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抗菌药物耐药性是一个全球性的公共卫生问题。碳青霉烯类抗生素被认为是治疗多重耐药菌感染的最后防线，但随着其在临床的广泛应用及不合理使用，导致耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）特别是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）激增，给临床抗感染治疗带来巨大挑战。
头孢他啶/阿维巴坦（ceftazidime/avibactam，CAZ/AVI）是一种新型β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂，研究表明，阿维巴坦在体外可抑制Ambler分类中的A类、C类和某些D类酶的活性，由于缺乏活性位点丝氨酸残基，对B类金属酶没有活性[1]。阿维巴坦可重新环化恢复活性从而可长效抑制β-内酰胺酶[2]，能够恢复或增强头孢他啶抗菌活性，CAZ/AVI组合具有广谱抗菌活性，对包括CRE在内的多重耐药革兰阴性杆菌（MDR-GNB）具有强有力的杀菌活性。CAZ/AVI于2015年在美国获批上市，随后在欧洲和中国获批上市。现已陆续被美国食品药品管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）和国家药品监督管理局（NMPA）批准用于成人治疗方案有限或无其他选择的G-菌感染的治疗。目前，有一些小样本的回顾性研究表明[3-7]，CAZ/AVI可能是治疗CRE/CRKP的有效替代品，但没有关于CAZ/AVI与其他抗菌药物用于CRE/CRKP的疗效和安全性比较的系统评价，以至于无法客观的评估两者之间的差异。本研究拟采用Meta分析方法，对国内外公开发表的CAZ/AVI治疗碳青霉烯类耐药菌感染的疗效和安全性研究进行系统评价，以期为CAZ/AVI的临床选用提供循证依据。
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计算机检索PubMed、Embase、Cochrane Library、中国生物医学文献数据库（CBM）、中国知网（CNKI）、维普中文科技期刊数据库（VIP），并在此基础上进行手工检索及追查纳入文献的参考文献。检索时限为各数据库建库起至2021年2月。中文检索词为：头孢他啶阿维巴坦；英文检索词为：“ceftazidime/avibactam”“carbapenem-resistanece Enterobacteriaceae（CRE）”“carbapenem-resistance Klebsiella pneumonia（CRKP）”“carbapenemase-producing Enterobacteriaceae（CPE）”。检索采取主题词和自由词相结合的方式检索，如PubMed检索式：(“avibactam, ceftazidime drug combination [Supplementary Concept]”OR“avibactam-ceftazidime”OR“ceftazidime-avibactam”OR“Avycaz”) AND (“carbapenem-resistanece enterobacteriaceae”OR“carbapenem-resistance klebsiella pneumonia”OR“carbapenemase-producing enterobacteriaceae”)。
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①研究类型：收集所有类型的中、英文临床研究，包括随机对照研究、队列研究、病例对照研究、有对照的病例报告（样本量≥10）。②研究对象：年龄≥18岁，临床确诊为CRE/CRKP感染患者，性别不限。③干预措施：试验组患者接受CAZ/AVI抗感染治疗，给药时间≥24 h，用法用量及疗程不等；对照组为其他常规抗菌药物，如多粘菌素或替加环素或碳青霉烯类或β-内酰胺酶抑制剂或氨基糖苷类等抗感染治疗。④结局指标：临床治愈率、临床缓解率、28 d/30 d全因病死率、感染复发率、不良事件发生率（adverse events，AEs）和严重不良事件发生率（SAEs）。
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①重复发表或数据重复的文献；②报道信息太少、质量差及数据无法利用或错误的文献；③会议论文、病例报告和病例系列（样本量<10）、动物实验、体外实验。
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由2名研究者通过阅读标题和摘要对检索所得文献进行初选和去重，再阅读全文并按照纳入与排除标准独立确定纳入文献。如有分歧则讨论解决，必要时提请第三方仲裁。提取数据包括第一作者及发表年限；研究设计类型；纳入人群的基本特征（分组及样本量、年龄、性别、耐药菌等）；抗菌药物给药方案和结局指标。
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由两位评价者依据纽卡斯尔-渥太华量表[8]（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）对纳入研究进行质量评价，如存在分歧则讨论决定。NOS主要包括研究人群选择、组间可比性和结果测量3个项目共8个条目，对文献质量的评价采用星级系统的半量化原则，该量表以星数代表分值，满分为9颗星。评分>6颗星为高质量研究，评分6颗星为中等质量研究，评分<6颗星为低质量研究[9]。NOS评分≥6颗星的文献方可纳入研究。
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采用Cochrane协作网提供的RevMan 5.3统计软件进行Meta分析。本研究所有结局指标均为计数资料，故采用效应量比值比（OR）及其95%置信区间（CI）表示。采用χ2检验分析各研究结果间的统计学异质性，若各研究结果间异质性无统计学意义（P>0.10或I2<50%），则采用固定效应模型进行Meta分析，反之，则采用随机效应模型进行Meta分析。
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初筛得到相关文献564篇，其中，英文文献486篇（PubMed 315篇、Embase 83篇、Cochrane Library 88篇），中文文献78篇（CBM 28篇、CNKI 27篇、VIP 23篇）。剔除重复文献后获得248篇，阅读标题后排除与CAZ/AVI治疗CRE/CRKP/CPE感染不相关文献227篇。阅读剩余文献摘要，排除结局指标缺失或指标不相关文献33篇，得到文献11篇。阅读全文剔除样本量<10的文献后，最终纳入5篇英文文献[3-7]进入本研究。共计患者392例，其中，试验组110例，对照组282例。其中，1项为前瞻性研究，4项为回顾性研究。4项研究为CRE感染，1项研究为CRKP感染，4项CRE研究进行了碳青霉烯酶检测确定绝大部分菌株产KPC酶。纳入研究的基本信息见表1。
表 1 纳入研究基本信息
纳入研究 中心情况 研究类型 研究时间（年） 分组及样本量 平均年龄（岁） 男性（%） 致病菌 观察时间（t/d） 给药方案 伴随疗法 结局指标 Shields[3]
2017单中心
（美国）回顾性 2009-2017 T（13） 66 54 CRKP 90 CAZ/AVI GEN ①③④⑤⑥⑦ C（96） 59 （57.3） CB+AG,CB+COL,其他疗法 Castón[4]
2017多中心（西班牙、以色列） 回顾性 2012-2016 T（8） 61 50 CRE 30 CAZ/AVI AM,CB,FOS,TGC,COL ①③ C（23） 59 （65.2） CB,AG,
BLIBL,TGC,
FOS,COLDuin[5] 2018 多中心
（美国）前瞻性 2011-2016 T（38） 57 61 CRE 30 CAZ/AVI TIG,AG,GEN,CB,FOS,
SXT①②③⑥⑦ C（99） 63 （42） COL Alraddadi[6]2019 单中心（沙特阿拉伯） 回顾性 2017-2018 T（10） 59.5 80 CRE 30 CAZ/AVI - ①②③⑤ C（28） 61.5 （57.1） COL,CB,TGC,AM,QU,SXT,AZT Tsolaki[7]
2019多中心
（希腊）回顾性 40个月 T（41） 61.9 68.3 CRE 28 CAZ/AVI - ①③⑤ C（36） 59.1 （77.3） 适当抗生素
治疗注：T：试验组；C：对照组。结局指标：①临床治愈率；②临床缓解率；③28 d/30 d全因病死率；④感染复发率；⑤AEs；⑥SAEs。CAZ/AVI：头孢他啶/阿维巴坦；CB：碳青霉烯类；AG：氨基糖苷类；GEN：庆大霉素；COL：多粘菌素E；TGC：替加环素；BLIBL：β-内酰胺酶抑制剂；FOS：磷霉素；QU：喹诺酮类；SXT：复方磺胺甲唑；AZT：氨曲南。 -
依据NOS对5项观察性研究进行质量评价，NOS评分均为6颗星，符合纳入Meta分析标准。
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5项研究[3-7]报道了临床治愈率，各研究间无统计学异质性（I2=0%，P=0.40），选择固定效应模型分析，结果显示，CAZ/AVI组患者临床治愈率高于对照组，结果有统计学意义[OR=3.57，95% CI(2.03，6.26)，P<0.00001]，见图1。
图 1 两组患者临床治愈率的森林图
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两项研究[5-6]报道了临床缓解率，各研究间无统计学异质性（I2=0%，P=0.45），选择固定效应模型分析，结果显示两组患者临床缓解率相当，结果无统计学意义[OR=1.92，95% CI(0.93，3.97)，P=0.08]。
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5项研究[3-7]报道了28 d/30 d全因病死率，各研究间无统计学异质性（I2=0%，P=0.63），选择固定效应模型分析，结果显示CAZ/AVI组患者28 d/30 d全因病死率低于对照组，结果有统计学意义[OR=0.27，95% CI(0.14，0.50)，P<0.0001]，见图2。
图 2 两组患者28 d/30 d全因病死率的森林图
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3项研究[3, 5-6]报道了感染复发率，各研究间有统计学异质性（I2=61%，P=0.08），选择随机效应模型分析，结果显示两组患者感染复发率相当，结果无统计学意义[OR=0.44，95% CI(0.11,1.85)，P=0.26]。
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2项研究[3, 5]分别报道了不良事件（AEs）和严重不良事件（SAEs），各研究间均无统计学异质性（I2=0%，P=0.43）和（I2=0%，P=0.46），选择固定效应模型分析，结果显示，CAZ/AVI组患者AEs低于对照组，结果有统计学意义[OR=0.29,95% CI(0.10,0.80), P=0.02]。两组患者SAEs相当，结果无统计学意义[OR=0.33,95% CI(0.09,1.19), P=0.09]，见图3。
图 3 两组患者AEs和SAEs的森林图
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由于缺乏有效和安全的替代治疗方案，碳青霉烯类抗生素耐药性的上升尤其令人担忧，临床迫切需要新的抗菌药物来解决耐药性带来的治疗难题。CAZ/AVI是第三代头孢菌素和新型的非β-内酰胺类的β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦相结合的抗生素，将CAZ的自身疗效与AVI的抑酶作用结合，能更广泛且安全有效地对抗大多数MDR-GNB引起的感染[10]。目前CRE/CRKP对其耐药率低，但其广泛的体外活性、人们对头孢他啶比较熟悉以及耐药菌治疗药物选择严重受限等情况，可能会刺激临床对CAZ/AVI使用。本研究结果对包括392例患者的5项队列研究进行了统计分析，对CAZ/AVI治疗碳青霉烯类耐药菌感染的疗效和安全性进行了系统评价，可为临床治疗CRE/CRKP感染提供循证支持，同时可作为评价CAZ/AVI用于MDR-GNB复杂感染的系统评价的最新补充。
疗效方面，CAZ/AVI组患者临床治愈率优于对照组，CAZ/AVI组患者28 d/30 d全因病死率低于对照组，差异均有统计学意义；两组患者临床缓解率和感染复发率相当，差异无统计学意义。提示CAZ/AVI在治疗CRE/CRKP感染中疗效优于多粘菌素、替加环素、碳青霉烯类、氨基糖苷类等其他抗菌药物。Zhong等[11]通过Meta分析指出CAZ/AVI在治疗革兰阴性菌感染时，临床治愈率和细菌清除率与碳青霉烯类（多利培南、亚胺培南-西司他丁、美罗培南、厄他培南）相当，差异无统计学意义。亚组分析显示，与对照组相比，CAZ/AVI可显著提高CRE患者的临床治愈率和降低患者病死率，差异有统计学意义。同时，最新的研究[12]结果显示，在CRE感染患者治疗中，CAZ/AVI与新药美罗培南-法硼巴坦有相似的临床成功率。值得注意的是，有研究[13-14]发现，CAZ/AVI单用治疗CRE感染时常出现耐药性。
安全性方面，CAZ/AVI组患者AEs低于对照组，差异有统计学意义；两组患者SAEs相当，差异无统计学意义。研究报道[15]，阿维巴坦具有较低的潜在药物相互作用，其安全性和耐受性已在CAZ/AVI研发过程中的多个临床数据中确定，包括肾功能不全和接受药物联合治疗的受试者。多项关于CAZ/AVI的Meta分析结果显示，CAZ/AVI组与对照组患者发生不良事件包括严重不良事件相当。但在一些支持CAZ/AVI作为碳青霉烯类药物替代品的研究中，有报道不良事件发生率有所增加[16-17]。同时最新研究[18]结果表明，在ESBL阳性率为25%的肠杆菌科细菌中，CAZ/AVI组患者SAEs明显高于碳青霉烯类组。本文中安全性结果仅纳入2项研究，同时鉴于CAZ/AVI上市时间较短，且主要用于严重复杂感染患者，该药的安全性还有待进一步评估。
本研究经过广泛而全面的检索，通过系统评价合并扩大了样本量，除感染复发率外其他结局指标均无异质性，结果可信度较高。但因存在以下局限性，结论仍应被谨慎对待。第一，本研究纳入统计分析的患者样本量较少（<400）；第二，本研究纳入文献数量较少，且均为观察性研究，研究质量低于随机对照研究，且由于数据受限，所采用的研究数据都是未经过调整的混杂因素（如患者基础疾病、疾病的严重程度、感染源、敏感性实验折点、细菌对碳青霉烯类的MIC值等），各纳入研究对照组患者治疗方案及伴随疗法有所出入，这些都可能导致假阳性或假阴性结果；第三，本研究纳入研究的语种限制为中、英文，存在选择性偏倚。
综上所述，与多粘菌素、替加环素等常规抗CRE/CRKP感染治疗方案相比，CAZ/AVI抗生素可提高该类患者临床治愈率、有效降低28 d/30 d全因病死率，临床疗效较优。不良事件发生率显著低于对照组，但严重不良事件发生率相当，安全性略优。鉴于纳入研究数量较少、质量不高，本研究结论有待设计更优的大型临床随机对照试验来验证，以期为临床工作提供科学合理的参考。
The efficacy and safety of ceftazidime/avibactam therapy on carbapenem-resistant Enterobacteriaceae infections: a Meta-analysis
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摘要:
目的 系统评价头孢他啶/阿维巴坦（ceftazidime/avibactam，CAZ/AVI）治疗耐碳青霉烯类肠杆菌/肺炎克雷伯菌（CRE/CRKP）感染的疗效和安全性，以期为临床治疗提供循证依据。 方法 计算机检索PubMed、Embase、The Cochrane Library、CBM、CNKI、VIP电子数据库，收集从建库起至2020年5月公开发表的使用CAZ/AVI治疗CRE/CRKP感染的研究，由2名评价员独立按纳入与排除标准筛选文献、提取资料并评价纳入研究的方法学质量后，采用RevMan 5.3统计软件对结果进行分析。 结果 共纳入5篇英文文献，合计392例患者。结果显示有效性方面：CAZ/AVI组患者临床治愈率[OR=3.57, 95% CI(2.03, 6.26), P<0.00001]显著高于对照组。CAZ/AVI组患者28 d/30 d全因病死率[OR=0.27, 95% CI(0.14, 0.50), P<0.0001]显著低于对照组。两组患者临床缓解率[OR=1.92, 95% CI(0.93, 3.97), P=0.08]和感染复发率[OR=0.44, 95% CI(0.11, 1.85), P=0.26]无显著性差异。安全性方面：CAZ/AVI组患者不良事件（AEs） [OR=0.29, 95% CI(0.10, 0.80), P=0.02]显著低于对照组，两组患者严重不良事件（SAEs） [OR=0.33, 95% CI(0.09, 1.19), P=0.09]无显著性差异。 结论 当前证据表明，CAZ/AVI治疗碳青霉烯类耐药菌感染具有生存优势且并不增加SAEs，安全性好。受纳入研究质量和数量限制，上述结论有待更多高质量的RCT加以验证。 -
关键词:
- 头孢他啶/阿维巴坦 /
- 耐碳青霉烯类肠杆菌 /
- 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌 /
- 系统评价 /
- 荟萃分析
Abstract:Objective To systematically evaluate the efficacy and safety of ceftazidime/avibactam(CAZ/AVI) in the treatment of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae(CRE) or carbapenem-resistance Klebsiella pneumonia (CRKP), and to provide evidence-cased reference for clinic therapy. Methods A comprehensive literature search from PubMed, Embase, the Cochrane Library, CBM, CNKI and VIP database was conducted for the CAZ/AVI therapy on CRE/CRKP infections published before May.2020. Two reviewers independently screened literatures according to the inclusion and exclusion criteria, extracted data, and assessed the methodological quality of the included studies. The results were analyzed by RevMan 5.3 statistical software. Results Five studies in English involving 392 patients were included for the analysis. In terms of effectiveness, the results showed CAZ/AVI group significantly increased the clinical cure rate[OR=3.57, 95% CI (2.03, 6.26), P<0.00001] compared with the control group. Also CAZ/AVI group significantly decreased the 28/30 day all-cause mortality [OR=0.27, 95% CI (0.14, 0.50), P<0.0001]. There were no significant difference between the two groups in the clinical remission rate [OR=1.92, 95% CI (0.93, 3.97), P=0.08] and the infection recurrence rate [OR=0.44, 95% CI (0.11, 1.85), P=0.26]. In terms of safety, the incidence of adverse events in CAZ/AVI group were lower than those in control group [OR=0.29, 95% CI (0.10, 0.80), P=0.02]. There was no significant difference between two groups in the incidence of serious adverse events[OR=0.33, 95% CI (0.09, 1.19), P=0.09]. Conclusion The current evidence shows that CAZ/AVI therapy has advantage in survival rate for the treatment of CRE/CRKP infections without increase of SAEs. Limited by the quality and quantity of the included studies, the above conclusions need to be verified with more high-quality RCTs. -
奥卡西平(oxcarbazepine, OXC)是第二代抗癫痫药物，可用于儿童全面强直-阵挛发作，部分伴或不伴继发性全面发作的一线治疗[1]，其具有与传统的抗癫痫药物（AEDs）如苯妥英钠、卡马西平和丙戊酸钠相同的疗效，但其对肝药酶和自身的诱导作用小，药物间相互作用较少，临床上可用于替代传统的AEDs。OXC是卡马西平（carbamazepine, CBZ）的一种10-酮类衍生物，但两者之间的药动学存在差异，OXC的耐受性好且不良反应少[2]。OXC是无活性的前体药物，在体内经过肝脏内细胞溶质芳基酮还原酶的作用转化为具有药理活性的中间代谢产物单羟基卡马西平（monohydroxy carbamazepine, MHD）[3-4]。国际抗癫痫联盟推荐MHD血清浓度的参考范围为3～35 μg/ml[5]，有研究表明，当血药浓度高于30 μg/ml时，容易发生药物不良反应，且在许多患者中，不良反应间歇性的发生与MHD浓度的波动有关[6]。在临床用药中也发现OXC服药后的药物浓度个体化差异大，年龄、性别、体重、肝肾功能等均会影响MHD的药动学参数[7]，故需要对其血药浓度进行监测。本研究在参考既往研究的基础上[8-12]，对色谱条件进行了优化，并简化了血样处理的过程，建立了HPLC法测定OXC活性代谢产物MHD血药浓度的方法，该方法快速、简单、准确、选择性好、灵敏度高，为临床监测血药浓度、调整给药剂量提供了手段。
1. 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；H1850R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科仪器有限公司）；SHB-B95A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Discovery DV215CD型分析天平（美国OHAUS公司）；Vortex-5型涡旋混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2 材料
MHD对照品（美国CATO公司）；内标：奥硝唑（中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海科丰化学试剂有限公司）；空白血浆（医院血库提供）；超纯水（实验室自制）。
2. 实验方法
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），预柱为Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈（80:20，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μl；双波长检测：在192 nm处检测MHD，318 nm处检测奥硝唑。
2.2 溶液及血浆样品的配制
2.2.1 储备液的配制
精密称取MHD对照品10 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为1 mg/ml的储备液，置于−20 ℃下保存。
2.2.2 内标工作液的配制
精密称取奥硝唑1.4 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为140 μg/ml的内标工作液，置于−20 ℃下保存。
2.2.3 血浆标准曲线和质控样品的配制
分别精密量取适量储备液，用甲醇稀释成20、50、100、200、300、400、500 μg/ml浓度梯度的标准对照溶液。取以上6个标准对照溶液，加入适量空白血浆，得2、5、10、20、30、40、50 μg/ml系列浓度的血浆标准曲线样品。同法配制相应的低、中、高浓度的血浆质控样品（QC），使得MHD对应的浓度分别为5、15、40 μg/ml。
2.3 血浆样品的预处理
取200 μl血浆样品，加入200 μl内标工作液、400 μl甲醇，涡旋混合30 s，10 ℃条件下13 000 r/min离心10 min，取上清液直接进样。
3. 结果
3.1 专属性试验
通过考察6份不同生物来源的空白血浆样品色谱图、空白血浆样品加入MHD对照品和内标的色谱图，以及临床实际用药后的患者血浆样品色谱图，以此反映方法的专属性。由图1可见，在本实验条件下，被测物MHD与内标的色谱峰分离良好，且血浆中的内源性物质不干扰测定。MHD和内标的保留时间分别为9.5 min和6.1 min。
3.2 标准曲线与线性范围
取上述浓度为2、5、10、20、30、40、50 μg/ml的血浆标准曲线样品按“2.3”项下方法处理。经HPLC法分析，以测得OXC的峰面积与内标峰面积之比（Y）作为纵坐标，以血浆MHD浓度（X）为横坐标，得到回归方程为：Y=0.047 1X+0.022 2（r=0.998 6）。线性范围：根据标准曲线，MHD血药浓度在2～50 μg/ml范围内线性关系良好，其定量下限浓度为2 μg/ml。
3.3 日内、日间精密度和准确度
配制定量下限、低、中、高（2、5、15、40 μg/ml）4种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理后测定，连续测定3 d，以当天的标准曲线计算QC样品的测定浓度，计算日内、日间精密度以及准确度。经测定，MHD的日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，均符合生物样品的测定要求，结果见表1。
表 1 单羟基卡马西平日内、日间精密度和准确度（n=6）理论浓度
（μg/ml）实测浓度
（μg/ml）RSD（%） RE（%） 日内精密度 日间精密度 2 1.85±0.16 8.64 12.21 −3.63 5 4.93±0.24 4.86 7.68 −4.43 15 14.32±0.37 6.86 6.16 −3.11 40 41.80±1.26 3.03 5.33 0.59 3.4 提取回收率
配制低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理。同时另取18份空白血浆，除了不加系列对照品溶液和内标外，按“2.3”项下方法处理，在获得的上清液中加入MHD和内标溶液至相应浓度。进样分析，以每一浓度中2种不同处理方法的峰面积比值计算提取回收率。经测定，本法中MHD的平均提取回收率在89.62%～95.32%之间；内标的平均提取回收率为98.76%，符合生物学样品的分析要求，结果见表2。
表 2 单羟基卡马西平、MHD和内标提取回收率试验结果（n=6）化合物 浓度（μg/ml） 提取回收率（%） MHD 5 89.62±4.82 15 94.67±6.76 40 95.32±4.90 内标 140 98.76±5.92 3.5 稳定性试验
3.5.1 室温稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并在室温条件下放置4 h和10 h后测定样品血药浓度，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在室温下放置10 h后仍稳定，RSD均小于4.47%，RE值在1.50%～2.98%之间，结果见表3。
表 3 奥卡西平代谢产物单羟基卡马西平稳定性试验结果 (n=5)储存条件 理论浓度（μg/ml） 实测浓度（μg/ml） RSD（%） RE（%） 室温10 h 5 5.15±0.19 3.60 2.98 15 15.39±0.69 4.47 2.62 40 40.60±0.40 0.98 1.50 冻融3次 5 5.47±0.15 2.83 9.41 15 15.79±0.32 2.06 5.24 40 40.75±1.10 2.71 1.86 处理后36 h 5 5.39±0.27 5.09 7.74 15 15.66±0.58 3.70 4.39 40 39.46±1.80 4.57 −1.34 −20 ℃，30 d 5 5.16±0.23 4.39 3.19 15 14.62±0.39 2.64 −2.53 40 40.37±0.58 1.44 0.93 3.5.2 冻融稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并于−20 ℃冰箱中冷冻保存24 h后室温下解冻1 h后测定，反复冻融3次，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品反复冻融3次后仍能保持稳定，RSD均小于2.83%，RE值在1.86%～9.41%之间，结果见表3。
3.5.3 处理后的血浆样品在自动进样器中储存的稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆QC样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，然后放置在自动进样器内12 h、36 h后再次测定，求得RSD和RE值。经测定处理后的MHD血浆样品在进样器内放置36 h仍能保持稳定，RSD均小于5.09%，RE值在−1.34%～7.74%之间，结果见表3。
3.5.4 长期稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆质控样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，并置于−20 ℃冰箱中冻存30 d后取出解冻后测定，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在−20 ℃冰箱中冻存30 d后仍能保持稳定，RSD均小于4.39%，RE值在−2.53%～3.19%之间，结果见表3。
4. 讨论
目前，有关MHD的检测方法的文献很多，其中,高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法都有报道，后者虽有灵敏度高、专属性强的特点，但其仪器昂贵，且需专业人员进行操作，很难在大部分的医疗机构普及[13-15]。另外，国内外文献报道中多使用固液萃取法或液液萃取法进行血样的前处理，但这种处理过程相对复杂、耗时，且经济成本较高[11, 16]。本方法采用甲醇沉淀蛋白进行血样的前处理，建立了HPLC法测定人血浆中MHD血药浓度的方法，整个过程操作简单、快速，样品分析时间较短，适用于临床大量样品的连续检测。
文献报道的流动相有乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钾溶液（33∶67，V/V）[12]、水-乙腈（65∶35，V/V）[17]、水-甲醇-乙腈（64∶30∶6，V/V/V）[18]等。本方法采用了水-乙腈，按不同的配比进行试验，发现当水-乙腈的比例为80∶20时，色谱峰的峰形、出峰时间及分离度最佳。文献采用卡马西平[17]、苯巴比妥[19]和奥硝唑[20]等作为内标，本研究通过筛选发现奥硝唑的保留时间为6.1 min，不仅与MHD的保留时间相近，又能与其有很好的分离，且其性质稳定，满足内标的要求。
本实验建立的测定人血浆中OXC活性代谢产物MHD的HPLC法，MHD线性回归方程中的r=0.998 6，说明血药浓度在2～50 μg/ml范围内具有良好的线性关系，日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，MHD及内标的平均提取回收率在89.62%～98.76%之间。血浆样品的稳定性试验证明，在室温放置10 h、反复冻融、处理后放置进样器36 h以及低温保存30 d的情况下，样品未见明显降解，仍能保持稳定。本研究建立的HPLC法操作快速简单，精密度、回收率高，稳定性好，专属性强，不受血浆中内源性物质的干扰，结果准确可靠，且灵敏度高，适用于奥卡西平临床血药浓度的监测。
目前癫痫治疗主要以药物治疗为主，奥卡西平是第二代抗癫痫药物，我国诸多癫痫病专家也建议将其作为癫痫部分性发作和全面强直阵挛发作的首选药物[21]。但奥卡西平使用过程中可能出现瘙痒、荨麻疹、血管性水肿等超敏反应，包括Stevens Johnson综合征中毒性表皮坏死松解症[22]等，还可引起低钠血症、头晕、胃肠道不适等不良反应，有文献报道，其疗效及不良反应可能与血药浓度密切相关[23]，因此开展奥卡西平血药浓度的测定，能提高药物治疗的疗效，同时可以有效避免或减少可能产生的药物不良反应，提高癫痫患者服药的依从性。本研究建立了测定人血浆中MHD血药浓度的方法，应用于临床，为临床个体化给药提供依据，值得临床推广使用。
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表 1 纳入研究基本信息
纳入研究 中心情况 研究类型 研究时间（年） 分组及样本量 平均年龄（岁） 男性（%） 致病菌 观察时间（t/d） 给药方案 伴随疗法 结局指标 Shields[3]
2017单中心
（美国）回顾性 2009-2017 T（13） 66 54 CRKP 90 CAZ/AVI GEN ①③④⑤⑥⑦ C（96） 59 （57.3） CB+AG,CB+COL,其他疗法 Castón[4]
2017多中心（西班牙、以色列） 回顾性 2012-2016 T（8） 61 50 CRE 30 CAZ/AVI AM,CB,FOS,TGC,COL ①③ C（23） 59 （65.2） CB,AG,
BLIBL,TGC,
FOS,COLDuin[5] 2018 多中心
（美国）前瞻性 2011-2016 T（38） 57 61 CRE 30 CAZ/AVI TIG,AG,GEN,CB,FOS,
SXT①②③⑥⑦ C（99） 63 （42） COL Alraddadi[6]2019 单中心（沙特阿拉伯） 回顾性 2017-2018 T（10） 59.5 80 CRE 30 CAZ/AVI - ①②③⑤ C（28） 61.5 （57.1） COL,CB,TGC,AM,QU,SXT,AZT Tsolaki[7]
2019多中心
（希腊）回顾性 40个月 T（41） 61.9 68.3 CRE 28 CAZ/AVI - ①③⑤ C（36） 59.1 （77.3） 适当抗生素
治疗注：T：试验组；C：对照组。结局指标：①临床治愈率；②临床缓解率；③28 d/30 d全因病死率；④感染复发率；⑤AEs；⑥SAEs。CAZ/AVI：头孢他啶/阿维巴坦；CB：碳青霉烯类；AG：氨基糖苷类；GEN：庆大霉素；COL：多粘菌素E；TGC：替加环素；BLIBL：β-内酰胺酶抑制剂；FOS：磷霉素；QU：喹诺酮类；SXT：复方磺胺甲唑；AZT：氨曲南。 
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