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丙硫氧嘧啶（propylthiouracil），为硫脲类化合物，它可通过抑制甲状腺内过氧化物酶系统，阻止酪氨酸的碘化及碘化酪氨酸的缩合，从而抑制甲状腺激素的合成，是临床常用的治疗甲亢的药物[1-3]。其口服吸收迅速，约1~1.5 h达血药浓度峰值；代谢快，24 h内约有35%的药物以原型和葡萄糖醛酸化物的形式从尿中排出，血浆半衰期约为1~3 h[4]。口服丙硫氧嘧啶个体差异较大，由于其血浆蛋白结合率高（约为80%），且存在肝毒性，因此对其进行血药浓度监测，能使药物应用更为安全合理[5-6]。进口丙硫氧嘧啶的价格昂贵，研发高质量、低价格的国产仿制药具有良好的经济效益和社会效益[7]，开发高效稳定的丙硫氧嘧啶的血药浓度测定方法，可为仿制药一致性评价中的生物等效性试验（BE）提供依据。
目前，丙硫氧嘧啶的体内测定方法主要为高效液相色谱法（HPLC）[8-10]，早期开发的液相测定方法，分析时间长，专属性和灵敏度均无法满足临床高通量测定的需求，因此，建立简单快速、灵敏准确的丙硫氧嘧啶血药浓度质谱分析方法（MS）具有重要意义。本文建立UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量，可为临床治疗药物监测（TDM）和生物等效性试验（BE）提供方法学基础。
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Agilent 1290 UPLC超高效液相色谱（安捷伦科技有限公司，美国），配有在线脱气机、二元泵、低温自动进样器和柱温箱；Agilent 6470 Triple Quad三重四极杆质谱（安捷伦科技有限公司，美国），配有AJS-ESI喷射流电喷雾离子源、MassHunter分析工作站；SECURA125-1CN型十万分之一电子天平、Arium mini超纯水仪（赛多利斯，德国）；Fresco 21低温离心机（赛默飞，美国）。
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对照品丙硫氧嘧啶（批号：100803-201503，纯度>99.4%）购自中国食品药品检定研究院，内标丙硫氧嘧啶-D5（批号：13-EQJ-150-1，纯度>98%），购自Toronto Research Chemicals；甲酸为色谱纯（ACS恩科化学，美国）；甲醇和乙腈为色谱纯（霍尼韦尔，美国）；水为超纯水。
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色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液（80∶20，V/V），等度洗脱；流速：1 ml/min，柱后分流比2∶3；柱温30 ℃；进样量5 μl，分析时间3min。
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采用AJS-ESI源，正离子模式，离子源参数：干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化器压力40 psi；鞘气温度350 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压4 000 V。多反应监测（MRM）的参数：丙硫氧嘧啶m/z 171.1→112.1，碎片电压110 V，碰撞能量30 eV；丙硫氧嘧啶-D5（IS）m/z 176.1→117.0，碎片电压110 V，碰撞能量30 eV。丙硫氧嘧啶和氘代内标的保留时间均为1.9 min。
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精密称取丙硫氧嘧啶对照品1.5mg，置于2 ml称量瓶中，用移液器（已校准）加入甲醇适量溶解，涡旋混匀，配成1.0 mg/ml的对照品储备液；取上述对照品储备液适量，用甲醇逐级稀释，配成浓度分别为200、500、1000、2 000、10 000、20 000、40 000、80 000、100 000 ng/ml的系列对照品溶液，置4 ℃冰箱保存，备用。
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精密称取丙硫氧嘧啶-D5对照品1.3mg，置于2 ml称量瓶中，用移液器（已校准）加入甲醇适量溶解，涡旋混匀，配成1.0 mg/ml的内标储备液；取上述储备液适量，用乙腈（含5%甲酸）稀释400倍，得2 500 ng/ml的内标溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。
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取空白血浆950 μl，精密加入“2.2.1”项下制备的丙硫氧嘧啶系列标准溶液50 μl，旋涡混匀，配成浓度分别为10、25、50、100、500、1 000、2 000、4 000、5 000 ng/ml的标准含药血浆。同法制备4个浓度的质控样品（QC），分别为10、25、500、4 000 ng/ml，待用。
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血浆样品先置于室温下解冻，取100 μl血浆，依次加入200 μl内标溶液，200 μl乙腈（含5%甲酸），涡旋1min，于4 ℃下13000×g高速离心10 min，取100 μl上清液于进样瓶中，进行UPLC-MS/MS分析。
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通过比较6个不同健康志愿者的空白血浆样品、质控样品和给药后实际样品的色谱图来评估。分别取空白血浆、质控样品（QC-L）和受试者给药后的血样各100 μl，按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作，进样，获得样品的色谱图（图1），包括空白样品色谱图、质控样品色谱图和实际样品色谱图。结果显示，空白血浆中的内源性成分不干扰待测物和内标出峰，选择性良好。
图 1 血浆中丙硫氧嘧啶和内标的典型色谱图
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取“2.2.3”项下制备的标准含药血浆样品100 μl，按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作，进样分析，记录色谱图。以待测物血浆浓度为横坐标（X），待测物与内标峰面积比为纵坐标（Y），进行回归，使用1/X 加权，求得回归方程： Y=0.000 4X−0.000 2（r=0.999 3）。结果表明，血浆中的丙硫氧嘧啶在10~5 000 ng/ml范围内线性关系良好。以S/N>10确定，定量下限（LLOQ）10 ng/ml，为标准曲线最低点。
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在LLQQ（10 ng/ml）、QC-L（25 ng/ml）、QC-M（500 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）4个浓度下，通过批内和批间分别考察。按“2.2.3”项下制备丙硫氧嘧啶4个浓度质控样品，每个浓度平行5份，按“2.3”项下血浆样品前处理操作，进样分析。并于每天制备4个浓度质控样本各5份，进样分析，连续3 d，计算批内、批间的精密度（RSD）及准确度（RE），批内和批间的RSD<10%， RE<±10%，结果见表1。
表 1 丙硫氧嘧啶精密度和准确度试验结果
浓度(ng/ml) 批内(n=5) 批间(n=15) 精密度(RSD/%) 准确度 (RE/%) 精密度(RSD/%) 准确度(RE/%) 10 3.40 −0.55 8.38 −0.88 25 8.35 −5.59 9.53 1.63 500 7.61 −1.00 6.21 −3.39 4 000 2.90 −2.79 4.71 −5.95 -
取6位健康志愿者的空白血浆，在相当于QC-L（25 ng/ml）和QC-H（4000 ng/ml）的2个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清，然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液，以使其终浓度与处理后QC-L和QC-H一致；同时制备相同浓度不含基质的待测物和内标的乙腈溶液，进样分析。通过峰面积分别计算待测物和内标的基质因子，进一步得到经内标归一化的基质因子。不同基质下，2个浓度基质效应的变异系数均小于5%，符合方法学要求，结果见表2。
表 2 丙硫氧嘧啶的基质效应试验结果(n=6)
浓度(ng/ml) 待测物
基质因子（%）内标
基质因子（%）归一化
基质因子（%）变异系数（%） 25 25.94 23.99 108.18 1.78 4 000 21.91 21.92 100.62 0.66 -
取单一来源的空白血浆，在相当于QC-L（25 ng/ml）、QC-M（500 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）的3个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清，然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液，以使其终浓度与处理后QC-L、QC-M、QC-H一致；同时按“2.2.3”和“2.3”项下制备和处理3个浓度的QC样品，每个浓度平行操作5份，分别进样分析。通过峰面积计算待测物的提取回收率，平均回收率为101.60%~113.56%，结果见表3。
表 3 丙硫氧嘧啶的提取回收率试验结果(n=5)
被分析物 浓度(ng/ml) 回收率（%） RSD（%） 丙硫氧嘧啶 25 101.60 5.30 500 113.56 1.72 4 000 108.82 6.26 -
首先通过新鲜配制丙硫氧嘧啶和内标的储备液1.0 mg/ml，考察对照品储备液于4 ℃下放置30 d的稳定性，结果显示，RE<±10%，稳定性良好。然后在QC-L（25 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）2个浓度下，分别考察4种条件下丙硫氧嘧啶的稳定性：室温放置4 h、自动进样器（4 ℃）放置24 h，冻融循环3次，以及−80 ℃下冻存30 d，每个浓度平行操作5份。按“2.3”项下血浆样品前处理操作，进样分析，将丙硫氧嘧啶和内标峰面积的比值代入随行标准曲线求得实测浓度，计算RE以及RSD，结果（见表4）显示稳定性良好。
表 4 考察不同条件下丙硫氧嘧啶的稳定性试验结果(n=5)
浓度(ng/ml) 室温放置4h 4 ℃放置24h 冻融循环3次 −80 ℃冻存30 d RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) 25 2.82 6.58 1.99 6.00 4.67 4.85 8.17 5.59 4 000 −4.65 6.24 −7.70 4.51 4.82 3.90 3.73 1.93 -
通过在定量上限（ULOQ）5 000 ng/ml完成测定之后立即测定空白样品来评估。结果显示，分析物保留时间处峰面积小于LLOQ的20%，IS保留时间处的峰面积小于实际IS的5%。该方法几乎无残留，不影响测定。
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通过使用空白基质将定量上限（ULOQ）10倍（50 000 ng/ml）和50倍（250 000 ng/ml）浓度的样品稀释至定量范围（10~5 000 ng/ml）来评估，每个浓度平行操作5次。结果表明，RSD和RE均低于15%，样品稀释不影响测定的精密度和准确度。
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常用的样品前处理方法为蛋白沉淀和液液萃取，优先采用简单的蛋白沉淀法。沉淀剂考察了甲醇和乙腈，结果发现乙腈沉淀更完全，在同位素内标下，归一化的基质效应更低，添加5%甲酸后，待测物峰形更好，因此选择乙腈（含5%甲酸）为沉淀剂。进一步考察了血浆与沉淀剂的比例（1∶3、1∶4、1∶5，V/V），结果发现，比例为1∶4时，提取回收率最高，最终选定为前处理方法。
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首先考察了甲醇-水和乙腈-水体系，结果发现，虽然乙腈-水体系的洗脱能力更强，但甲醇-水体系下峰形更佳，血浆中内源性成分与主峰分离完全，基线噪音小。在水相中添加0.1%的甲酸，可以显著提高丙硫氧嘧啶的质谱响应，检测灵敏度令人满意，也可进一步改善峰拖尾。柱后采用了2∶3分流，实际进入质谱的流速约为0.4 ml/min，既保障了色谱柱的最佳流速（1 ml/min），又保证了ESI源的离子化效率，结果稳定可靠。
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丙硫氧嘧啶在正离子模式下的响应明显优于负离子模式，因此确定采用正离子模式检测。采用Optimizer质谱参数优化程序依次对雾化室参数（鞘气温度、鞘气流速、干燥气温度、干燥气流速、雾化器压力、毛细管电压）以及MRM参数（母离子、子离子、碎片电压、碰撞能）进行调节优化，最终依据丙硫氧嘧啶和内标的检测灵敏度，确定了“2.2.2”项下最佳的质谱参数。得益于采用的同位素内标，丙硫氧嘧啶和氘代内标出峰稳定，虽保留时间同为1.9 min，但并没有离子串扰影响，而且归一化的基质效应结果满意。
综上，本文建立了快速简便、灵敏准确的测定人血浆中丙硫氧嘧啶含量的UPLC-MS/MS方法。样品采用简单蛋白沉淀法处理，LLOQ为10 ng/ml，基质效应低，回收率高，每个样本的分析时间3 min，每天可分析超过400样本，满足高通量测定需要。本研究为丙硫氧嘧啶的治疗药物监测（TDM）和生物等效性试验（BE）提供了方法学基础。
Determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量，为临床治疗药物监测（TDM）和生物等效性试验（BE）提供方法学基础。 方法 采用Agilent SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液（80∶20，V/V），等度洗脱。质谱采用AJS-ESI源，多反应监测（MRM）正离子模式，检测离子对为：丙硫氧嘧啶m/z 171.1→112.1、内标（丙硫氧嘧啶-D5）m/z 176.1→117.0。 结果 血浆中丙硫氧嘧啶在10~5 000 ng/ml范围内线性关系良好，r=0.999 3；批内和批间的精密度和准确度良好（RSD<10%，RE<±10%）；不同浓度的基质效应均<110%，变异系数<5%；不同浓度的平均回收率为101.60%~113.56%，符合方法学要求。 结论 该方法快速简便、灵敏准确，适用于血浆中丙硫氧嘧啶的含量测定。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 丙硫氧嘧啶 /
- 血浆 /
- 含量测定
Abstract:Objective To establish a method for the determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS and provide methodological basis for therapeutic drug monitoring (TDM) and bioequivalence test (BE) in clinical. Methods The chromatographic separation was performed on an Agilent SB-C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm), the mobile phase was methanol and water containing 0.1% formic acid (80∶20, V/V), isocratic elution. MS condition was optimized in the positive ion detection mode by multiple reaction monitoring (MRM), along with the Agilent JetStream electrospray source interface (AJS-ESI). The precursors to the product ion transitions were m/z 171.1→112.1 for propylthiouracil and m/z 176.1→117.0 for the internal standard (IS). Results The calibration curve was linear in the range of 10−5 000 ng/ml for propylthiouracil in human plasma, r=0.999 3. The intra-day and inter-day precision and accuracy were good (RSD<10%, RE<±10%). The matrix effect of different concentrations was less than 110% and the coefficient of variation was less than 5%. The average recovery of different concentrations was 101.60%−113.56%, which conformed with the requirement of methodological validation. Conclusion The method is rapid, sensitive and accurate, which can be used for the determination of propylthiouracil in human plasma. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- propylthiouracil /
- plasma /
- content determination
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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表 1 丙硫氧嘧啶精密度和准确度试验结果
浓度(ng/ml) 批内(n=5) 批间(n=15) 精密度(RSD/%) 准确度 (RE/%) 精密度(RSD/%) 准确度(RE/%) 10 3.40 −0.55 8.38 −0.88 25 8.35 −5.59 9.53 1.63 500 7.61 −1.00 6.21 −3.39 4 000 2.90 −2.79 4.71 −5.95 
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表 2 丙硫氧嘧啶的基质效应试验结果(n=6)
浓度(ng/ml) 待测物
基质因子（%）内标
基质因子（%）归一化
基质因子（%）变异系数（%） 25 25.94 23.99 108.18 1.78 4 000 21.91 21.92 100.62 0.66
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表 3 丙硫氧嘧啶的提取回收率试验结果(n=5)
被分析物 浓度(ng/ml) 回收率（%） RSD（%） 丙硫氧嘧啶 25 101.60 5.30 500 113.56 1.72 4 000 108.82 6.26
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表 4 考察不同条件下丙硫氧嘧啶的稳定性试验结果(n=5)
浓度(ng/ml) 室温放置4h 4 ℃放置24h 冻融循环3次 −80 ℃冻存30 d RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) 25 2.82 6.58 1.99 6.00 4.67 4.85 8.17 5.59 4 000 −4.65 6.24 −7.70 4.51 4.82 3.90 3.73 1.93
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