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抗菌药物耐药性是一个全球性的公共卫生问题。碳青霉烯类抗生素被认为是治疗多重耐药菌感染的最后防线，但随着其在临床的广泛应用及不合理使用，导致耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）特别是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）激增，给临床抗感染治疗带来巨大挑战。
头孢他啶/阿维巴坦（ceftazidime/avibactam，CAZ/AVI）是一种新型β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂，研究表明，阿维巴坦在体外可抑制Ambler分类中的A类、C类和某些D类酶的活性，由于缺乏活性位点丝氨酸残基，对B类金属酶没有活性[1]。阿维巴坦可重新环化恢复活性从而可长效抑制β-内酰胺酶[2]，能够恢复或增强头孢他啶抗菌活性，CAZ/AVI组合具有广谱抗菌活性，对包括CRE在内的多重耐药革兰阴性杆菌（MDR-GNB）具有强有力的杀菌活性。CAZ/AVI于2015年在美国获批上市，随后在欧洲和中国获批上市。现已陆续被美国食品药品管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）和国家药品监督管理局（NMPA）批准用于成人治疗方案有限或无其他选择的G-菌感染的治疗。目前，有一些小样本的回顾性研究表明[3-7]，CAZ/AVI可能是治疗CRE/CRKP的有效替代品，但没有关于CAZ/AVI与其他抗菌药物用于CRE/CRKP的疗效和安全性比较的系统评价，以至于无法客观的评估两者之间的差异。本研究拟采用Meta分析方法，对国内外公开发表的CAZ/AVI治疗碳青霉烯类耐药菌感染的疗效和安全性研究进行系统评价，以期为CAZ/AVI的临床选用提供循证依据。
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计算机检索PubMed、Embase、Cochrane Library、中国生物医学文献数据库（CBM）、中国知网（CNKI）、维普中文科技期刊数据库（VIP），并在此基础上进行手工检索及追查纳入文献的参考文献。检索时限为各数据库建库起至2021年2月。中文检索词为：头孢他啶阿维巴坦；英文检索词为：“ceftazidime/avibactam”“carbapenem-resistanece Enterobacteriaceae（CRE）”“carbapenem-resistance Klebsiella pneumonia（CRKP）”“carbapenemase-producing Enterobacteriaceae（CPE）”。检索采取主题词和自由词相结合的方式检索，如PubMed检索式：(“avibactam, ceftazidime drug combination [Supplementary Concept]”OR“avibactam-ceftazidime”OR“ceftazidime-avibactam”OR“Avycaz”) AND (“carbapenem-resistanece enterobacteriaceae”OR“carbapenem-resistance klebsiella pneumonia”OR“carbapenemase-producing enterobacteriaceae”)。
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①研究类型：收集所有类型的中、英文临床研究，包括随机对照研究、队列研究、病例对照研究、有对照的病例报告（样本量≥10）。②研究对象：年龄≥18岁，临床确诊为CRE/CRKP感染患者，性别不限。③干预措施：试验组患者接受CAZ/AVI抗感染治疗，给药时间≥24 h，用法用量及疗程不等；对照组为其他常规抗菌药物，如多粘菌素或替加环素或碳青霉烯类或β-内酰胺酶抑制剂或氨基糖苷类等抗感染治疗。④结局指标：临床治愈率、临床缓解率、28 d/30 d全因病死率、感染复发率、不良事件发生率（adverse events，AEs）和严重不良事件发生率（SAEs）。
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①重复发表或数据重复的文献；②报道信息太少、质量差及数据无法利用或错误的文献；③会议论文、病例报告和病例系列（样本量<10）、动物实验、体外实验。
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由2名研究者通过阅读标题和摘要对检索所得文献进行初选和去重，再阅读全文并按照纳入与排除标准独立确定纳入文献。如有分歧则讨论解决，必要时提请第三方仲裁。提取数据包括第一作者及发表年限；研究设计类型；纳入人群的基本特征（分组及样本量、年龄、性别、耐药菌等）；抗菌药物给药方案和结局指标。
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由两位评价者依据纽卡斯尔-渥太华量表[8]（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）对纳入研究进行质量评价，如存在分歧则讨论决定。NOS主要包括研究人群选择、组间可比性和结果测量3个项目共8个条目，对文献质量的评价采用星级系统的半量化原则，该量表以星数代表分值，满分为9颗星。评分>6颗星为高质量研究，评分6颗星为中等质量研究，评分<6颗星为低质量研究[9]。NOS评分≥6颗星的文献方可纳入研究。
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采用Cochrane协作网提供的RevMan 5.3统计软件进行Meta分析。本研究所有结局指标均为计数资料，故采用效应量比值比（OR）及其95%置信区间（CI）表示。采用χ2检验分析各研究结果间的统计学异质性，若各研究结果间异质性无统计学意义（P>0.10或I2<50%），则采用固定效应模型进行Meta分析，反之，则采用随机效应模型进行Meta分析。
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初筛得到相关文献564篇，其中，英文文献486篇（PubMed 315篇、Embase 83篇、Cochrane Library 88篇），中文文献78篇（CBM 28篇、CNKI 27篇、VIP 23篇）。剔除重复文献后获得248篇，阅读标题后排除与CAZ/AVI治疗CRE/CRKP/CPE感染不相关文献227篇。阅读剩余文献摘要，排除结局指标缺失或指标不相关文献33篇，得到文献11篇。阅读全文剔除样本量<10的文献后，最终纳入5篇英文文献[3-7]进入本研究。共计患者392例，其中，试验组110例，对照组282例。其中，1项为前瞻性研究，4项为回顾性研究。4项研究为CRE感染，1项研究为CRKP感染，4项CRE研究进行了碳青霉烯酶检测确定绝大部分菌株产KPC酶。纳入研究的基本信息见表1。
表 1 纳入研究基本信息
纳入研究 中心情况 研究类型 研究时间（年） 分组及样本量 平均年龄（岁） 男性（%） 致病菌 观察时间（t/d） 给药方案 伴随疗法 结局指标 Shields[3]
2017单中心
（美国）回顾性 2009-2017 T（13） 66 54 CRKP 90 CAZ/AVI GEN ①③④⑤⑥⑦ C（96） 59 （57.3） CB+AG,CB+COL,其他疗法 Castón[4]
2017多中心（西班牙、以色列） 回顾性 2012-2016 T（8） 61 50 CRE 30 CAZ/AVI AM,CB,FOS,TGC,COL ①③ C（23） 59 （65.2） CB,AG,
BLIBL,TGC,
FOS,COLDuin[5] 2018 多中心
（美国）前瞻性 2011-2016 T（38） 57 61 CRE 30 CAZ/AVI TIG,AG,GEN,CB,FOS,
SXT①②③⑥⑦ C（99） 63 （42） COL Alraddadi[6]2019 单中心（沙特阿拉伯） 回顾性 2017-2018 T（10） 59.5 80 CRE 30 CAZ/AVI - ①②③⑤ C（28） 61.5 （57.1） COL,CB,TGC,AM,QU,SXT,AZT Tsolaki[7]
2019多中心
（希腊）回顾性 40个月 T（41） 61.9 68.3 CRE 28 CAZ/AVI - ①③⑤ C（36） 59.1 （77.3） 适当抗生素
治疗注：T：试验组；C：对照组。结局指标：①临床治愈率；②临床缓解率；③28 d/30 d全因病死率；④感染复发率；⑤AEs；⑥SAEs。CAZ/AVI：头孢他啶/阿维巴坦；CB：碳青霉烯类；AG：氨基糖苷类；GEN：庆大霉素；COL：多粘菌素E；TGC：替加环素；BLIBL：β-内酰胺酶抑制剂；FOS：磷霉素；QU：喹诺酮类；SXT：复方磺胺甲唑；AZT：氨曲南。 -
依据NOS对5项观察性研究进行质量评价，NOS评分均为6颗星，符合纳入Meta分析标准。
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5项研究[3-7]报道了临床治愈率，各研究间无统计学异质性（I2=0%，P=0.40），选择固定效应模型分析，结果显示，CAZ/AVI组患者临床治愈率高于对照组，结果有统计学意义[OR=3.57，95% CI(2.03，6.26)，P<0.00001]，见图1。
图 1 两组患者临床治愈率的森林图
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两项研究[5-6]报道了临床缓解率，各研究间无统计学异质性（I2=0%，P=0.45），选择固定效应模型分析，结果显示两组患者临床缓解率相当，结果无统计学意义[OR=1.92，95% CI(0.93，3.97)，P=0.08]。
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5项研究[3-7]报道了28 d/30 d全因病死率，各研究间无统计学异质性（I2=0%，P=0.63），选择固定效应模型分析，结果显示CAZ/AVI组患者28 d/30 d全因病死率低于对照组，结果有统计学意义[OR=0.27，95% CI(0.14，0.50)，P<0.0001]，见图2。
图 2 两组患者28 d/30 d全因病死率的森林图
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3项研究[3, 5-6]报道了感染复发率，各研究间有统计学异质性（I2=61%，P=0.08），选择随机效应模型分析，结果显示两组患者感染复发率相当，结果无统计学意义[OR=0.44，95% CI(0.11,1.85)，P=0.26]。
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2项研究[3, 5]分别报道了不良事件（AEs）和严重不良事件（SAEs），各研究间均无统计学异质性（I2=0%，P=0.43）和（I2=0%，P=0.46），选择固定效应模型分析，结果显示，CAZ/AVI组患者AEs低于对照组，结果有统计学意义[OR=0.29,95% CI(0.10,0.80), P=0.02]。两组患者SAEs相当，结果无统计学意义[OR=0.33,95% CI(0.09,1.19), P=0.09]，见图3。
图 3 两组患者AEs和SAEs的森林图
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由于缺乏有效和安全的替代治疗方案，碳青霉烯类抗生素耐药性的上升尤其令人担忧，临床迫切需要新的抗菌药物来解决耐药性带来的治疗难题。CAZ/AVI是第三代头孢菌素和新型的非β-内酰胺类的β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦相结合的抗生素，将CAZ的自身疗效与AVI的抑酶作用结合，能更广泛且安全有效地对抗大多数MDR-GNB引起的感染[10]。目前CRE/CRKP对其耐药率低，但其广泛的体外活性、人们对头孢他啶比较熟悉以及耐药菌治疗药物选择严重受限等情况，可能会刺激临床对CAZ/AVI使用。本研究结果对包括392例患者的5项队列研究进行了统计分析，对CAZ/AVI治疗碳青霉烯类耐药菌感染的疗效和安全性进行了系统评价，可为临床治疗CRE/CRKP感染提供循证支持，同时可作为评价CAZ/AVI用于MDR-GNB复杂感染的系统评价的最新补充。
疗效方面，CAZ/AVI组患者临床治愈率优于对照组，CAZ/AVI组患者28 d/30 d全因病死率低于对照组，差异均有统计学意义；两组患者临床缓解率和感染复发率相当，差异无统计学意义。提示CAZ/AVI在治疗CRE/CRKP感染中疗效优于多粘菌素、替加环素、碳青霉烯类、氨基糖苷类等其他抗菌药物。Zhong等[11]通过Meta分析指出CAZ/AVI在治疗革兰阴性菌感染时，临床治愈率和细菌清除率与碳青霉烯类（多利培南、亚胺培南-西司他丁、美罗培南、厄他培南）相当，差异无统计学意义。亚组分析显示，与对照组相比，CAZ/AVI可显著提高CRE患者的临床治愈率和降低患者病死率，差异有统计学意义。同时，最新的研究[12]结果显示，在CRE感染患者治疗中，CAZ/AVI与新药美罗培南-法硼巴坦有相似的临床成功率。值得注意的是，有研究[13-14]发现，CAZ/AVI单用治疗CRE感染时常出现耐药性。
安全性方面，CAZ/AVI组患者AEs低于对照组，差异有统计学意义；两组患者SAEs相当，差异无统计学意义。研究报道[15]，阿维巴坦具有较低的潜在药物相互作用，其安全性和耐受性已在CAZ/AVI研发过程中的多个临床数据中确定，包括肾功能不全和接受药物联合治疗的受试者。多项关于CAZ/AVI的Meta分析结果显示，CAZ/AVI组与对照组患者发生不良事件包括严重不良事件相当。但在一些支持CAZ/AVI作为碳青霉烯类药物替代品的研究中，有报道不良事件发生率有所增加[16-17]。同时最新研究[18]结果表明，在ESBL阳性率为25%的肠杆菌科细菌中，CAZ/AVI组患者SAEs明显高于碳青霉烯类组。本文中安全性结果仅纳入2项研究，同时鉴于CAZ/AVI上市时间较短，且主要用于严重复杂感染患者，该药的安全性还有待进一步评估。
本研究经过广泛而全面的检索，通过系统评价合并扩大了样本量，除感染复发率外其他结局指标均无异质性，结果可信度较高。但因存在以下局限性，结论仍应被谨慎对待。第一，本研究纳入统计分析的患者样本量较少（<400）；第二，本研究纳入文献数量较少，且均为观察性研究，研究质量低于随机对照研究，且由于数据受限，所采用的研究数据都是未经过调整的混杂因素（如患者基础疾病、疾病的严重程度、感染源、敏感性实验折点、细菌对碳青霉烯类的MIC值等），各纳入研究对照组患者治疗方案及伴随疗法有所出入，这些都可能导致假阳性或假阴性结果；第三，本研究纳入研究的语种限制为中、英文，存在选择性偏倚。
综上所述，与多粘菌素、替加环素等常规抗CRE/CRKP感染治疗方案相比，CAZ/AVI抗生素可提高该类患者临床治愈率、有效降低28 d/30 d全因病死率，临床疗效较优。不良事件发生率显著低于对照组，但严重不良事件发生率相当，安全性略优。鉴于纳入研究数量较少、质量不高，本研究结论有待设计更优的大型临床随机对照试验来验证，以期为临床工作提供科学合理的参考。
The efficacy and safety of ceftazidime/avibactam therapy on carbapenem-resistant Enterobacteriaceae infections: a Meta-analysis
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摘要:
目的 系统评价头孢他啶/阿维巴坦（ceftazidime/avibactam，CAZ/AVI）治疗耐碳青霉烯类肠杆菌/肺炎克雷伯菌（CRE/CRKP）感染的疗效和安全性，以期为临床治疗提供循证依据。 方法 计算机检索PubMed、Embase、The Cochrane Library、CBM、CNKI、VIP电子数据库，收集从建库起至2020年5月公开发表的使用CAZ/AVI治疗CRE/CRKP感染的研究，由2名评价员独立按纳入与排除标准筛选文献、提取资料并评价纳入研究的方法学质量后，采用RevMan 5.3统计软件对结果进行分析。 结果 共纳入5篇英文文献，合计392例患者。结果显示有效性方面：CAZ/AVI组患者临床治愈率[OR=3.57, 95% CI(2.03, 6.26), P<0.00001]显著高于对照组。CAZ/AVI组患者28 d/30 d全因病死率[OR=0.27, 95% CI(0.14, 0.50), P<0.0001]显著低于对照组。两组患者临床缓解率[OR=1.92, 95% CI(0.93, 3.97), P=0.08]和感染复发率[OR=0.44, 95% CI(0.11, 1.85), P=0.26]无显著性差异。安全性方面：CAZ/AVI组患者不良事件（AEs） [OR=0.29, 95% CI(0.10, 0.80), P=0.02]显著低于对照组，两组患者严重不良事件（SAEs） [OR=0.33, 95% CI(0.09, 1.19), P=0.09]无显著性差异。 结论 当前证据表明，CAZ/AVI治疗碳青霉烯类耐药菌感染具有生存优势且并不增加SAEs，安全性好。受纳入研究质量和数量限制，上述结论有待更多高质量的RCT加以验证。 -
关键词:
- 头孢他啶/阿维巴坦 /
- 耐碳青霉烯类肠杆菌 /
- 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌 /
- 系统评价 /
- 荟萃分析
Abstract:Objective To systematically evaluate the efficacy and safety of ceftazidime/avibactam(CAZ/AVI) in the treatment of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae(CRE) or carbapenem-resistance Klebsiella pneumonia (CRKP), and to provide evidence-cased reference for clinic therapy. Methods A comprehensive literature search from PubMed, Embase, the Cochrane Library, CBM, CNKI and VIP database was conducted for the CAZ/AVI therapy on CRE/CRKP infections published before May.2020. Two reviewers independently screened literatures according to the inclusion and exclusion criteria, extracted data, and assessed the methodological quality of the included studies. The results were analyzed by RevMan 5.3 statistical software. Results Five studies in English involving 392 patients were included for the analysis. In terms of effectiveness, the results showed CAZ/AVI group significantly increased the clinical cure rate[OR=3.57, 95% CI (2.03, 6.26), P<0.00001] compared with the control group. Also CAZ/AVI group significantly decreased the 28/30 day all-cause mortality [OR=0.27, 95% CI (0.14, 0.50), P<0.0001]. There were no significant difference between the two groups in the clinical remission rate [OR=1.92, 95% CI (0.93, 3.97), P=0.08] and the infection recurrence rate [OR=0.44, 95% CI (0.11, 1.85), P=0.26]. In terms of safety, the incidence of adverse events in CAZ/AVI group were lower than those in control group [OR=0.29, 95% CI (0.10, 0.80), P=0.02]. There was no significant difference between two groups in the incidence of serious adverse events[OR=0.33, 95% CI (0.09, 1.19), P=0.09]. Conclusion The current evidence shows that CAZ/AVI therapy has advantage in survival rate for the treatment of CRE/CRKP infections without increase of SAEs. Limited by the quality and quantity of the included studies, the above conclusions need to be verified with more high-quality RCTs. -
乳腺癌是多发于女性中的恶性肿瘤性疾病，威胁着广大女性的健康[1-2]。据统计，全球女性癌症中，乳腺癌发病率和致死率均高于肺癌，目前居于首位，2020年约230万人诊断出患有乳腺癌，致死病例约68.5万[3]。先天性因素、膳食、环境、工作、发育成长阶段及雌激素类药物等多种因素都能成为乳腺癌的诱发因素[4-5]。目前，乳腺癌早期诊断普遍使用的是影像学检查（临床乳腺体格检查、超声、乳腺X线摄影、磁共振成像等）[6]以及肿瘤标志物(CEA、CA153、VEGF、TSGF等)临床筛查[7]，前者操作复杂且具有一定的组织伤害性[8]，后者局限于需多项联合检测且特异性不高[7，9]，均难以满足临床需求。尽管手术、化疗技术在不断提高，但是抗肿瘤药物疗效有限，乳腺癌患者预后效果不佳，尤其是晚期复发和转移普遍。因此，寻找乳腺癌细胞早期代谢生物标志物，进行安全灵敏的早期诊断，对于乳腺癌诊疗具有重要意义[10]。
作为继基因组学、转录组学、蛋白质组学的后起之秀，代谢组学以研究不同病理生理或基因突变条件下对机体内源性小分子化合物代谢变化为核心[11]。内源性小分子化合物是基因和蛋白质的下游产物，从分子生物层面实时动态地反映上游基因及外部因素对机体功能的影响[12]。代谢组学采用以高灵敏度、高通量为特征的现代仪器分析技术方法，对机体的内源性小分子化合物进行动态分析[13]。伴随乳腺癌发展，患者机体内与氨基酸、糖类、脂质等代谢有关的小分子代谢物会发生异常变化。利用代谢组学方法，将改变的内源性代谢物作为生物标志物，在此基础上寻找相关代谢途径，合理推测乳腺癌的发病机制，揭示生物标志物与乳腺癌发生发展间的关联，最终帮助乳腺癌的临床诊疗。本文主要综述代谢组学在乳腺癌早期诊断、药理研究与药效评估、疾病进程监测以及预后评估的研究进展。
1. 代谢组学概述
代谢组学以相对分子质量<1000的内源性代谢物为研究对象，研究样本包括血浆、尿液、唾液、脑脊液、细胞以及组织提取液等[14-16]，其中，血液和尿液最为常见[17]，研究思路为收集生物样品、样品分离、检测鉴定、分析数据、建立模型、获取细胞活动终产物信息，整个过程综合分析优势明显。按照研究目的分类，非靶向代谢组学和靶向代谢组学是两种常见策略[18]，前者进行轮廓分析，旨在获得较多的生物体内源性代谢物[12]，后者通过靶向分析，希望获得特定的内源性代谢物[19]。
代谢组学目前主流的仪器分析方法为核磁共振法(NMR)和质谱（MS）联用技术，后者主要包括液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[20]，以上分析技术各有其特点。NMR可获取大量的物质结构信息，所得样品分析无偏向、无损伤但灵敏度较低[21]。MS通过有损的离子化分析，提供物质分子量及结构信息，灵敏度更高、扫描速度快[22]，常与色谱在线联用以实现分离分析功能。GC-MS灵敏度高但不适用于热稳定性差的样品的分析，LC-MS则克服了GC-MS的劣势，可分析难挥发、热不稳定物质，分离选择性好、效率高，分析时间也随超高液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）的推广得到进一步缩短，因此LC-MS实际应用范围更广[19，23]。近年来质谱成像（MSI）技术发展迅速，随之空间代谢组学作为代谢组学新的补充诞生，解决了传统代谢组学研究代谢物在组织中的空间信息缺失问题[24-26]。
代谢组学的数据分析步骤为数据预处理、数据归一化和数据统计，即通过数据的过滤、补齐、归一化等去除仪器或生物偏差后，利用统计方法处理代谢组数据，其中，统计方法是从高维复杂的数据中提取出有效信息的关键。统计方法按照变量的多少分为单变量统计方法和多变量统计方法。常用的单变量统计方法有t检验、非参数检验、方差分析，主要用于实验-对照类研究中寻找两组间的差异代谢物[27]。多变量分析方法有传统算法和机器算法两类，常用的传统算法有偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）[28]及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA)、主成分分析（PAC），以上又称为模式识别方法，适用于构建预测模型[29]。机器算法应用日益广泛[30]，目前常用的有随机森林（RF）[31]、支持向量机(SVM)[32]、神经网络(ANNs)[33]等。经以上手段获取具有统计学意义的数据，再与多种生化及代谢的数据库对比，继而对所得物质筛选鉴定，最终寻找到潜在的代谢标志物。
2. 代谢组学在乳腺癌中的应用
2.1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中的应用
Catarina等[34]采用核磁共振氢谱（1H-NMR）分析了40位BC患者和38位对照（CTL）健康志愿者尿液代谢谱，采用K-S非参数检验和t检验及OPLS-DA等模式识别方法，发现BC患者肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等代谢物表现出高敏感性和特异性，代谢途径分析表明，差异代谢物出现可能与BC患者甘氨酸、谷氨酸、丁酸、糖酵解、TCA循环、牛磺酸和丙酮酸代谢途径遭到破坏有关。获得的差异代谢物具有作为生物标志物的潜力，可将BC患者与CTL区分，应用于早期诊断。
约1/4乳腺癌细胞都是三阴性乳腺癌细胞（TNBC），其特点是易转移浸润且复发率高[16]。Fang等[35]基于早期发现的40种氨基酸目标化合物，使用亲水作用色谱法-串联质谱（HILIC-MS/MS），对TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞36种细胞内和34种细胞外小分子物质进行代谢组学分析。运用Mann–Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验及OPLS-DA模式识别方法研究，发现与正常细胞相比，两种乳腺癌细胞氨基酸代谢库均明显扩大；与非TNBC相比，TNBC细胞内谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、N-乙酰丝氨酸和N-乙酰甲硫氨酸代谢明显增加(变化倍数>2，P<0.01, VIP>1)，TNBC对细胞外谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸和赖氨酸摄取显著增加，对谷氨酸和L-半胱氨酸-谷胱甘肽排泄升高(P<0.01，VIP>1)。研究结果表明，TNBC细胞具有独特的氨基酸代谢特征，对其量化分析可为TNBC患者提供更多新的早期治疗目标靶点。
Daniele等[36]使用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF/MS），对23名BC患者和35名口腔健康妇女唾液进行非靶向代谢组学分析，使用t检验、卡方检验等单因素统计方法，对比METLIN数据库，鉴定出乳腺癌组中有31种化合物上调（P<0.05），其中，患者与健康人群相比，发现7种寡肽（H-Arg-Arg-Ser-OH，H-His-Lys-(Ala-Ser)-OH or (Gly-Thr)-OH，H-Ala-Lys-Phe-Trp-OH or H-Gly-Lys-Thr-Ser-OH or H-Arg-Arg-Ser-Ser-OH，H-Phe-Ile-Gln-Arg-OH，H-Glu-Phe-Gln-Arg-OH or H-Ile-Lys-Gln-Trp-OH，H-Phe-Lys-Lys-Trp-OH or H-Phe-Gln-Arg-Tyr-OH，H-Phe-Phe-Gln-Trp-OH）和6种甘油磷脂（PG14∶2、PA32∶1、PS28∶0、PS40∶6、PI31∶1、PI38∶7）表达上调，表现出明显的代谢差异，说明唾液代谢物有望区分乳腺癌患者和健康人群，适用于早期诊断。
依据不同亚型乳腺癌患者的代谢物差异性可以用于乳腺癌诊断甚至个性化治疗。Leticia等[37]采集了4种常见LA型、LB型、HER2+型和TN型乳腺癌患者和健康对照组的血浆样本，利用非靶向超高液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）代谢组学方法进行分析，通过单变量非参数Wilcoxon秩和检验区分乳腺癌患者和健康受试者的数据差异，多变量PAC和PLS-DA评价统计模型质量，初步确定了4种乳腺癌分子亚型中变化显著的代谢物：LA，TN和HER2分子亚型患者血浆中L-色氨酸浓度显著降低，可能与L-色氨酸代谢激活芳烃受体帮助癌细胞免疫逃逸有关[38]；4种亚型乳腺癌患者磷酸乙醇胺、磷脂血浆浓度降低，提示乳腺癌中脂质代谢差异具有重要意义。上述代谢组学数据表明，色氨酸和部分脂质具有作为乳腺癌诊断的生物标志物潜力，有望推动乳腺癌患者血浆诊断和个性化治疗的发展。
基于以上研究，笔者对代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现部分特征代谢物的应用进行归纳总结，见表1。
表 1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现的特征代谢物作者 样本来源 技术方法 统计学方法 特征代谢物 Catarina等 尿液 1H-NMR K-S非参数检验和t检验与PAC,PLS-DA和OPLS-DA 肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、
α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等Fang等 TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞 HILIC-MS/MS Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验与OPLS-DA 胞内：谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、
N-乙酰丝氨酸、N-乙酰甲硫氨酸
胞外：谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸、赖氨酸谷氨酸、
L-半胱氨酸-谷胱甘肽Daniele等 唾液 UPLC-Q-TOF-MS t检验、卡方检验等 7种寡肽和6种甘油磷脂 Leticia等 血浆 HPLC-HRMS 非参数Wilcoxon秩和检验、PAC、PLS-DA 色氨酸、磷酸乙醇胺、磷脂 综上所述，基于代谢组学，针对不同乳腺癌患者所能提供的研究样品，采用合适的仪器、数据分析方法获取差异显著的内源性小分子代谢物信息，有效减小检查手段对乳腺癌患者造成的机体损伤，并丰富乳腺癌早期诊断方法，使代谢组学成为乳腺癌早期诊断的有力辅助工具。
2.2 代谢组学在乳腺癌药理研究和药效评价中的应用
癌细胞无限增殖需要大量的能量和物质基础。癌细胞具有特殊的代谢方式，即在有氧条件下倾向于糖酵解而不是三羧酸循环来产生能量[39]，这种新陈代谢重编程称为Warburg效应[40]。一方面，糖酵解中间产物可以合成肿瘤细胞生长所需蛋白质和脂质等生物大分子[41]，同时线粒体损伤可限制丙酮酸进入，使更多丙酮酸在胞质内通过无氧氧化释放能量[42]。另一方面，癌细胞可持续摄取营养物质[43]以及通过加强糖异生途径弥补Warburg效应缺陷。基于癌细胞特殊的代谢重编程，通过药物代谢组学分析，监测机体用药后内源小分子代谢物变化有利于乳腺癌药理研究和药效评估。
Ghanem等[44]对经抗坏血酸处理的管腔和基底样乳腺癌细胞，进行了代谢组学分析，结合细胞存活率数据，发现高剂量抗坏血酸使得乳腺癌细胞糖酵解过程中磷酸丙糖途径（PPP）被严重破坏，ATP水平下降，代谢物重新定向积累为脂质小滴，以及磷酸戊糖途径中代谢物和酶活性增加；细胞死亡依赖于抗坏血酸诱导的氧化应激和ROS积累、DNA损伤以及细胞内辅助因子(包括NAD+/NADH)耗竭效应。综上表明，高剂量抗坏血酸通过诱发乳腺癌细胞“氧化还原危机和能量灾难”发挥细胞毒作用。
Arminan等[45]通过NMR技术检测及主成分分析方法分析处理数据，以评估在N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-阿霉素共聚物（HPMA-Dox）影响下体外细胞培养模型和体内原位乳腺癌模型的精准抗癌效果，并结合蛋白质表达和流式细胞技术，研究了给药前后原位乳腺癌患者内源性小分子化合物相关生化改变，发现与游离Dox给药相比，用HPMA-Dox进行治疗后，乳腺癌细胞凋亡增加，糖酵解减弱，磷脂水平降低，且HPMA-Dox在体内模型的血液循环时间增加，同时肿瘤储积高、心脏储积低，说明HPMA-Dox药代动力学加强、组织分布得以优化。提示HPMA-Dox可作为一种更精确的抗癌药物模式用于乳腺癌临床治疗。
Panis等[14]将120名单侧乳腺浸润性癌患者随机分为未经化疗组(CA组，n=50)、单剂量短期紫杉醇静脉滴注组(PTX组，n=30)、心脏剖面健康组(CTR组，n=40)，采用LC-MS对其血浆样品进行分析后发现，与CA组乳腺癌患者相比，单剂量短期紫杉醇静脉滴注可使患者血浆高密度脂蛋白水平显著降低，过氧化氢水平升高；与CTR组相比，PTX组患者C反应蛋白和肌酸激酶分数明显升高。以上表明单剂量短期紫杉醇静脉滴注就足以引起脂质代谢显著改变，可能导致毒性累积效应，进一步增加乳腺癌患者心脏病发生风险。可见，代谢组学可参与化疗药物给药优化方案研究，提高药物抗癌效果。
左旋肉碱、酰基肉碱和相关酶是癌症代谢网络中的重要介质。以往研究中LC-MS对乳腺癌中左旋肉碱、酰基肉碱的研究都是均质组织分析，缺乏异质性癌症组织中肉碱的空间分布差异[46]。Sun等[47]利用MSI对异种移植小鼠模型和人类癌组织样本及正常组织中的17种肉碱进行成像并开发了高空间分辨率基质辅助激光解吸电离-质谱成像（MALDI-MSI）方法，发现由170个癌症样本和128个正常样本组成的肉碱谱模型能准确区分乳腺癌，L-肉碱和短链酰基肉碱在人类乳腺癌和异种移植小鼠模型中都有显著改变，乳腺癌中由肉碱系统介导的β氧化代谢途径改变，并且首次发现代谢酶CPT2和CRAT在乳腺癌组织中差异表达。证明肉碱代谢在乳腺癌的代谢物和酶水平上都被重新编程。
2.3 代谢组学在乳腺癌疾病进程监测及预后评估中的应用
心理神经病症(PN)是指许多乳腺癌患者在化疗期间及化疗之后出现疼痛、疲劳和抑郁症状。Debra等[48]使用液相色谱高分辨率质谱法对19位早期乳腺癌女性化疗前后血清样本分别进行非靶向和靶向代谢组学分析，非靶向分析发现化疗后乳腺癌患者乙酰-L-丙氨酸和硫酸吲哚酚浓度升高，5-氧代-L-脯氨酸浓度降低；色氨酸途径靶向分析表明尿氨酸水平、犬尿氨酸/色氨酸水平升高。t检验和Pearson相关系数进一步揭示上述差异代谢物与PN症状显著相关，促进了早期乳腺癌女性PN症状发展程度生物学机制研究。
研究表明，患者他莫昔芬体内代谢物因多昔芬浓度与雌激素受体α(ERα)阳性乳腺癌复发有关[49]，同时他莫昔芬本身和其他代谢物也表现出抗雌激素抗肿瘤活性[50]。Vries等[50]用细胞增殖法测定他莫昔芬、(Z)-因多昔芬、(Z)-4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬抗刺激素活性，建立抗雌激素活性评分模型(AAS)，采用Cox回归方法研究AAS与复发的关系，证明因多昔芬浓度可作为他莫昔芬和代谢物抗雌激素作用的代替，与乳腺癌复发显著相关。
Kamil等[51]用LC-MS/MS对小鼠原位接种4T1转移性乳腺癌细胞进行血浆代谢组学分析和脂质组学分析，建立PLS-DA模型。结果显示，荷癌小鼠癌细胞早期转移表现为L-精氨酸代谢减弱，精氨酸酶和多胺合成增强；晚期转移表现为精氨酸代谢途径改变，不对称二甲基精氨酸血浆浓度升高，能量代谢重新编程为糖酵解，戊糖磷酸途径加速以及三羧酸循环速率降低，脂质分布模式改变，包括总磷脂酰胆碱减少，与二酯结合的磷脂分数减少以及溶血磷脂增加，以上代谢变化在一定程度上表征了癌症转移进展。
目前，OncotypeDX 21基因表达检测技术常用来评估乳腺癌的复发以指导乳腺癌治疗，但在临床的不确定性和基因组不一致的情况下，许多早期乳腺癌的患者仍然会受到过度治疗[52-54]。McCartney等[55]利用1H-NMR分析了87例内分泌受体阳性、HER2阴性早期乳腺癌（eBC）患者血清，使用RF建立eBC患者复发风险的统计模型。最终根据代谢组学特征进一步细分复发风险，并有效区分了每个Oncotype风险分类：在7例复发中代谢组学分析准确预测了其中的6例，1例复发发生在低风险组，3例发生在中风险组，3例发生在高风险组，成功建立了一种通过血清代谢组学分析进一步完善OncotypeDX基因检测风险评分的方法。
3. 总结与展望
乳腺癌在全球发病率日益上升，长期困扰广大女性健康，成为全球医疗卫生领域研究焦点[56]。目前，乳腺癌的早期诊断、药物开发应用以及预后测评等方面还需攻克众多难关，迫切需要新的研究技术的支持。代谢组学以高通量、高灵敏度为特征的技术在乳腺癌领域应用日趋广泛，为乳腺癌潜在代谢标志物的筛选，药物靶点发现、药物潜在作用机制等提供新思路[11]。与其他研究方法相比，代谢组学具有无创取样、研究对象相对简单、检测工作量较小、可实现实时监测、全面综合分析等明显优势。同时，代谢组学作为一门新兴组学，虽然已取得部分进展，但本身发展仍处于探索阶段，应用于临床实践还有所不足：代谢组学研究具有数据维度高的特点，采集与处理过程中可能存在信息丢失、低含量差异代谢物可能被掩盖的问题；数据库不够完善，目前大量未知代谢物的结构鉴定和细胞功能研究困难，对已鉴定出产物的变化机制研究大多仍不明确难以直接指导临床；联用技术操作和数据分析处理的综合性专业人才储备不足等。在精准医疗浪潮推动下，进一步完善代谢组学研究的标准化流程后，利用代谢组学与基因组学、转录组学、蛋白组学以及微生物菌群学[57]对乳腺癌进行多学科技术互补、大数据综合分析，将有利于乳腺癌的早期诊断、发病机制研究以及疾病预后相关诊疗方案的系统优化，为乳腺癌个性化靶向治疗提供更合理的科学指导。
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表 1 纳入研究基本信息
纳入研究 中心情况 研究类型 研究时间（年） 分组及样本量 平均年龄（岁） 男性（%） 致病菌 观察时间（t/d） 给药方案 伴随疗法 结局指标 Shields[3]
2017单中心
（美国）回顾性 2009-2017 T（13） 66 54 CRKP 90 CAZ/AVI GEN ①③④⑤⑥⑦ C（96） 59 （57.3） CB+AG,CB+COL,其他疗法 Castón[4]
2017多中心（西班牙、以色列） 回顾性 2012-2016 T（8） 61 50 CRE 30 CAZ/AVI AM,CB,FOS,TGC,COL ①③ C（23） 59 （65.2） CB,AG,
BLIBL,TGC,
FOS,COLDuin[5] 2018 多中心
（美国）前瞻性 2011-2016 T（38） 57 61 CRE 30 CAZ/AVI TIG,AG,GEN,CB,FOS,
SXT①②③⑥⑦ C（99） 63 （42） COL Alraddadi[6]2019 单中心（沙特阿拉伯） 回顾性 2017-2018 T（10） 59.5 80 CRE 30 CAZ/AVI - ①②③⑤ C（28） 61.5 （57.1） COL,CB,TGC,AM,QU,SXT,AZT Tsolaki[7]
2019多中心
（希腊）回顾性 40个月 T（41） 61.9 68.3 CRE 28 CAZ/AVI - ①③⑤ C（36） 59.1 （77.3） 适当抗生素
治疗注：T：试验组；C：对照组。结局指标：①临床治愈率；②临床缓解率；③28 d/30 d全因病死率；④感染复发率；⑤AEs；⑥SAEs。CAZ/AVI：头孢他啶/阿维巴坦；CB：碳青霉烯类；AG：氨基糖苷类；GEN：庆大霉素；COL：多粘菌素E；TGC：替加环素；BLIBL：β-内酰胺酶抑制剂；FOS：磷霉素；QU：喹诺酮类；SXT：复方磺胺甲唑；AZT：氨曲南。 
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