（图2B）相比较，确定上述两个波段与水分之间确实具有较强的相关性，是NIR光谱中水分的主要吸收峰，可用于水分模型的建立。
图 2 硫酸羟氯喹近红外光谱图
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主因子数的选择在建立模型的过程中至关重要，选择正确的主因子数既能完全利用NIR光谱信息，还能避免出现过拟合现象。根据TQAnlyst9.5中的PRESS图，以RMSECV和PRESS最小时所对应的主因子数即为最佳主因子数（本研究中主因子数为6）。
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根据SPXY分类法得到的校正集建立模型，用验证集对模型进行验证。以MSC+一阶导数+Karl Norris平滑为光谱的预处理方式，选择的建模波段为4 935～5 336 cm−1和6 911～7 297 cm−1，结合化学计量学中的PLS算法建立NIR定量分析模型（图3）：RMSEC为0.408，相关系数为0.952 9；RMSEP为0.435，相关系数为0.936 6；主因子数为6。从图3可以看出校正集和验证集的数据点在模型范围（1.00%～7.50%）内分布均匀，且校正集分布在验证集的范围内，表明用校正集建立的模型对验证集的验证有效，同时|RMSEP−RMSEC|的数值为0.027，趋近于0，以上结果均表明所建模型较为稳定。
图 3 硫酸羟氯喹颗粒定量模型
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RPD值是验证集标准偏差与预测集标准偏差的比值，即RPD=SDV/SEP。本研究以RPD值对模型进行评价。其中，SDV为验证集所有样本浓度值的标准偏差，SEP为预测集标准偏差。验证集样本的性质分布越均匀，SEP值越小，RPD值越大。本研究中，通过计算得到RPD值为5.18（大于5），表明模型的预测结果可以接受[10]。
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将建立完成的模型应用于一批物料（PAT190601-6）的干燥过程，按“2.1”项下操作，采集所取样品光谱。将采集的光谱导入“2.4.6”项下建立的模型，得到光谱的预测值，用快速水分测定仪测定每份样品的参考值。预测集的RMSEP=0.265。将预测集样本的预测值与参考值进行配对样本t检验，显著性水平设为0.05。检验结果|t|=0.195，小于t双尾临界值1.990，F=1.10<1.46，说明预测值与参考值之间无统计学差异。图4为预测值与参考值水分变化曲线，从图中可以看出两个曲线的重合性较好，进一步表明模型的误差较小，稳定性较好（鉴于流化床体积，一个批次样品需要分为4份进入流化床干燥）。
图 4 4份样品预测值与参考值的水分变化曲线
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在模型已初步建立完成并应用情况较好的小试基础上，将仪器移入车间，开始对大生产过程中物料水分变化进行实时检测。将蓝宝石窗口置于流化床底部，探头切合于窗口，取样口于窗口的对面处。考虑到仪器所处环境的改变可能对光谱产生影响，包括吸收峰的偏移、展宽、吸收强度的非线性变化等[21]，需要对模型在车间的可应用性重新评价。
对一批物料（PAT-191223）进行干燥实验，该批样品需分两批进入流化床，每批采集3～4 g样品后，用水分测定仪测定水分值。预测集的RMSEP=0.265。将预测集样本的预测值与参考值进行配对样本t检验，显著性水平设为0.05。检验结果|t|=0.265，小于t双尾临界值2.110，F=0.78<3.18，说明预测值与参考值之间无统计学差异。
将模型导入Result Operation软件，可实时反映物料（PAT-191223）的水分值变化，由图5可见水分值平稳下降、直至趋于稳定。在干燥过程中，在线取出5份样品，用水分测定仪测量参考值并标于图中（红色为参考值，黑色为预测值）。可见预测值与参考值的重合性较好，表明模型的误差较小且稳定性较好。
图 5 硫酸羟氯喹颗粒水分含量变化图
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模型的误差有两个来源：①探头与取样口间隔较远，降低了采集得到的光谱与样品的空间对应性，对模型的准确度带来影响；②取样口的通道较窄，会造成湿物料堆积，对样品的水分值造成影响。解决方法：①光谱采集完成后立即取样，可以保证光谱与样品的时间对应性，对于提高空间对应性的解决方法是可在窗口附近安装取样口；②及时清理取样口堆积的物料，避免对样品水分值产生影响。
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工艺要求硫酸羟氯喹颗粒水分值为1.00%～4.00%，模型预测范围为1.00%～7.50%，包含了工艺要求的范围，可应用此模型缩小批间的水分差异。例如，当预测值在2.00%时停止干燥，为工艺的改善和提高提供基础。从图5可以看出，部分时间段的水分值上下波动，而非持续下降，且在接近干燥终点时，水分值在2.00%处波动，且无明显下降趋势。原因可能为采集得到的NIR光谱反映的是表层样品的光谱，无法准确反映较深处即流化床锅体内部的物料水分情况，而下一张光谱有可能为内部的物料吹到窗口处采得，因此，预测的水分值略有升高。
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本实验采集了11批次药品用于含水量模型的建立。由于在硫酸羟氯喹的实际生产过程中，原辅料的不同批次之间存在批间差异，此外，生产过程中存在影响硫酸羟氯喹颗粒质量的其他因素，这也导致不同批次的硫酸羟氯喹颗粒之间也存在批间差异。故在建立模型时尽可能包含较多批次，以包含更多批间差异，虽然模型的误差可能会增加，但可提高后期模型在实际大生产中的可应用性。因此，在以后的生产过程中仍需不断累计数据，更新并完善模型。
Establishment of online quantitative model for moisture content determination of hydroxychloroquine sulfate particles by near infrared spectroscopy
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摘要:
目的 为实时检测硫酸羟氯喹颗粒在流化床干燥过程中的水分含量变化，建立颗粒水分的在线近红外光谱定量模型。 方法 物料颗粒在流化床的干燥过程中，实时取样并用水分测定仪测量颗粒水分，采用多元散射校正（multiplicative signal correction, MSC）、一阶导数和Karl Norris平滑的光谱预处理方法，选择近红外4 935～5 336 cm−1和6 911～7 297 cm−1两个波段，运用偏最小二乘回归（partial least squares, PLS）建立基于近红外光谱的水分定量分析模型。 结果 所建模型的校正误差均方根（RMSEC）为0.408，相关系数Rc为0.952 9。预测误差均方根（RMSEP）为0.435，相关系数Rp为0.936 6，验证集标准偏差与预测标准偏差的比值（RPD）为5.18。并将该模型应用于车间生产过程中，t检验结果表明，预测值与参考值之间无显著性差异。 结论 该法所建立的在线水分定量模型准确度较高且较为可靠稳定，该模型可应用于生产过程，以在线监测物料颗粒的水分变化。 Abstract:Objective To establish an online quantitative analysis model for moisture content assay of hydroxychloroquine sulfate particles by near infrared (NIR) spectroscopy. Methods The NIR spectra were collected in real time when the material particles were dried in the fluidized bed. Meanwhile the water content of the particles was measured with the standard moisture tester. The multiplicative signal correction (MSC) and first derivative followed by Karl Norris smoothing were used for spectra pretreatment. Two spectral range (4 935−5 336 cm−1 and 6 911−7 297 cm−1) were selected for the quantitative model with the partial least squares (PLS) regression. Results The quantitative calibration model had good correlation coefficients with Rc value=0.952 9 and Rp value=0.936 6. The root mean square error of calibration (RMSEC) was 0.408 and the root mean square error of prediction error (RMSEP) was 0.435. The ratio of standard deviation of validation set to prediction standard deviation (RPD) was 5.18. There was no significant difference between the predicted value and the reference value by t test when the established model was applied in large-scale production. Conclusion The online model established for monitoring water content has high accuracy and stability, which can be applied in industrial scale process to monitor the particle moisture in real time. -
奥卡西平(oxcarbazepine, OXC)是第二代抗癫痫药物，可用于儿童全面强直-阵挛发作，部分伴或不伴继发性全面发作的一线治疗[1]，其具有与传统的抗癫痫药物（AEDs）如苯妥英钠、卡马西平和丙戊酸钠相同的疗效，但其对肝药酶和自身的诱导作用小，药物间相互作用较少，临床上可用于替代传统的AEDs。OXC是卡马西平（carbamazepine, CBZ）的一种10-酮类衍生物，但两者之间的药动学存在差异，OXC的耐受性好且不良反应少[2]。OXC是无活性的前体药物，在体内经过肝脏内细胞溶质芳基酮还原酶的作用转化为具有药理活性的中间代谢产物单羟基卡马西平（monohydroxy carbamazepine, MHD）[3-4]。国际抗癫痫联盟推荐MHD血清浓度的参考范围为3～35 μg/ml[5]，有研究表明，当血药浓度高于30 μg/ml时，容易发生药物不良反应，且在许多患者中，不良反应间歇性的发生与MHD浓度的波动有关[6]。在临床用药中也发现OXC服药后的药物浓度个体化差异大，年龄、性别、体重、肝肾功能等均会影响MHD的药动学参数[7]，故需要对其血药浓度进行监测。本研究在参考既往研究的基础上[8-12]，对色谱条件进行了优化，并简化了血样处理的过程，建立了HPLC法测定OXC活性代谢产物MHD血药浓度的方法，该方法快速、简单、准确、选择性好、灵敏度高，为临床监测血药浓度、调整给药剂量提供了手段。
1. 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；H1850R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科仪器有限公司）；SHB-B95A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Discovery DV215CD型分析天平（美国OHAUS公司）；Vortex-5型涡旋混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2 材料
MHD对照品（美国CATO公司）；内标：奥硝唑（中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海科丰化学试剂有限公司）；空白血浆（医院血库提供）；超纯水（实验室自制）。
2. 实验方法
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），预柱为Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈（80:20，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μl；双波长检测：在192 nm处检测MHD，318 nm处检测奥硝唑。
2.2 溶液及血浆样品的配制
2.2.1 储备液的配制
精密称取MHD对照品10 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为1 mg/ml的储备液，置于−20 ℃下保存。
2.2.2 内标工作液的配制
精密称取奥硝唑1.4 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为140 μg/ml的内标工作液，置于−20 ℃下保存。
2.2.3 血浆标准曲线和质控样品的配制
分别精密量取适量储备液，用甲醇稀释成20、50、100、200、300、400、500 μg/ml浓度梯度的标准对照溶液。取以上6个标准对照溶液，加入适量空白血浆，得2、5、10、20、30、40、50 μg/ml系列浓度的血浆标准曲线样品。同法配制相应的低、中、高浓度的血浆质控样品（QC），使得MHD对应的浓度分别为5、15、40 μg/ml。
2.3 血浆样品的预处理
取200 μl血浆样品，加入200 μl内标工作液、400 μl甲醇，涡旋混合30 s，10 ℃条件下13 000 r/min离心10 min，取上清液直接进样。
3. 结果
3.1 专属性试验
通过考察6份不同生物来源的空白血浆样品色谱图、空白血浆样品加入MHD对照品和内标的色谱图，以及临床实际用药后的患者血浆样品色谱图，以此反映方法的专属性。由图1可见，在本实验条件下，被测物MHD与内标的色谱峰分离良好，且血浆中的内源性物质不干扰测定。MHD和内标的保留时间分别为9.5 min和6.1 min。
3.2 标准曲线与线性范围
取上述浓度为2、5、10、20、30、40、50 μg/ml的血浆标准曲线样品按“2.3”项下方法处理。经HPLC法分析，以测得OXC的峰面积与内标峰面积之比（Y）作为纵坐标，以血浆MHD浓度（X）为横坐标，得到回归方程为：Y=0.047 1X+0.022 2（r=0.998 6）。线性范围：根据标准曲线，MHD血药浓度在2～50 μg/ml范围内线性关系良好，其定量下限浓度为2 μg/ml。
3.3 日内、日间精密度和准确度
配制定量下限、低、中、高（2、5、15、40 μg/ml）4种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理后测定，连续测定3 d，以当天的标准曲线计算QC样品的测定浓度，计算日内、日间精密度以及准确度。经测定，MHD的日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，均符合生物样品的测定要求，结果见表1。
表 1 单羟基卡马西平日内、日间精密度和准确度（n=6）理论浓度
（μg/ml）实测浓度
（μg/ml）RSD（%） RE（%） 日内精密度 日间精密度 2 1.85±0.16 8.64 12.21 −3.63 5 4.93±0.24 4.86 7.68 −4.43 15 14.32±0.37 6.86 6.16 −3.11 40 41.80±1.26 3.03 5.33 0.59 3.4 提取回收率
配制低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理。同时另取18份空白血浆，除了不加系列对照品溶液和内标外，按“2.3”项下方法处理，在获得的上清液中加入MHD和内标溶液至相应浓度。进样分析，以每一浓度中2种不同处理方法的峰面积比值计算提取回收率。经测定，本法中MHD的平均提取回收率在89.62%～95.32%之间；内标的平均提取回收率为98.76%，符合生物学样品的分析要求，结果见表2。
表 2 单羟基卡马西平、MHD和内标提取回收率试验结果（n=6）化合物 浓度（μg/ml） 提取回收率（%） MHD 5 89.62±4.82 15 94.67±6.76 40 95.32±4.90 内标 140 98.76±5.92 3.5 稳定性试验
3.5.1 室温稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并在室温条件下放置4 h和10 h后测定样品血药浓度，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在室温下放置10 h后仍稳定，RSD均小于4.47%，RE值在1.50%～2.98%之间，结果见表3。
表 3 奥卡西平代谢产物单羟基卡马西平稳定性试验结果 (n=5)储存条件 理论浓度（μg/ml） 实测浓度（μg/ml） RSD（%） RE（%） 室温10 h 5 5.15±0.19 3.60 2.98 15 15.39±0.69 4.47 2.62 40 40.60±0.40 0.98 1.50 冻融3次 5 5.47±0.15 2.83 9.41 15 15.79±0.32 2.06 5.24 40 40.75±1.10 2.71 1.86 处理后36 h 5 5.39±0.27 5.09 7.74 15 15.66±0.58 3.70 4.39 40 39.46±1.80 4.57 −1.34 −20 ℃，30 d 5 5.16±0.23 4.39 3.19 15 14.62±0.39 2.64 −2.53 40 40.37±0.58 1.44 0.93 3.5.2 冻融稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并于−20 ℃冰箱中冷冻保存24 h后室温下解冻1 h后测定，反复冻融3次，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品反复冻融3次后仍能保持稳定，RSD均小于2.83%，RE值在1.86%～9.41%之间，结果见表3。
3.5.3 处理后的血浆样品在自动进样器中储存的稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆QC样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，然后放置在自动进样器内12 h、36 h后再次测定，求得RSD和RE值。经测定处理后的MHD血浆样品在进样器内放置36 h仍能保持稳定，RSD均小于5.09%，RE值在−1.34%～7.74%之间，结果见表3。
3.5.4 长期稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆质控样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，并置于−20 ℃冰箱中冻存30 d后取出解冻后测定，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在−20 ℃冰箱中冻存30 d后仍能保持稳定，RSD均小于4.39%，RE值在−2.53%～3.19%之间，结果见表3。
4. 讨论
目前，有关MHD的检测方法的文献很多，其中,高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法都有报道，后者虽有灵敏度高、专属性强的特点，但其仪器昂贵，且需专业人员进行操作，很难在大部分的医疗机构普及[13-15]。另外，国内外文献报道中多使用固液萃取法或液液萃取法进行血样的前处理，但这种处理过程相对复杂、耗时，且经济成本较高[11, 16]。本方法采用甲醇沉淀蛋白进行血样的前处理，建立了HPLC法测定人血浆中MHD血药浓度的方法，整个过程操作简单、快速，样品分析时间较短，适用于临床大量样品的连续检测。
文献报道的流动相有乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钾溶液（33∶67，V/V）[12]、水-乙腈（65∶35，V/V）[17]、水-甲醇-乙腈（64∶30∶6，V/V/V）[18]等。本方法采用了水-乙腈，按不同的配比进行试验，发现当水-乙腈的比例为80∶20时，色谱峰的峰形、出峰时间及分离度最佳。文献采用卡马西平[17]、苯巴比妥[19]和奥硝唑[20]等作为内标，本研究通过筛选发现奥硝唑的保留时间为6.1 min，不仅与MHD的保留时间相近，又能与其有很好的分离，且其性质稳定，满足内标的要求。
本实验建立的测定人血浆中OXC活性代谢产物MHD的HPLC法，MHD线性回归方程中的r=0.998 6，说明血药浓度在2～50 μg/ml范围内具有良好的线性关系，日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，MHD及内标的平均提取回收率在89.62%～98.76%之间。血浆样品的稳定性试验证明，在室温放置10 h、反复冻融、处理后放置进样器36 h以及低温保存30 d的情况下，样品未见明显降解，仍能保持稳定。本研究建立的HPLC法操作快速简单，精密度、回收率高，稳定性好，专属性强，不受血浆中内源性物质的干扰，结果准确可靠，且灵敏度高，适用于奥卡西平临床血药浓度的监测。
目前癫痫治疗主要以药物治疗为主，奥卡西平是第二代抗癫痫药物，我国诸多癫痫病专家也建议将其作为癫痫部分性发作和全面强直阵挛发作的首选药物[21]。但奥卡西平使用过程中可能出现瘙痒、荨麻疹、血管性水肿等超敏反应，包括Stevens Johnson综合征中毒性表皮坏死松解症[22]等，还可引起低钠血症、头晕、胃肠道不适等不良反应，有文献报道，其疗效及不良反应可能与血药浓度密切相关[23]，因此开展奥卡西平血药浓度的测定，能提高药物治疗的疗效，同时可以有效避免或减少可能产生的药物不良反应，提高癫痫患者服药的依从性。本研究建立了测定人血浆中MHD血药浓度的方法，应用于临床，为临床个体化给药提供依据，值得临床推广使用。
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表 1 不同光谱预处理方法得到的模型参数
预处理方法 RMSEC
（%）RMSEP
（%）RMSECV
（%）R 无预处理方法 0.457 0.499 0.489 0.9206 MSC1 0.467 0.409 0.481 0.9309 SNV2 0.469 0.411 0.483 0.9306 MSC+一阶导数 0.537 0.506 0.585 0.8962 MSC+二阶导数 0.457 0.745 0.867 0.7647 MSC+一阶导数+Norris3 0.408 0.435 0.446 0.9372 SNV+一阶导数 0.537 0.506 0.585 0.8962 SNV+二阶导数 0.456 0.745 0.867 0.7647 SNV+一阶导数+Norris 0.405 0.436 0.446 0.9372 注：1表示多元散射校正；2表示标准归一化变换；3表示平滑滤波。 
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