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中药代煎使用自动煎药机，机械化生产效率高，加水量、煎药时间容易控制，能做到煎药规范化、标准化、数字化管理[1-2]。中药处方中经常有“先煎”、“后下”的药材，需要特殊煎法时特别处理，一般先按要求煎好，分装后保存，用时加入到复方中混合。提取液的放置环境温度及时间长短都会影响到有效成分的稳定性从而降低复方汤剂的药效。目前中药“后下”品种预煎液尚无完整的质量控制过程，缺少有效的质量监管措施，难以保证中药代煎液临床疗效的一致性。
肉桂为樟科（Lauraceae）樟属植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥树皮，因含有丰富的芳香族、萜类、脂肪族等挥发油化合物，长时间煎煮会导致药性损失，故中药传统煎煮方法将其作为“后下”品种。肉桂酸作为肉桂主要的药效成分，具有抗菌、抗癌、发汗等作用[3-5]。本研究以“后下”品种肉桂预煎液为例，以有效成分含量变化作为观察指标，采用HPLC法测定有效成分肉桂酸的含量，研究不同储存温度及时间对肉桂袋装预煮液质量稳定性的影响，并为今后制订“后下”中药预煎液储存规范提供一定的科学依据。肉桂酸有多种含量测定方法，包括HPLC法[6]、近红外定量校正法[7]、液相色谱串联质谱法[8]等，其中，HPLC法具有较多优点，如速度快、分辨率高等[9]。因此，笔者首先考虑使用HPLC法测定肉桂预煎液中有效成分肉桂酸的含量。
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美国Agilent公司1100系列HPLC仪(在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)；瑞士梅特勒-托利多公司METYLER AE240型十万分之一电子天平；上海科导超声仪器公司SB 3200-T超声发生器。
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肉桂酸对照品（批号：6648，上海诗丹德生物科技有限公司）；甲醇和乙腈均为色谱纯（美国Merck 公司），甲酸为色谱纯（SIGMA 公司），水为超纯水；肉桂预煎液（批号：191213，上海同济堂药业）。
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色谱柱为Agilent Zorbax C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：0.1%甲酸溶液-乙腈（60:40），比例流速1.0 ml/min，柱温25 ℃；进样量5 μl；检测波长：275 nm，分析时间：16 min。
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精密称取肉桂酸对照品10.21 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.021 mg/ml的肉桂酸对照品储备液，置冰箱4 ℃保存。
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取适量肉桂预煎液，12 000× g离心5 min，取上清液滤过，取续滤液，即得。
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取供试品和对照品溶液，按“2.1 色谱条件”项下进样分析，得液相色谱图，见图1，肉桂酸的保留时间为13.8 min，色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数大于5 000。结果表明，肉桂酸色谱峰与其他成分色谱峰得到较好的分离。
图 1 肉桂酸HPLC色谱图
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采用逐级稀释法，精密量取适量对照品溶液，置于10 ml容量瓶中，加入甲醇定容，得到肉桂酸的浓度分别为10.21、20.42、51.05、102.10、204.20 μg/ml系列的对照品溶液，按“2.1”项下进样。以浓度为横坐标(X)，色谱峰面积值为纵坐标(Y)进行线性回归，得到线性回归方程：Y=48.32X+8.819，r=0.999 9。结果表明肉桂酸在10.21~204.20 μg/ml范围内线性良好。
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取低、中、高3个浓度（20.42、51.05、102.10 μg/ml）对照品溶液，按“2.1”项下进样分析，1 d内重复测定3次，连续3 d测定，记录色谱峰面积，考察日内和日间精密度，结果肉桂酸日内精密度RSD值分别为0.36%、0.96%、0.81%(n=3)，日间精密度RSD值分别为1.67%、1.20%、1.10%；结果显示该方法精密度符合方法学要求，仪器精密度良好。
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取同一批次肉桂预煎液，共6份，按“2.2.2”项下方法操作制备供试品溶液，按“2.1”项下进样分析，记录峰面积，结果肉桂酸预煎液中肉桂酸峰面积的RSD为1.12%，表明该方法的重复性良好。
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按“2.2.2”项下方法操作制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、24、48 h测定供试品溶液中肉桂酸的含量，考察供试品常温下放置稳定性，肉桂酸RSD为1.13%，结果表明样品溶液在48 h内稳定性良好。
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精密吸取1 ml肉桂预煎液，置于含51.05 μg肉桂酸(氮气挥干)离心管中，涡旋30 s，平行操作5份，按“2.2.2”项下方法操作制备供试品溶液，按“2.1”项下进样分析，计算加样回收率，结果如表1所示，肉桂酸的平均加样回收率为98.9%（RSD=1.9%，n=5），结果表明该方法回收率良好。
表 1 加样回收试验结果
样品含量(m/μg) 对照液加入量(m/μg) 测得量(m/μg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 47.68 51.05 97.02 96.7 98.9 1.9 47.68 51.05 97.64 97.9 47.68 51.05 97.89 98.4 47.68 51.05 99.09 100.7 47.68 51.05 99.30 101.1 -
取3袋肉桂预煎液于当日（第0天）测定肉桂酸的含量，按“2.2.2”项下方法操作制备溶液，按“2.1”项下进样分析，以峰面积外标法计算含量。剩余袋装药液分组保存在4 ℃（冷藏组）、25 ℃(常温组)、40 ℃（高温组）恒温条件下，1、3、7、14、21、30 d后重复上述步骤，检测肉桂酸的含量。应用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据以（
${\overline x} \pm{s} $ ）表示。多组间差异比较采用单因素方差分析，两组间差异比较采用LSD法，检验水准（α）为 0.05。结果如表2所示，与储存第0天相比，常温储存21、30 d，高温温储存14、21、30 d测得的肉桂酸含量均显著降低（P<0.01），其他组未发现明显变化（P>0.05）。表 2 不同储存条件下肉桂预煎液中肉桂酸含量的变化(
${\overline{ x}} \pm{ s} $ ，n=3，μg/ml)组别 储存时间（t/d） 0 1 3 7 14 21 30 冷藏组（4 ℃） 47.27±0.66 47.09±0.73 47.64±1.08 46.51±0.65 46.13±0.73 46.33±0.68 46.28±1.14 常温组（25 ℃） 47.27±0.66 47.66±0.27 47.54±1.14 47.62±0.63 47.15±0.69 42.49±0.54** 38.02±0.60** 高温组（40 ℃） 47.27±0.66 47.30±0.22 47.18±0.61 47.07±0.69 44.38±0.66** 38.90±0.41** 33.31±0.56** ** P<0.01，与第0天比较。 -
中药材从固体饮片变为液体煎剂，质量处于不稳定状态，其后期的质控和管理显得尤为重要[10]。本实验以本院常用“后下”品种肉桂为例，建立有效成分肉桂酸的HPLC含量测定方法，在所确定的实验条件下，该分析方法快速、准确、方便；应用该方法对其不同放置条件和时间的稳定性进行系统考察，为制订本院“后下”品种预煎液内部质量控制标准提供了实验依据。
预实验中比较了水、甲醇、乙腈、甲酸、铵盐溶液等不同的流动相体系，最终选择0.1%甲酸-乙腈（60:40）作为流动相进行等度洗脱，样品中肉桂酸的待测成分峰形较好，与其他成分可达到基线分离。通过DAD进行全波长扫描分析肉桂酸的紫外光谱，275 nm波长下肉桂酸有较高吸收峰，出峰处无干扰成分，因此选用275 nm作为检测波长。
将有效成分含量变化作为观察指标，兼顾普通患者家庭环境温度，分析考察放置环境和时间对肉桂预煎液稳定性的影响。结果发现冷藏（4 ℃）储存的药液在30 d内基本稳定；常温（25 ℃）储存21、30 d后，肉桂酸的浓度显著下降，分别降到最初浓度的89.9%和80.4%；高温（40 ℃）储存14、21、30 d后，肉桂酸的浓度分别降到最初浓度的93.7%、82.3%和70.5%。由此可见，低温保存肉桂酸较稳定，冷藏有利于肉桂预煎液的稳定性。
综上，本实验建立的分析方法为肉桂预煎液的质量控制提供了一种可靠的方法，为后续制订含量的质量控制范围奠定了基础，并为今后制订“后下”中药预煎液储存规范提供了一定的科学依据。
Study on the stability of the effective components cinnamic acid in the decoction of cinnamon
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摘要:
目的 建立高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法测定肉桂预煎液中有效成分肉桂酸的含量，研究不同储存温度和时间对肉桂酸稳定性的影响。 方法 采用HPLC-DAD法，色谱柱为Agilent Zorbax C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：0.1%甲酸溶液-乙腈（60:40），比例流速1.0 ml/min，柱温25 ℃；进样量5 μl。检测波长275 nm；肉桂预煎液分别置于低温（4 ℃）、常温（25 ℃）、高温（40 ℃）条件下储存，分别于第0、1、3、7、14、21、30天检测肉桂酸的含量。 结果 肉桂酸在该条件下分离良好，在10.21~204.20 μg/ml浓度范围内线性关系良好，其精密度、重复性、稳定性和加样回收率均良好；与储存第0天相比，常温储存21、30 d，高温储存14、21、30 d测得肉桂预煎液中肉桂酸的含量均显著降低（P<0.01），其他组未发现明显变化（P>0.05）。 结论 该HPLC-DAD 法稳定性、重复性好，快速便捷；肉桂代煎液冷藏30 d内有效成分肉桂酸比较稳定。 Abstract:Objective To develop a high-performance liquid chromatography-diode array detector (HPLC-DAD) method for determination of cinnamic acid in the decoction of cinnamon, and investigate the effect of different storage temperature and time for the stability of cinnamic acid. Methods An HPLC- DAD method was established. Separation was performed on an Agilent Zorbax C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with 0.1% formic-acetonitrile acid water solution (60:40) as the mobile phase by isocratic elution. The flow rate was 1.0 ml/min, the temperature of column was 25 ℃, the injection volume was 5 μl, the detective UV wave length was 275 nm. The decoction were stored under refrigerated temperature (4 ℃) ambient temperature (25 ℃) and high temperature (40 ℃). The cinnamic acid was detected after 0, 1, 3, 7, 14, 21, 30 d. Results Cinnamic acid was successfully separated by this method, with good linear relationship between 10.21-204.20 μg/ml. The precision, repeatability, stability and recovery were good. Compared with the zero day, the content of cinnamic acid in the decoction of cinnamon decreased significantly (P<0.01) after 21 days and 30 days of ambient temperature storage and after 14 days, 21 days and 30 days of high temperature storage, but no significant change was found in the other groups (P>0.05). Conclusion This HPLC-DAD method had good stability and repeatability. Cinnamic acid was stable in the decoction of cinnamon for 30 days under refrigerated temperature. -
Key words:
- HPLC /
- decoction of cinnamon /
- cinnamic acid /
- stability
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卡培他滨是一种新型的氟尿嘧啶类口服药，它是5-氟尿嘧啶（5-FU）的前体药物。卡培他滨口服给药方便、依从性好、疗效确切，是治疗结直肠癌的基石药物，但在治疗过程中产生的不良反应（手足综合征等）极大地影响了患者的治疗。手足综合征（HFS）是卡培他滨引起的不良反应中较为特殊的反应，也是卡培他滨在治疗过程中的药物剂量限制性不良反应，主要表现为皮肤红肿、水泡、出血、疼痛。合并使用环氧合酶、尿素霜、维生素B6、奥美拉唑也不能完全阻断手足综合征的发生[1-3]；合并使用中草药如白芍、桂枝、甘草等可降低手足综合征的发生率[4]。口服卡培他滨的患者手足综合征发生率高达60%[1]，严重降低患者用药依从性，严重手足综合征（约17%）的患者只能减少药物摄入量乃至停止服用药物，影响化疗按期、足量进行[5-6]。明确手足综合征的发生机制和有效干预对卡培他滨安全有效的应用具有重要价值。目前手足综合征模型的建立还没有统一的金标准，本实验尝试用ICR小鼠灌胃卡培他滨后建立手足综合征模型，为卡培他滨致手足综合征模型的建立及机制研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 动物与药品
雄性ICR小鼠，SPF级，5周龄左右，共42只小鼠，小鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。经上海中医药大学动物伦理委员会批准，实验动物伦理审查号为PZSHUTCM210715004。将小鼠随机编号1~42号，对照组ICR小鼠6只，实验组ICR小鼠36只。卡培他滨（商品名希罗达，上海罗氏制药有限公司，规格：0.5 g/片，国药准字号H20073024）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）(国药集团)；离心管（Titan公司）；动物解剖手术器材（瑞沃德公司）；消毒酒精、棉花球、锡箔纸（国药集团）。
1.2 饲养条件与环境
造模前小鼠先饲养1周，保证充足的水源与饲料，42只ICR小鼠自由摄取食物，环境湿度保持区间50%~60%（±5%），控制温度在(23±1) ℃，调节光照为12 h（6: 30至18: 30光照），其余时间为光暗周期。定期观察小鼠培养环境，定期为小鼠更换垫料，清理排泄物。
1.3 给药剂量、方式及周期
卡培他滨0.5 g/片，溶解于10 ml CMC-Na（0.5%）中，制得50 mg/ml悬浊液备用。实验组ICR小鼠（36只），灌胃给药，按275 mg/kg（即小鼠0.15 ml/30g）连续灌胃14 d，2次/d（按照卡培他滨临床给药方案1 250 mg/kg，2次/d的剂量换算）。对照组ICR小鼠（6只），灌胃给予CMC-Na（0.5%）溶液，按照4 ml/kg剂量连续的灌胃14 d，2次/d。
1.4 手足综合征阳性判断标准
1.4.1 小鼠手足综合征观察
取ICR小鼠的后足跖部皮肤组织，用生理盐水冲洗并擦干，以多聚甲醛（4%）对小鼠组织进行固定，石蜡包埋切片，使用苏木精-伊红对小鼠组织染色（H&E染色），使用普通光镜（比例尺5 μm）检测（注：染色呈现蓝色的为表皮层，该层位于淡粉色的角质层和淡蓝色的真皮层之间）。每天肉眼观察，若小鼠出现足跖部特征性改变，立即拍照并记录手足综合征发生时间，每3 d拍照记录小鼠足跖部皮肤变化情况。
1.4.2 小鼠体重观察
实验组与对照组自由饲养1周后称重，记录原始体重，灌胃给药后每3 d对所有实验小鼠称重一次并记录体重变化。
1.4.3 手足综合征阳性参考标准
标准参考美国国家癌症研究所（NCI）关于手足综合征的分级规定，建模实验中若实验小鼠足跖部的皮肤呈现了红色斑块、组织肿胀、角质层脱屑、溃疡、角质层厚度明显增加及其他明显体征者均可判定为手足综合征阳性。
1.5 样本收集方案
1.5.1 手足综合征阳性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
对于手足综合征阳性的小鼠，在出现手足综合征后，经眼眶采样，用1.5 ml离心管（肝素钠抗凝）取血约0.5 ml，12 000 r/min离心10 min，收集血浆约0.25 ml，置于−80 ℃冰箱冷冻保存。采集小鼠血样后按照实验动物伦理要求规范处死小鼠，用手术剪取小鼠手足部皮肤，生理盐水冲洗后用锡纸包裹住样本并标号。所有样本置于−80 ℃冰箱冷冻保存，所有操作在1 h内完成。
1.5.2 手足综合征阴性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
小鼠经过14 d给药未出现手足综合征阳性反应，则认定该类小鼠为造模失败小鼠，在第15天对该类小鼠统一进行眼眶采血和足趾部皮肤组织样本收集，方法同“1.5.1”。对照组小鼠在第15天收集样本，方法同“1.5.1”。
1.6 统计分析
数据采用平均值±标准差（mean±SD）表示，组与组之间根据数据分布状态比较采用学生t检验或秩检验，P<0.05认为有统计学差异。制图采用Excel或Graphpad 8.0软件。
2. 结果与讨论
2.1 小鼠体重变化及生存状态
通过对比对照组与实验组ICR小鼠体重变化，发现对照组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显增加；而实验组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显降低。表1和图1 为14 d内ICR小鼠的体重变化，实验过程中实验组小鼠死亡3只。
表 1 实验周期内小鼠体重变化情况（m/g，$ \bar{x}\pm s $ ）组别 n 0 d 7 d 14 d 对照组 6 28.54±0.71 32.56±0.88 34.66±1.07 实验组 33 29.07±0.76 26.84±1.74*** 23.15±2.31*** *** P<0.001，与对照组比较。 2.2 小鼠手足综合征病理观察
与对照组ICR小鼠相比，19只实验组小鼠的足底皮肤明显出现红斑、肿涨并出现少许水泡（图2），认为该小鼠出现手足综合征，按照伦理要求将小鼠处死，收集足底皮肤组织样本和血浆样本。
2.3 小鼠足底皮肤H&E染色
将ICR小鼠四肢皮肤用4%多聚甲醛固定后进行H&E染色（因苏木精呈碱性，细胞核内的染色质与胞质内的核酸显紫蓝色；伊红呈酸性，细胞质和细胞外基质中的成分显红色），如图3显示。与正常ICR小鼠相比，手足综合征阳性小鼠皮肤表皮层增厚，角质层呈现粉红色，真皮层呈现浅蓝色，表皮层处在二者之间呈现蓝色。发生HFS小鼠皮肤颗粒层变薄，基底层和棘层间细胞数量减少。正常小鼠角质层明显较薄。
2.4 小鼠手足综合征发生率
ICR小鼠共39只（对照组6只，实验组33只），19只实验组ICR小鼠出现手足综合征阳性症状，发生率为57.58%。实验组ICR小鼠灌胃给药1周，出现手足综合征阳性小鼠与未出现手足综合征小鼠相比：实验组小鼠足底皮肤颜色变深（深红色），少量小鼠四肢掌心有透明水泡样组织出现；在灌胃给药10 d后，实验组小鼠出现手足综合征阳性症状，四肢出现了红斑、脱屑、水泡（红斑出现最多，脱屑其次，水泡最少）等情况。
2.5 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析
将收集的血浆样本按照前期报道的方法进行卡培他滨及其5种代谢产物（5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、去氧氟尿苷、5'-氟-2'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮[7]）定量（ng/ml，mean±SD）。结果发现，发生手足综合征小鼠与未发生手足综合征小鼠相比，卡培他滨浓度(ng/ml)分别为(58.08±44.54)和(39.23±26.98)，5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷浓度(ng/ml)分别为(
6047.42 ±3331.94 )和(4442.77 ±2140.44 )，去氧氟尿苷浓度(ng/ml)分别为(2899.28 ±1821.15 )和(2018.81 ±1037.86 )，5'-氟-2'-脱氧尿苷浓度(ng/ml)分别为(112.89±36.85) 和(122.23±19.16)，5-氟尿嘧啶浓度(ng/ml)分别为(46.86±23.08)和(38.33±20.62)，5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮浓度(ng/ml)分别为(24.45±14.79)和(27.34±17.84)。卡培他滨及其代谢产物在发生和未发生手足综合征小鼠体内暴露水平均无明显差异（P>0.05，图4）。
图 4 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析注：Cap：卡培他滨；5-DFCR：5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷；5-DFUR：去氧氟尿苷；2-DFUR：5'-氟-2'-脱氧尿苷；5-FU：5-氟尿嘧啶；FUH2：5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮。3. 讨论
体内药物暴露水平同药物疗效和不良反应密切相关。目前药物暴露水平常用的参数有曲线下面积（AUC）、稳态浓度（css）、峰浓度（cmax）、谷浓度（cmin）等。有研究发现[8]，根据5-FU的AUC调整给药剂量后，患者血液系统出现3~4级不良反应发生率从之前的17.5%下降为 7.6%（P<0.05），黏膜炎的发生率也从5%降低为0%（P<0.01），总生存时间显著增加，从原来的16个月延长到22个月（P<0.01）。因此，5-FU在体内浓度可能成为预测疗效及不良反应的潜在预警生物标志物之一[9-10]。本研究中未发现卡培他滨及其代谢产物同手足综合征具有相关性，但Daher Abdi在20名75岁以上老年患者中发现，卡培他滨及其代谢产物在发生手足综合征患者体内暴露水平明显较高[11]，但体外研究表明，5-FU同手足综合征无明显关联[12]。另有研究表明，手足皮肤局部较高表达的胸苷磷酸化酶可产生局部较高浓度的5-FU，同卡培他滨引发的手足综合征密切相关[13]。总之，卡培他滨引发手足综合征的机制仍需进一步研究。
在卡培他滨致手足综合征模型的建立方面，黎鹏等灌胃给予SD大鼠200~400 mg/d，2次/d，用药1~2周（1周后停药3 d），建立了卡培他滨致手足综合征模型，并认为200 mg/kg的剂量，灌胃2周可较好地建立手足综合征模型（造模成功率77.5%）[14]。但有研究显示，卡培他滨在大鼠体内的代谢过程与人体不同，因大鼠体内胞苷脱胺酶活性较低，5-DFCR通过糖基化生成其他产物，产生的5-FU较少，而卡培他滨在小鼠体内的代谢过程与人体基本相同，可能是最好的动物模型[15-16]；Hiromoto [3]等利用ICR小鼠，灌胃给予200 mg/kg，1次/d，5次/周的方法建立手足综合征模型，3周建立手足综合征模型，但成功率未报道。He和Chen等给予ICR小鼠灌胃200 mg/kg，1次/d，连续灌胃30 d后，6只小鼠中仅有1只未发生手足综合征[17]。前期预实验中，采用灌胃200 mg/kg，2次/d的方法在ICR小鼠上建立手足综合征模型，灌胃1周后，6只小鼠仅有1只发生手足综合征。因此，根据临床卡培他滨用药剂量（1 250 mg/kg，2次/d）换算小鼠剂量为275 mg/kg，2次/d，既缩短了给药时间，又提高了建模成功率（57.6%），且较少有小鼠死亡（3只）。
4. 小结
本实验成功建立了卡培他滨致手足综合征的ICR小鼠模型，在给药时长、造模成功率方面均有一定优势。卡培他滨及其代谢产物在小鼠体内暴露浓度同手足综合征发生可能无关。手足综合征的发生机制仍需进一步研究。
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表 1 加样回收试验结果
样品含量(m/μg) 对照液加入量(m/μg) 测得量(m/μg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 47.68 51.05 97.02 96.7 98.9 1.9 47.68 51.05 97.64 97.9 47.68 51.05 97.89 98.4 47.68 51.05 99.09 100.7 47.68 51.05 99.30 101.1 
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表 2 不同储存条件下肉桂预煎液中肉桂酸含量的变化(
${\overline{ x}} \pm{ s} $ ，n=3，μg/ml)组别 储存时间（t/d） 0 1 3 7 14 21 30 冷藏组（4 ℃） 47.27±0.66 47.09±0.73 47.64±1.08 46.51±0.65 46.13±0.73 46.33±0.68 46.28±1.14 常温组（25 ℃） 47.27±0.66 47.66±0.27 47.54±1.14 47.62±0.63 47.15±0.69 42.49±0.54** 38.02±0.60** 高温组（40 ℃） 47.27±0.66 47.30±0.22 47.18±0.61 47.07±0.69 44.38±0.66** 38.90±0.41** 33.31±0.56** ** P<0.01，与第0天比较。
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