下载:
下载:
-
丙硫氧嘧啶（propylthiouracil），为硫脲类化合物，它可通过抑制甲状腺内过氧化物酶系统，阻止酪氨酸的碘化及碘化酪氨酸的缩合，从而抑制甲状腺激素的合成，是临床常用的治疗甲亢的药物[1-3]。其口服吸收迅速，约1~1.5 h达血药浓度峰值；代谢快，24 h内约有35%的药物以原型和葡萄糖醛酸化物的形式从尿中排出，血浆半衰期约为1~3 h[4]。口服丙硫氧嘧啶个体差异较大，由于其血浆蛋白结合率高（约为80%），且存在肝毒性，因此对其进行血药浓度监测，能使药物应用更为安全合理[5-6]。进口丙硫氧嘧啶的价格昂贵，研发高质量、低价格的国产仿制药具有良好的经济效益和社会效益[7]，开发高效稳定的丙硫氧嘧啶的血药浓度测定方法，可为仿制药一致性评价中的生物等效性试验（BE）提供依据。
目前，丙硫氧嘧啶的体内测定方法主要为高效液相色谱法（HPLC）[8-10]，早期开发的液相测定方法，分析时间长，专属性和灵敏度均无法满足临床高通量测定的需求，因此，建立简单快速、灵敏准确的丙硫氧嘧啶血药浓度质谱分析方法（MS）具有重要意义。本文建立UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量，可为临床治疗药物监测（TDM）和生物等效性试验（BE）提供方法学基础。
-
Agilent 1290 UPLC超高效液相色谱（安捷伦科技有限公司，美国），配有在线脱气机、二元泵、低温自动进样器和柱温箱；Agilent 6470 Triple Quad三重四极杆质谱（安捷伦科技有限公司，美国），配有AJS-ESI喷射流电喷雾离子源、MassHunter分析工作站；SECURA125-1CN型十万分之一电子天平、Arium mini超纯水仪（赛多利斯，德国）；Fresco 21低温离心机（赛默飞，美国）。
-
对照品丙硫氧嘧啶（批号：100803-201503，纯度>99.4%）购自中国食品药品检定研究院，内标丙硫氧嘧啶-D5（批号：13-EQJ-150-1，纯度>98%），购自Toronto Research Chemicals；甲酸为色谱纯（ACS恩科化学，美国）；甲醇和乙腈为色谱纯（霍尼韦尔，美国）；水为超纯水。
-
色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液（80∶20，V/V），等度洗脱；流速：1 ml/min，柱后分流比2∶3；柱温30 ℃；进样量5 μl，分析时间3min。
-
采用AJS-ESI源，正离子模式，离子源参数：干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化器压力40 psi；鞘气温度350 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压4 000 V。多反应监测（MRM）的参数：丙硫氧嘧啶m/z 171.1→112.1，碎片电压110 V，碰撞能量30 eV；丙硫氧嘧啶-D5（IS）m/z 176.1→117.0，碎片电压110 V，碰撞能量30 eV。丙硫氧嘧啶和氘代内标的保留时间均为1.9 min。
-
精密称取丙硫氧嘧啶对照品1.5mg，置于2 ml称量瓶中，用移液器（已校准）加入甲醇适量溶解，涡旋混匀，配成1.0 mg/ml的对照品储备液；取上述对照品储备液适量，用甲醇逐级稀释，配成浓度分别为200、500、1000、2 000、10 000、20 000、40 000、80 000、100 000 ng/ml的系列对照品溶液，置4 ℃冰箱保存，备用。
-
精密称取丙硫氧嘧啶-D5对照品1.3mg，置于2 ml称量瓶中，用移液器（已校准）加入甲醇适量溶解，涡旋混匀，配成1.0 mg/ml的内标储备液；取上述储备液适量，用乙腈（含5%甲酸）稀释400倍，得2 500 ng/ml的内标溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。
-
取空白血浆950 μl，精密加入“2.2.1”项下制备的丙硫氧嘧啶系列标准溶液50 μl，旋涡混匀，配成浓度分别为10、25、50、100、500、1 000、2 000、4 000、5 000 ng/ml的标准含药血浆。同法制备4个浓度的质控样品（QC），分别为10、25、500、4 000 ng/ml，待用。
-
血浆样品先置于室温下解冻，取100 μl血浆，依次加入200 μl内标溶液，200 μl乙腈（含5%甲酸），涡旋1min，于4 ℃下13000×g高速离心10 min，取100 μl上清液于进样瓶中，进行UPLC-MS/MS分析。
-
通过比较6个不同健康志愿者的空白血浆样品、质控样品和给药后实际样品的色谱图来评估。分别取空白血浆、质控样品（QC-L）和受试者给药后的血样各100 μl，按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作，进样，获得样品的色谱图（图1），包括空白样品色谱图、质控样品色谱图和实际样品色谱图。结果显示，空白血浆中的内源性成分不干扰待测物和内标出峰，选择性良好。
图 1 血浆中丙硫氧嘧啶和内标的典型色谱图
-
取“2.2.3”项下制备的标准含药血浆样品100 μl，按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作，进样分析，记录色谱图。以待测物血浆浓度为横坐标（X），待测物与内标峰面积比为纵坐标（Y），进行回归，使用1/X 加权，求得回归方程： Y=0.000 4X−0.000 2（r=0.999 3）。结果表明，血浆中的丙硫氧嘧啶在10~5 000 ng/ml范围内线性关系良好。以S/N>10确定，定量下限（LLOQ）10 ng/ml，为标准曲线最低点。
-
在LLQQ（10 ng/ml）、QC-L（25 ng/ml）、QC-M（500 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）4个浓度下，通过批内和批间分别考察。按“2.2.3”项下制备丙硫氧嘧啶4个浓度质控样品，每个浓度平行5份，按“2.3”项下血浆样品前处理操作，进样分析。并于每天制备4个浓度质控样本各5份，进样分析，连续3 d，计算批内、批间的精密度（RSD）及准确度（RE），批内和批间的RSD<10%， RE<±10%，结果见表1。
表 1 丙硫氧嘧啶精密度和准确度试验结果
浓度(ng/ml) 批内(n=5) 批间(n=15) 精密度(RSD/%) 准确度 (RE/%) 精密度(RSD/%) 准确度(RE/%) 10 3.40 −0.55 8.38 −0.88 25 8.35 −5.59 9.53 1.63 500 7.61 −1.00 6.21 −3.39 4 000 2.90 −2.79 4.71 −5.95 -
取6位健康志愿者的空白血浆，在相当于QC-L（25 ng/ml）和QC-H（4000 ng/ml）的2个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清，然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液，以使其终浓度与处理后QC-L和QC-H一致；同时制备相同浓度不含基质的待测物和内标的乙腈溶液，进样分析。通过峰面积分别计算待测物和内标的基质因子，进一步得到经内标归一化的基质因子。不同基质下，2个浓度基质效应的变异系数均小于5%，符合方法学要求，结果见表2。
表 2 丙硫氧嘧啶的基质效应试验结果(n=6)
浓度(ng/ml) 待测物
基质因子（%）内标
基质因子（%）归一化
基质因子（%）变异系数（%） 25 25.94 23.99 108.18 1.78 4 000 21.91 21.92 100.62 0.66 -
取单一来源的空白血浆，在相当于QC-L（25 ng/ml）、QC-M（500 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）的3个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清，然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液，以使其终浓度与处理后QC-L、QC-M、QC-H一致；同时按“2.2.3”和“2.3”项下制备和处理3个浓度的QC样品，每个浓度平行操作5份，分别进样分析。通过峰面积计算待测物的提取回收率，平均回收率为101.60%~113.56%，结果见表3。
表 3 丙硫氧嘧啶的提取回收率试验结果(n=5)
被分析物 浓度(ng/ml) 回收率（%） RSD（%） 丙硫氧嘧啶 25 101.60 5.30 500 113.56 1.72 4 000 108.82 6.26 -
首先通过新鲜配制丙硫氧嘧啶和内标的储备液1.0 mg/ml，考察对照品储备液于4 ℃下放置30 d的稳定性，结果显示，RE<±10%，稳定性良好。然后在QC-L（25 ng/ml）、QC-H（4 000 ng/ml）2个浓度下，分别考察4种条件下丙硫氧嘧啶的稳定性：室温放置4 h、自动进样器（4 ℃）放置24 h，冻融循环3次，以及−80 ℃下冻存30 d，每个浓度平行操作5份。按“2.3”项下血浆样品前处理操作，进样分析，将丙硫氧嘧啶和内标峰面积的比值代入随行标准曲线求得实测浓度，计算RE以及RSD，结果（见表4）显示稳定性良好。
表 4 考察不同条件下丙硫氧嘧啶的稳定性试验结果(n=5)
浓度(ng/ml) 室温放置4h 4 ℃放置24h 冻融循环3次 −80 ℃冻存30 d RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) 25 2.82 6.58 1.99 6.00 4.67 4.85 8.17 5.59 4 000 −4.65 6.24 −7.70 4.51 4.82 3.90 3.73 1.93 -
通过在定量上限（ULOQ）5 000 ng/ml完成测定之后立即测定空白样品来评估。结果显示，分析物保留时间处峰面积小于LLOQ的20%，IS保留时间处的峰面积小于实际IS的5%。该方法几乎无残留，不影响测定。
-
通过使用空白基质将定量上限（ULOQ）10倍（50 000 ng/ml）和50倍（250 000 ng/ml）浓度的样品稀释至定量范围（10~5 000 ng/ml）来评估，每个浓度平行操作5次。结果表明，RSD和RE均低于15%，样品稀释不影响测定的精密度和准确度。
-
常用的样品前处理方法为蛋白沉淀和液液萃取，优先采用简单的蛋白沉淀法。沉淀剂考察了甲醇和乙腈，结果发现乙腈沉淀更完全，在同位素内标下，归一化的基质效应更低，添加5%甲酸后，待测物峰形更好，因此选择乙腈（含5%甲酸）为沉淀剂。进一步考察了血浆与沉淀剂的比例（1∶3、1∶4、1∶5，V/V），结果发现，比例为1∶4时，提取回收率最高，最终选定为前处理方法。
-
首先考察了甲醇-水和乙腈-水体系，结果发现，虽然乙腈-水体系的洗脱能力更强，但甲醇-水体系下峰形更佳，血浆中内源性成分与主峰分离完全，基线噪音小。在水相中添加0.1%的甲酸，可以显著提高丙硫氧嘧啶的质谱响应，检测灵敏度令人满意，也可进一步改善峰拖尾。柱后采用了2∶3分流，实际进入质谱的流速约为0.4 ml/min，既保障了色谱柱的最佳流速（1 ml/min），又保证了ESI源的离子化效率，结果稳定可靠。
-
丙硫氧嘧啶在正离子模式下的响应明显优于负离子模式，因此确定采用正离子模式检测。采用Optimizer质谱参数优化程序依次对雾化室参数（鞘气温度、鞘气流速、干燥气温度、干燥气流速、雾化器压力、毛细管电压）以及MRM参数（母离子、子离子、碎片电压、碰撞能）进行调节优化，最终依据丙硫氧嘧啶和内标的检测灵敏度，确定了“2.2.2”项下最佳的质谱参数。得益于采用的同位素内标，丙硫氧嘧啶和氘代内标出峰稳定，虽保留时间同为1.9 min，但并没有离子串扰影响，而且归一化的基质效应结果满意。
综上，本文建立了快速简便、灵敏准确的测定人血浆中丙硫氧嘧啶含量的UPLC-MS/MS方法。样品采用简单蛋白沉淀法处理，LLOQ为10 ng/ml，基质效应低，回收率高，每个样本的分析时间3 min，每天可分析超过400样本，满足高通量测定需要。本研究为丙硫氧嘧啶的治疗药物监测（TDM）和生物等效性试验（BE）提供了方法学基础。
Determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS
-
摘要:
目的 建立UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量，为临床治疗药物监测（TDM）和生物等效性试验（BE）提供方法学基础。 方法 采用Agilent SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液（80∶20，V/V），等度洗脱。质谱采用AJS-ESI源，多反应监测（MRM）正离子模式，检测离子对为：丙硫氧嘧啶m/z 171.1→112.1、内标（丙硫氧嘧啶-D5）m/z 176.1→117.0。 结果 血浆中丙硫氧嘧啶在10~5 000 ng/ml范围内线性关系良好，r=0.999 3；批内和批间的精密度和准确度良好（RSD<10%，RE<±10%）；不同浓度的基质效应均<110%，变异系数<5%；不同浓度的平均回收率为101.60%~113.56%，符合方法学要求。 结论 该方法快速简便、灵敏准确，适用于血浆中丙硫氧嘧啶的含量测定。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 丙硫氧嘧啶 /
- 血浆 /
- 含量测定
Abstract:Objective To establish a method for the determination of propylthiouracil in human plasma by UPLC-MS/MS and provide methodological basis for therapeutic drug monitoring (TDM) and bioequivalence test (BE) in clinical. Methods The chromatographic separation was performed on an Agilent SB-C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm), the mobile phase was methanol and water containing 0.1% formic acid (80∶20, V/V), isocratic elution. MS condition was optimized in the positive ion detection mode by multiple reaction monitoring (MRM), along with the Agilent JetStream electrospray source interface (AJS-ESI). The precursors to the product ion transitions were m/z 171.1→112.1 for propylthiouracil and m/z 176.1→117.0 for the internal standard (IS). Results The calibration curve was linear in the range of 10−5 000 ng/ml for propylthiouracil in human plasma, r=0.999 3. The intra-day and inter-day precision and accuracy were good (RSD<10%, RE<±10%). The matrix effect of different concentrations was less than 110% and the coefficient of variation was less than 5%. The average recovery of different concentrations was 101.60%−113.56%, which conformed with the requirement of methodological validation. Conclusion The method is rapid, sensitive and accurate, which can be used for the determination of propylthiouracil in human plasma. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- propylthiouracil /
- plasma /
- content determination
-
慢性脑缺血(CCI)是指各种原因引发的长期大脑血灌流量不足，在血管性痴呆和阿尔茨海默病等神经系统疾病的发展过程发挥重要作用[1-2]。长期慢性脑缺血会导致慢性神经炎症、海马自噬异常、脑部神经元凋亡[3-4]，为此，CCI已经严重威胁人类的健康。肠道被称为人类的“第二大脑”，肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠互动（即脑-肠轴）与机体的神经系统密切相关[5]。研究证明中枢系统疾病会导致肠道菌群失调[6]，患者发生脑卒中后，不仅会出现胃肠道并发症，还会发生肠道菌群失调，例如肠道菌群中的阿克曼菌属（Akkermansia）会发生变化[7]。同时，肠道菌群失调也推动了脑卒中等疾病的发展，文献报道厚壁菌门增加与认知功能损伤有一定的关联[8-9]。因此，肠道菌群参与了脑部神经系统疾病的进展。中药复方虎杖清脉饮是上海市著名中医脉管病专家奚九一教授数十年临床诊治经验的总结，临床上对辩证属“热郁毒聚，脉滞络痹”的脑小血管损伤疗效显著。有报道虎杖清脉饮通过调节p38和NF-κB信号通路，抑制高糖诱导的人视网膜毛细血管内皮细胞的损伤[10]，提示虎杖清脉饮具有抗炎和抗凋亡作用。然而，虎杖清脉饮对慢性脑缺血的治疗作用缺乏临床前研究，作用机制尚不清楚。因此，本实验研究虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠认知功能的影响，并基于肠道菌群角度初步探讨其作用机制，为防治慢性脑缺血提供新的思路。
1. 材料
1.1 动物
24只C57BL/6J雄性小鼠(20±5) g，购自常州卡文斯实验动物有限公司（动物合格证号：202112546）。饲养于海军军医大学药学系动物房，饲养条件为温度（24 ± 2） ℃，相对湿度70 %，每天光照时间为08:00至20:00，自由进食饮水。所有操作均符合海军军医大学实验动物伦理要求。
1.2 药物及试剂
虎杖清脉饮由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供。由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎七味常用中药制备[10]。所有药品粉碎成粗粉，蒸馏水浸泡，煮沸2次，每次40 min，合并滤液，浓缩至0.675 g/ml。银杏叶提取物由上海阿拉丁生物化学技术有限公司提供。
1.3 仪器与设备
Morris 水迷宫（上海奥尔科特生物科技有限公司）；组织脱水机、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；倒置生物显微镜（日本尼康）；病理切片机（上海俫卡仪器有限公司）；DYY-6C 型核酸电泳仪、ND2000 型光度计、9700 型PCR 仪、Quantus™型高灵敏荧光计、Miseq PE300测序平台（美吉生物公司）。
2. 方法
2.1 双侧颈总动脉狭窄模型（BCAS）的建立及动物分组
24只小鼠适应性饲养7 d后，随机分为4组：假手术组、模型组、阳性药组（银杏叶提取物）、虎杖清脉饮组，每组6只。小鼠腹腔注射1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）麻醉，并暴露颈总动脉(CCAs)。在体视显微镜下，将微型弹簧圈(钢丝直径0.08 mm，线圈内径0.18 mm，螺距0.5 mm，总长度2.5 mm)螺旋旋转固定在双侧颈总动脉上致颈总动脉狭窄使脑慢性灌注不足，建立BCAS模型。然后缝合手术部位，并对术后小鼠进行护理，直到它们意识清醒。造模6 w后，各组开始进行灌胃给药12 w。阳性药组给予银杏叶提取物（GBE）30 mg/kg，虎杖清脉饮组（HZQMY）给予虎杖清脉饮13.5 mg/kg，假手术组（Sham）和模型组（BCAS）给予等量生理盐水处理。
2.2 水迷宫实验
Morris水迷宫实验分为前5 d的定位航行实验和第6 d的空间探索实验。定位航行实验：主要用于测试小鼠的空间学习能力。实验历时5 d，每天每只小鼠训练3次。训练时随机选择一个象限开始，按顺时针方向训练3次。每次将该象限的池壁中点作为入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入水中，尽量保持每次入水方式的一致，减少人为影响。小鼠每次分别从不同象限入水寻找逃逸平台，若小鼠找到登上平台，并停留5 s以上，则计时结束，水迷宫装置自动记录小鼠从入水到寻台成功的时间，即为逃避潜伏期。如果在60 s后仍未登上平台，计时也将停止，将小鼠人为引上平台休息1 min，且当次的逃避潜伏期记录为60 s。
空间探索实验：主要用于测试小鼠的空间记忆能力。在定位航行实验结束的第2d，撤除平台，选择与第四象限最远的第二象限池壁中点为小鼠入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入池中，使小鼠自由游泳60 s并记录这60 s内小鼠在原平台的停留时间、穿过原平台所在位置的次数作为判断小鼠空间记忆能力差异的指标。
2.3 LFB染色
治疗结束后，每组各取6只小鼠，用1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）腹腔注射麻醉，4 %多聚甲醛灌注后，取脑石蜡包埋，切片，厚度5 μm，用于LFB(Luxol Fast Blue stain)染色。将石蜡切片常规脱蜡至水，加入LFB染色液于60 ℃烤箱染色3 h。95 %乙醇洗去多余染色液，蒸馏水冲洗。Luxol分化液分化15 s，70 %乙醇分色。重复分化步骤，直至胼胝体和皮质之间形成鲜明对比。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下采集图片。
2.4 肠道菌群测序分析
末次给药后禁食12 h，脱颈椎处死小鼠，处死方法符合动物福利伦理要求，无菌条件下取盲肠内容物，置于液氮中速冻保存。送至美吉生物技术股份有限公司进行DNA提取，合格样品进一步进行高通量测序。
2.5 数据处理与分析
运用美吉生物信息云（https://cloud.majorbio.com/）进行数据的处理，利用美吉生信云UParse软件（v7.0.1090）进行OTU（operational taxonomic units）分析、Alpha多样性分析、稀释曲线分析；利用美吉生信云tax_summary_a文件夹中的数据表和R语言（version 3.3.1）工具统计和作图进行物种组成分析；利用Qiime计算Beta多样性距离矩阵；利用美吉生信云进行线性判别分析（LEfSe），计算多级物种之间的差异。
2.6 统计分析
采用统计软件SPSS 19.0、GraphPad 9.0进行分析。符合正态分布的计量数据以（
$\bar{x}$ ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA)。以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有极显著性差异。3. 结果
3.1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响
如图1A所示，假手术组小鼠从水迷宫实验第1 d开始到第5 d，逃避潜伏期在不断减少。而模型组小鼠随天数的增加，找到平台的时长并没有明显缩短，并且与假手术组相比，第4天和第5天逃避潜伏期有显著性差异（P<0.05），各给药组小鼠逃避潜伏期在逐渐减少，第5天阳性药组、虎杖清脉饮组与模型组之间的逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)。如图1B所示，模型组小鼠的跨越平台次数显著少于假手术组（P<0.01）。而虎杖清脉饮组的跨越平台次数显著大于模型组（P<0.01）。如图1C所示，模型组小鼠的目标象限百分比显著少于假手术组（P<0.05），阳性药组和虎杖清脉饮组的目标象限百分比均显著大于模型组（P<0.05），提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的学习记忆能力。如图1D所示，假手术组中，小鼠胼胝体的LFB染色，髓鞘排列整齐，无水肿、碎裂及空泡的形成。模型组，LFB着色浅，髓鞘崩解，部分髓鞘空泡化。经银杏叶提取物和虎杖清脉饮治疗，髓鞘病变减轻，染色加深，提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的白质损伤。
图 1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响（n=6，$ \bar{x} $ ±s）Sham-假手术组；BCAS-模型组；GBE-阳性药组；HZQMY-虎杖清脉饮组（下同）A.小鼠的逃避潜伏期；B.平台穿越次数；C.目标象限百分比；D. 小鼠脑组织 LFB染色；* P <0.05，** P <0.01，与假手术比较；# P <0.05，## P <0.01，与模型组比较3.2 小鼠肠道菌群物种注释与评估
各组小鼠肠道菌群优化后序列数目为964830，碱基数目为398083175，平均长度为412 bp，序列长度分布在400~440 bp内。图2A为3组小鼠肠道微生物等级丰度曲线，从丰度曲线可以看到各组在缓慢平稳下降，说明各组小鼠肠道菌群物种丰富度高并且分布均匀。图2B、2C所示，总物种曲线可分析样本包含的物种总和，共享物种曲线可分析样本共享物种数目，本研究各组总数目和共享项目增加或减少趋势均逐步减缓并趋于平坦，表明各组样本量满足评估物种丰富度和核心物种数的要求。
3.3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析
如图3A、3B、3C所示，丰富度实际观测值指数、物种丰富度ACE指数和物种丰富度Chao1指数可解释生物群落丰富度。相较于假手术组，模型组小鼠肠道菌群丰富度显著下降（P<0.05）；相较于模型组，虎杖清脉饮组肠道菌群丰富度显著升高（P<0.05），说明虎杖清脉饮可以提升模型组小鼠肠道菌群的丰富度。如图3D所示，3组小鼠肠道菌群的Shannon均匀度测量指数无明显差异。综上，模型组慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度明显下降，虎杖清脉饮可提升慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度。
图 3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析（n=6，$ \bar{{x}} $ ±s）A .丰富度实际观测值指数；B. 物种丰富度ACE指数；C. 物种丰富度Chao1指数；D. Shannon均匀度测量指数；* P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.4 小鼠肠道菌群Beta多样性分析
通过主成分分析（PCA）各组小鼠样本菌群群落组成差异，运用反差分解，在图中通过距离反映不同组之间的组成差异，如样本物种组成越相似，反映在主成分分析图中的距离越近。假手术组和模型组聚集在一起，说明模型组对肠道菌群的影响较小。而虎杖清脉饮组与模型组距离较远，说明慢性脑缺血小鼠肠道菌群改变较小，虎杖清脉饮具有调控模型组小鼠肠道菌群组成的作用（图4）。
3.5 小鼠肠道菌群物种组成及差异分析
3.5.1 基于门水平差异性分析
门水平上，3组小鼠肠道中占主导地位的微生物主要有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、放线菌门（Actinobacteriota），其中后壁菌门和拟杆菌门为优势门类（图5A）。由图5B所示，各组小鼠肠道菌群中髌骨细菌门
和弯曲菌门丰度有显著性差异（P<0.05）。如图5C所示，相较于假手术组，模型组疣微菌门丰度显著升高（P<0.05）。如图5D所示，相较于模型组，虎杖清脉饮组小鼠的疣微菌门丰度显著降低（P<0.05），髌骨细菌门丰度显著增加（P<0.05）。门水平差异性分析显示，慢性脑缺血小鼠疣微菌门丰富度增加；虎杖清脉饮降低慢性脑缺血小鼠疣微菌门和增加髌骨细菌门的群落丰度。 
图 5 各组小鼠肠道菌群门水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度； B.各组样本门水平群落丰度差异；C. Sham组与BCAS组菌门群落丰度差异；D. BCAS组与HZQMY组菌门群落丰度差异；* P<0.05，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.5.2 基于属水平差异性分析
属水平上，3组小鼠肠道中优势菌为毛螺菌科_NK4A136_group、norank_f_Muribaculaceae和乳杆菌属(Lactobacillus)等（图6A）。如图6B所示，3组小鼠的肠道菌群中，阿克曼菌属（Akkermansia）、绿脓杆菌（Turicibacter）、嗜木聚糖真杆菌属（Eubacterium_xylanoPhilum_group）、异杆菌属（Allobaculum）、丹毒荚膜菌属（Erysipelatoclostridium）、回肠杆菌（Ileibacterium）、乳酸球菌属（Lactococcus）群落丰度具有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。如图6C所示，与假手术组相比，模型组阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著上升（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著下降（P<0.05，P<0.01）。如图6D所示，与模型组相比，虎杖清脉饮组的阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著下降（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著上升（P<0.05，P<0.01）。
图 6 各组小鼠肠道菌群属水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度；B.各组样本属水平群落丰度差异；C.假手术组与模型组菌属群落丰度差异；D.模型组与虎杖清脉饮组菌属群落丰度差异；* P<0.05，**P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，## P<0.01，与模型组比较3.6 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析
如表1所示，LEfSe可以检测各组之间存在显著丰度差异特征。相较于假手术组，模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、疣微菌目（o_Verrucomicrobiales）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）等相对丰度显著上调；嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）、罗氏菌属（g_Roseburia）、回肠杆菌属（g_Ileibacterium）等相对丰度显著下调，表明慢性脑缺血小鼠上述肠道菌群丰度发生显著性变化。
表 1 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析菌群 模型组vs
假手术组虎杖清脉饮组vs
模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota） ↑ ↓ 疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae） ↑ ↓ 疣微菌目（o_Verrucomicrobiales） ↑ ↓ 克里斯滕菌目（o_Christensenellales） ↑ 阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae） ↑ ↓ 克里斯滕菌科（f_Christensenellaceae） ↑ 粪芽孢菌属（g_Coprobacillus） ↑ ↓ 阿克曼菌属（g_Akkermansia） ↑ ↓ 嗜胆菌属（g_Bilophila） ↑ 克里斯滕菌属
（g_Christensenellaceae_R-7_group）↑ 丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium） ↑ ↓ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↓ 罗氏菌属（g_Roseburia） ↓ 未分类克里斯滕森菌科（g_unclassified_f_Christensenellaceae） ↓ 异杆菌属（g_Allobaculum） ↓ ↑ 理研菌属（g_Rikenella） ↓ 绿脓杆菌属（g_Turicibacter） ↓ ↑ g_Tyzzerella ↓ 回肠杆菌属（g_Ileibacterium） ↓ 蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia） ↓ f_Tannerellaceae ↓ f_norank_o_Chloroplas ↓ g_norank_f_norank_o_Chloroplast ↓ 副杆菌属（g_Parabacteroides） ↓ o_PeptostrePtococcales-Tissierellales ↑ 髌骨细菌门（P_Patescibacteria） ↑ c_Saccharimonadia ↑ o_Saccharimonadales ↑ f_Saccharimonadaceae ↑ 丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae） ↑ 消化链球菌科（f_Peptostreptococcaceae） ↑ g_Candidatus_Saccharimonas ↑ g_UCG-005 ↑ g_Romboutsia ↑ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↑ g_norank_f_Atopobiaceae ↑ 安德克氏菌属（g_Adlercreutzia） ↑ 分节丝状菌属（g_Candidatus_Arthromitus） ↑ g_Lachnospiraceae_UCG-006 ↑ g_NK4A214_group ↑ 注：↑表示相对丰度增加，↓表示相对丰度降低。 相较于模型组，虎杖清脉饮组疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia）、疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）、阿克曼菌属（g_Akkermansia）、粪芽孢菌属（g_Coprobacillus）、丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium）、副杆菌属（g_Parabacteroides）等相对丰度显著下调；丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae）、消化链球菌科（f_PeptostrePtococcaceae）、绿脓杆菌属（g_Turicibacter）、异杆菌属（g_Allobaculum）、嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）等相对丰度显著上调。说明虎杖清脉饮通过调节嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、疣微菌、阿克曼菌和丹毒荚膜菌的丰度，达到治疗慢性脑缺血的治疗作用。
4. 讨论
慢性脑缺血会损害脑血管，导致患者身体残疾、认知障碍或抑郁样行为。慢性脑缺血(CCI)被认为是血管性痴呆的一个病理生理标志[1-2]，它是血管认知障碍(VCI)最严重的阶段和形式，与推理、学习和记忆方面的问题有关[11-12]。
近年来，大量的研究展示了肠道微生物对人体的生长发育有重要作用，当肠道微生物失调时，可能造成神经功能缺陷，进而出现神经退行性疾病[13-14]。肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠轴调节参与机体的免疫、代谢、神经、内分泌等系统，进而影响多种神经系统疾病的发生[15-16]。研究显示，神经类疾病如阿尔兹海默症、抑郁症、帕金森疾病等都存在宿主肠道菌群紊乱的现象，并且发现肠道菌群能通过神经内分泌和自主神经实现脑-肠信号转导，从而参与调节宿主的神经-内分泌-免疫网络，影响宿主的情绪、认知或行为改变[17]。
虎杖清脉饮由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎组成，虎杖为君药，《药性论》曰：“虎杖，压一切热毒”。虎杖性味苦，寒，在方中起清热解毒、凉血祛瘀的功效。虎杖对神经具有保护作用，如虎杖苷可通过调控lncRNA-MALAT1发挥脑微血管内皮细胞保护作用；虎杖苷可以激活SIRT1信号通路减轻大鼠创伤性脑损伤[18]。连翘[19]、垂盆草及豨莶草[20-21]共为臣药。连翘味苦，微寒，属于清热解毒药，《医学衷中参西录》：连翘具升浮宣散之力，可流通气血。垂盆草味甘、淡，性凉，豨莶草性味辛、苦，寒，二者具有清热解毒，祛风通络之功。三药联用助虎杖清热解毒，又能增强通络的作用。鸡血藤[22]、黄芪共为方中佐药。鸡血藤温而不烈，活血祛瘀兼有补血功效；黄芪甘温，具有益气扶正之功，治久病气虚。三者可治血瘀气虚兼症，并能制君药和臣药苦寒，保护脾胃。川芎[23]辛温，既能祛风，又能行气活血，引诸药上行巅顶，为佐而兼使之用。其中的川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等[24-25]化学成分有明显脑保护作用。诸药合用，共奏清热解毒、活血通络之功。本研究通过减少颈总动脉的血流量，成功建立慢性脑缺血小鼠的模型。
通过水迷宫实验和LFB染色表明虎杖清脉饮对小鼠慢性脑缺血具有保护作用，从肠道菌群的角度观察发现慢性脑缺血将会导致小鼠菌群的物种的丰富度有所下降，并且其中疣微菌门、阿克曼菌属和丹毒荚膜菌属相对丰度上升，而嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度下降；虎杖清脉饮具有增加小鼠肠道菌群物种丰富度的作用，以及回调因为慢性脑缺血而导致菌属变化的作用。阿克曼菌隶属于疣微菌门，是肠道微生物中唯一一个来自疣微菌门的细菌。阿克曼菌[26] 是一种以肠黏膜层中的黏蛋白为食，降解黏蛋白和黏液层。当艾克曼菌异常增加时，会导致肠道屏障的受损，进而诱发肠道炎症和LPS大量进入血液影响其他脏器。有相关文献报道[27] ，在中风患者的肠道艾克曼菌中异常增长。同时，丹毒荚膜菌[28]的丰度也随着帕金森患者胃肠功能障碍增加而增加，这与我们的实验结果相符。嗜木聚糖真杆菌和异杆菌[29-30] 属于短链脂肪酸产生菌，短链脂肪酸[31-32] 可以降低肠道的通透性以及加强肠道屏障的防御力，调节免疫细胞趋化性、活性氧（ROS）释放以及细胞因子释放而具有抗炎功能，短链脂肪酸也可以促进脑内海马神经的发生和延长。虎杖清脉饮减少阿克曼菌属的相对丰度；增加嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度，进而维持肠道屏障功能的完整性，降低机体内的炎症反应，保护血脑屏障[5]。综上所述，虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠的治疗作用与其对慢性脑缺血小鼠肠道菌群失调的改善作用具有相关性。
-
表 1 丙硫氧嘧啶精密度和准确度试验结果
浓度(ng/ml) 批内(n=5) 批间(n=15) 精密度(RSD/%) 准确度 (RE/%) 精密度(RSD/%) 准确度(RE/%) 10 3.40 −0.55 8.38 −0.88 25 8.35 −5.59 9.53 1.63 500 7.61 −1.00 6.21 −3.39 4 000 2.90 −2.79 4.71 −5.95 
下载: 导出CSV
表 2 丙硫氧嘧啶的基质效应试验结果(n=6)
浓度(ng/ml) 待测物
基质因子（%）内标
基质因子（%）归一化
基质因子（%）变异系数（%） 25 25.94 23.99 108.18 1.78 4 000 21.91 21.92 100.62 0.66
下载: 导出CSV
表 3 丙硫氧嘧啶的提取回收率试验结果(n=5)
被分析物 浓度(ng/ml) 回收率（%） RSD（%） 丙硫氧嘧啶 25 101.60 5.30 500 113.56 1.72 4 000 108.82 6.26
下载: 导出CSV
表 4 考察不同条件下丙硫氧嘧啶的稳定性试验结果(n=5)
浓度(ng/ml) 室温放置4h 4 ℃放置24h 冻融循环3次 −80 ℃冻存30 d RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) 25 2.82 6.58 1.99 6.00 4.67 4.85 8.17 5.59 4 000 −4.65 6.24 −7.70 4.51 4.82 3.90 3.73 1.93
下载: 导出CSV
-
[1] 徐秀娟. 丙硫氧嘧啶治疗妊娠期甲状腺功能亢进的临床疗效观察[J]. 现代实用医学, 2017, 29(5):624-625. doi: 10.3969/j.issn.1671-0800.2017.05.034 [2] 杨霞. 丙硫氧嘧啶片治疗老年甲亢的临床疗效[J]. 中国社区医师, 2017, 33(4):66-67. doi: 10.3969/j.issn.1007-614x.2017.4.42 [3] GIANETTI E, RUSSO L, ORLANDI F, et al. Pregnancy outcome in women treated with methimazole or propylthiouracil during pregnancy[J]. J Endocrinol Invest,2015,38(9):977-985. doi: 10.1007/s40618-015-0281-z [4] 王大猷. 丙硫氧嘧啶的药学特性及安全问题[J]. 药物不良反应杂志, 2015, 17(2):84-86. doi: 10.3760/cma.j.issn.1008-5734.2015.02.003 [5] 韩耕愚, 刘冰, 沈弢. 丙硫氧嘧啶(PTU)诱导药物性肝损伤的研究进展[J]. 肝脏, 2018, 23(9):831-833. [6] WU D B, CHEN E Q, BAI L, et al. Propylthiouracil-induced liver failure and artificial liver support systems: a case report and review of the literature[J]. Ther Clin Risk Manag,2017,13:65-68. doi: 10.2147/TCRM.S122611 [7] 王俏瑾, 陈珏. 仿制药一致性评价工作的进展与展望[J]. 中国现代应用药学, 2019, 36(4):499-501. [8] GŁÓWKA F K, HERMANN T W, HERMANN J, et al. Bioavailability of propylthiouracil from two formulation tablets[J]. Pharmazie,2018,73(12):688-691. [9] 范文源, 吴正红, 平其能, 等. 丙硫氧嘧啶缓释片与普通片的犬体内药动学及生物利用度比较[J]. 中国新药与临床杂志, 2005, 24(7):515-518. doi: 10.3969/j.issn.1007-7669.2005.07.004 [10] 潘峰云, 张亮, 王林波, 等. HPLC法测定人血浆中丙硫氧嘧啶及药代动力学研究[J]. 中国药科大学学报, 2001, 32(5):363-366. doi: 10.3321/j.issn:1000-5048.2001.05.011 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 6087
- HTML全文浏览量: 1715
- PDF下载量: 32
- 被引次数: 0
