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复方首乌藤合剂是我院研制的特色制剂，主要由首乌藤、合欢皮、菟丝子、五味子、续断、蔓荆子、川芎、煅牡蛎八味药材配制而成，方中首乌藤为君药，合欢皮为臣药，菟丝子、五味子、续断为佐药，川芎、蔓荆子、煅牡蛎为使药，诸药合用，具有养心安神解郁、滋阴养肝、行血活气之功效，临床应用于神经衰弱性失眠、眩晕及脑外伤引起的头痛、头晕等症[1]。目前，该制剂的质量标准中主要控制其总黄酮、二苯乙烯苷含量[2]，未包含多糖含量控制，相关研究表明，多糖具有预防、改善、治疗失眠的作用，且滋阴养肝效果明显[3-6]。因此，探究复方首乌藤合剂总多糖含量及多糖组成很有必要，本文在前期研究的基础上 对该制剂粗多糖的组成及总多糖含量进行了分析，现报道如下。
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复方首乌藤合剂为本院自制（规格：40 ml，批号：201906132，201906133，201906211，20190624）；D-甘露糖(批号：140651-201504，质量分数99.4%)、D-盐酸氨基葡萄糖(批号：140649-201606，质量分数100%)、半乳糖(批号：160226-201506，质量分数100%)、D-葡萄糖(批号：110833-201707，质量分数99.9%)、D-半乳糖醛酸(批号：111646-201702，质量分数95.1%)，L-阿拉伯糖(批号：111506-200202，质量分数100%)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、三氟乙酸（TFA）均购自中国食品药品检定研究院；氢氧化钠、盐酸、甲醇、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、苯酚、无水乙醇均为分析纯; 水为本院自制纯化水。
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紫外可见分光光度计（UNIC UV-2102 PCS，日本岛津）；Agilent 1200高效液相色谱系统(DAD检测器，美国Agilent公司)；电子分析天平(AUX220，日本岛津)；磁力加热搅拌器(KQY78-1，金坛市科析仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(HH系列，金坛市科析仪器有限公司)；电动离心机(LD5-2A，北京医用离心机厂)；电热鼓风干燥箱(101A-1E，上海实验仪器有限公司)；超声清洗器(KQ-500B，昆山市超声仪器有限公司)；真空干燥箱(DZF-6050，上海医用恒温设备厂)。
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精密吸取25 ml复方首乌藤合剂，加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿:正丁醇=5:1）20 ml，在磁力搅拌器上搅拌30 min，离心20 min(50 Hz，4000 r/min)，回收上清液，去除蛋白质及有机溶剂；乙醇沉淀：向上清液中加入3倍体积的95%的乙醇，保持乙醇浓度在70%以上，静置过夜。离心15 min，收集沉淀物，80 ℃真空干燥3 h，得到相应批号的复方首乌藤合剂多糖粉末。
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精密称取105 ℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖0.1 g，置于100 ml容量瓶中，加水定容至刻度，备用。
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精密称取复方首乌藤合剂多糖粉末0.1 g，置于250 ml容量瓶中，加水定容至刻度，得供试品原液；再精密吸取3 ml供试品原液至10 ml容量瓶中，加水定容，即为供试品溶液。
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精密吸取对照品储备液6.0 ml，置于100 ml量瓶中，加水定容至刻度，即得对照品溶液。精密吸取对照品溶液1.0 ml，置于10 ml量瓶中，加入4%的苯酚溶液1.0 ml，振荡摇匀，然后加入7 ml浓硫酸，立即摇匀，100 ℃水浴15 min，然后冰浴15 min，冷却至室温。以相应试剂为空白，在400～550 nm范围内扫描光谱。结果发现，对照品溶液在486nm处有最大吸收，故选择486 nm。
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精密吸取葡萄糖对照品储备液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分别置10 ml量瓶中，用水定容至刻度。然后各精密吸取1.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加入4%的苯酚溶液1.0 ml，振荡摇匀，然后加入7 ml浓硫酸，立即摇匀，100 ℃水浴15 min，然后冰浴15 min，冷却至室温，在486 nm波长处测定吸光度(Y)。以Y为纵坐标，浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程：Y= 0.007X + 0.0105，r = 0.9982。
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精密量取“2.2.1”项下的对照品溶液1.0 ml，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，连续测定6次，根据标准曲线方程计算多糖含量，求RSD。结果得到RSD为0.24% (n=6)，表明仪器精密度良好。
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精密量取供试品溶液（批号：20190624）1.0 ml，置10 ml量瓶中，按“2.3.1”项下方法测定吸光度。在显色后0、10、20、40、60、80、100、120 min分别测定吸光度，求RSD。结果得到RSD为3.54% (n=7)，表明该制剂多糖提取液在显色后120 min内稳定性良好。
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取复方首乌藤合剂（批号：20190624）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，计算多糖含量。结果测得6份供试品溶液中多糖的平均含量为18.23 mg/ml，RSD为0.33%(n=6)，表明该方法重复性良好。
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精密量取已知浓度为61 μg/ml的供试品溶液（批号：20190624）6份，每份0.5 ml，各加入0.5 ml浓度为63 μg/ml的葡萄糖对照品溶液，按“2.3.1”项下方法操作，于486 nm波长处测定吸光度，计算加样回收率。结果显示该方法的平均加样回收率为100.45%,RSD为1.57% （见表1）。
表 1 复方首乌藤合剂加样回收率试验结果（n=6)
样品加入量 (μg) 葡萄糖加入量 (μg) 吸光度 测定量 (μg) 回收率 (%) 平均回收率 (%) RSD (%) 30.50 31.50 0.445 62.00 100.00 100.45 1.57 30.50 31.50 0.442 61.67 99.46 30.50 31.50 0.457 63.33 102.15 30.50 31.50 0.456 63.67 102.69 30.50 31.50 0.441 61.33 98.92 30.50 31.50 0.453 61.67 99.46 -
按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，计算多糖含量。用外标法计算总多糖含量(以葡萄糖计)，结果见表2。
表 2 复方首乌藤合剂含量测定结果（n=3）
批号 总多糖含量/(mg/ml) 平均值/(mg/ml) RSD/(%) 201906211 14.24 14.24 0.25 201906211 14.20 201906211 14.27 201906132 21.09 21.09 0.66 201906132 20.95 201906132 21.23 201906133 17.76 17.85 0.66 201906133 17.80 201906133 17.98 20190624 18.15 18.17 0.58 20190624 18.07 20190624 18.28 -
称取各单糖对照品: D-甘露糖、D-盐酸氨基葡萄糖、D-半乳糖醛酸、D-无水葡萄糖、半乳糖、L-阿拉伯糖等各约10 mg，精密称定，分别置于5 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
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取多糖粉末（批号：20190624）150 mg，精密称定，置于10 ml 具塞试管中，加水 3 ml，再加TFA3 ml，封管于110 ℃烘箱中水解1 h，取出，放冷，水浴蒸干，用甲醇1 ml溶解，蒸干，重复处理 3 次以除去残留的 TFA，残渣加水溶解[9]，转移至 5 ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。
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取上述 6种单糖对照品溶液各50 μl置于同一10 ml EP管中，供试品溶液1.0 ml置于10 ml EP管中，分别加入 1.0 ml 0.5 mol/L的PMP/甲醇溶液和1.0 ml 0.3 mol/L的氢氧化钠溶液，混合均匀，70 ℃水浴50 min，取出后冷却至室温，分别加入1.0 ml 0.3 mol/L的盐酸溶液中和，再加入2 ml氯仿萃取，取上清液，重复处理 3 次，除去未反应的PMP，0. 22 μm 滤膜滤过[9]，即得。
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色谱柱:Agilent Exted-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温:30 ℃；流动相:乙腈(A) - 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH =6.8)(B)等度洗脱(A:B=16:84)；流速:1.0 ml/min；检测波长250 nm；进样量:20 μl。
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精密吸取适量“2.5.2”项下供试品溶液及“2.5.1”项下对照品溶液，按照“2.5.3”项下衍生方法进行衍生，按照“2.5.4”项下色谱条件进样，分别得到供试品溶液色谱图(图1），从复方首乌藤合剂多糖中识别出甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等6 种单糖。
图 1 复方首乌藤合剂多糖色谱图
根据5次各单糖的峰面积比测定结果进行计算，甘露糖:盐酸氨基葡萄糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=9.10:0.26:1.00:3.02:4.14:2.12，可见甘露糖的峰面积占比接近50%，提示甘露糖可能是复方首乌藤合剂发挥特殊药效的原因之一。
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采用苯酚-硫酸法预实验时，发现供试品和对照品溶液如无水浴和冰浴处理，可能造成供试品过热且结果不稳定；若冰浴后无冷却至室温操作，吸光度结果偏小，故本实验选择先水浴，再冰浴，冷却至室温来避免以上情况出现。
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在考察流动相时，发现乙腈比例大于25%时，各个色谱峰之间的分离度达不到要求；另外，如采用梯度洗脱方法，色谱峰6（半乳糖）与7（阿拉伯糖）之间分离度达不到要求，故选择等度洗脱。综合考虑，选择0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=6.8)等度洗脱作为本实验流动相。
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复方首乌藤合剂是由首乌藤、合欢皮、菟丝子、五味子、续断、蔓荆子、川芎、煅牡蛎八味药材配制而成的中药复方制剂，甘露糖的峰面积占比接近50%。根据相关研究发现，首乌藤中单糖成分以阿拉伯糖及半乳糖为主[10]；合欢皮多糖较高，但未对单糖组分进行分析 [11]；菟丝子多糖的主要组成是甘露糖，且含量最高[12]；五味子以葡萄糖为主，甘露糖含量低[13]；蔓荆子多糖含量较低[14]；川芎多糖以葡萄糖及半乳糖为主[15]。综上可知，甘露糖可能主要来源于菟丝子，葡萄糖可能主要来源于五味子、川芎，阿拉伯糖可能主要来源于首乌藤。
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综上所述，采用苯酚硫酸法结合紫外分光光度法可以较为准确测定复方首乌藤合剂总多糖含量，柱前衍生化法结合高效液相色谱适用于分析该制剂多糖水解产物中的单糖组分，上述方法可为复方首乌藤合剂多糖质量控制提供参考。
Determination of total polysaccharide content and analysis of monosaccharide components in the caulis polygoni multiflori mixture
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摘要:
目的 建立复方首乌藤合剂总多糖含量测定方法，并分析多糖组分。 方法 采用水提醇沉法提取复方首乌藤合剂多糖，经苯酚-硫酸法处理后，再利用紫外分光光度法测定该制剂中总多糖含量；另外，多糖经三氟乙酸水解后，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生多糖水解产物，再利用高效液相色谱法，依利特krosmasil-C 18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：30 ℃，以乙腈-0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8)（18：82）为流动相，进行等度洗脱；流速：1.0 ml/min；检测波长250 nm，进样量：20 μl。分析4批次复方首乌藤合剂多糖中的单糖组分。 结果 D-无水葡萄糖质量浓度在21~105 μg/ml范围内与吸光度线性关系良好，线性回归方程为Y= 0.007X + 0.010 5，r = 0.998 2；平均加样回收率为(100.45±1.57)% (n=6)；4 批样品测得的总多糖平均含量为14.24、21.09、17.85、18.17 mg/ml；复方首乌藤合剂多糖主要由甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等6个单糖组成，各个单糖峰面积比约为9.10：0.26：1.00：3.02：4.14：2.12。 结论 该方法准确、可靠，可用于该制剂中总多糖含量测定及单糖组分分析。 Abstract:Objective To establish a method for analyzing total polysaccharide content and its monosaccharide composition in the caulis polygoni multiflori mixture. Methods The polysaccharides of the caulis polygoni multiflori mixture were extracted by water-extraction and alcohol-precipitation. After the treatment with phenol-sulfuric acid, the content of total polysaccharides in the preparation was determined by ultraviolet spectrophotometry. In addition, after the polysaccharide was hydrolyzed into monosaccharides wtih trifluoroacetic acid, the hyrolysate was derivatized with PMP, and then the PMP derivates of monosaccharides were analyzed by HPLC method. Yilite krosmasil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used at 30 ℃. Acetonitrile-0.1% NaH2PO4 (pH=6.8) (16:84) was the moblie phase with a flow rate of 1.0 ml/min. The detecting wavelength was at 250 nm. The injection volume was 20 μl. Results concentration of D-anhydrous glucose in the range of 21 ~ 105 μg/ml had a good linear relationship with the absorbance. The linear regression equation was A= 0.007x+0.0105, r=0.9982. The average recovery rate was (100.45±1.57)% (n=6). The average contents of total polysaccharides in four batches of samples were 14.24, 21.09, 17.85 and 18.17 mg/ml. The polysaccharide of the caulis polygoni multiflori mixture mainly consisted of D-mannose, D-glucosamine D-hydrochloride, D-Galacturonic acid, D-glucose, galactose, L-arabinose. The monosaccharides peak area ratios were about 9.10:0.26:1.00:3.02:4.14:2.12. Conclusion The method is accurate and reliable, and can be used for the determination of total content of polysaccharides and the analysis of monosaccharide composition in the preparation. -
生脉注射液临床上常用于辅助治疗心肌梗塞、心源性休克、脓毒症和感染性休克。心肌梗塞引起组织产生大量氧自由基，直接损伤心肌细胞并触发细胞凋亡，免疫介导的炎症损伤会加大心梗范围和心梗损伤[1]。心源性休克激活的炎症反应可诱导产生大量NO，促进细胞凋亡[2]。脓毒血症是由细菌引起的全身性炎症，大量致炎因子破坏机体的免疫平衡，从而导致机体代谢紊乱[3]，严重者可能引起感染性休克。本研究特选择抗氧化及抗炎能力作为生物效应指标，考察生脉注射液质量与生物效应之间的相关性。
课题组前期对生脉注射液中11种成分[4]进行了指认并进行了定量，均符合药典标准。药理学实验表明，生脉注射液中人参皂苷、木质素和麦冬皂苷等多种化学成分均在细胞及动物模型上表现出良好的抗炎效果[5-8]，且临床研究表明其可以通过抗炎通路发挥对器官损伤的保护作用[9-10]。现今生物效应评价在中药材和中成药质量控制研究中有所应用[11-12]，2015版《中国药典》收录了生物活性测定法作为质量控制标准，如洋地黄生物测定法和黄体生成素生物测定法，说明通过生物效应控制药品质量是可行的。
抗炎和抗氧化损伤是生脉注射液产生药理作用的重要机制，但现今的质量标准仅对化学成分进行定性定量分析，不能全面体现其整体的药效活性，为此，本研究尝试通过评价其抗氧化能力以及抗炎活性，建立有效的生脉注射液生物学质量控制方法。
1. 材料
1.1 试剂与药品
二苯基苦基苯肼（DPPH，质量分数≥97%，含10%～20%苯，批号：PRPDE-JO，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；水溶性维生素E (Trolox)、DMEM培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自北京Solarbio公司；胎牛血清（FBS，德国PAN Seratech公司）；N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；无水乙醇（北京化工厂）；水（屈臣氏）。
9批次生脉注射液分别由5个不同厂家生产，样品详细情况见表1。
表 1 生脉注射液样品来源、批号及有效成分含量(μg/ml)[4]编号 生产厂家 批号 规格 人参皂苷Rb1 人参皂苷Re 人参皂苷Rg1 五味子醇甲 麦冬皂苷D S1 A 16120401005 10 ml/支 61.16 51.39 84.69 51.43 1.48 S2 B 160502 10 ml/支 101.69 55.61 88.99 73.09 3.42 S3 C 17071014 10 ml/支 56.99 44.87 80.42 36.78 1.68 S4 C 17040423 20 ml/支 63.12 44.51 81.54 39.63 1.28 S5 D 1704252 20 ml/支 77.15 62.10 86.11 29.05 3.62 S6 E 17091302 10 ml/支 85.52 57.74 88.45 33.55 1.40 S7 E 17092903 10 ml/支 80.43 41.52 86.36 37.30 1.33 S8 E 17061103 20 ml/支 74.88 61.06 80.00 35.18 1.72 S9 E 17053005 20 ml/支 79.97 48.54 80.34 44.83 1.59 1.2 主要仪器及设备
电子分析天平（AB265-S，梅托勒-托利多有限公司）；超声波清洗仪（B25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）；TS-2000A脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；96孔板、多功能连续波长酶标仪（InfiniteM1000，TECAN公司）；低速离心机（SC-3610，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（MCO-15AC，三洋电机株式会社）。
1.3 细胞培养
RAW264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。培养条件：完全培养基为含10%FBS的DMEM培养基，在37℃含5% CO2的培养箱中培养。每天换液，细胞生长达对数生长期时，传代（传代比例为1:6）并开展实验，实验用细胞控制在10代以内。
2. 方法与结果
2.1 DPPH法评价生脉注射液质量
2.1.1 实验过程
取96孔板，每孔依次加入100 μl初浓度2.0%的受试液、100 μl 0.5 mmol/L DPPH溶液，震荡均匀后避光反应20 min。
测定方法：每孔依次加入100 μl受试液和DPPH溶液，在摇床上振荡均匀，避光反应20 min后，用酶标仪测定波长在517 nm处的吸光度。
2.1.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：分别吸取样品编号为S9的药液，用纯水定容得到浓度为8%的生脉注射液受试液。逐级稀释，测定其吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到的线性关系方程为Y=-0.2081X+1.2209（r=0.9996）（图1-A），表明生脉注射液具有较强的DPPH自由基清除能力且具有浓度依赖性，体积浓度和平均吸光度具有良好的线性关系，在0%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为2.25%（见表2），表明该方法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照"2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.21%（见表2），表明该方法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S9，分别于0、4、8、24、48和72 h，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.47%（见表3），表明该方法在72 h内稳定性良好。
图 1 生脉注射液抗氧化生物活性评价A. 生脉注射液对DPPH清除作用的标准曲线；B. Trolox对DPPH清除作用的标准曲线；C. 1.0%各批次生脉注射液相当于Trolox的量（mmol/L）表 2 1.0%生脉注射液对DPPH清除作用的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 1.063 4 1.087 9 2.25 1.138 9 1.135 6 2.22 2 1.115 6 1.175 6 3 1.098 3 1.135 7 4 1.114 3 1.096 7 5 1.064 9 1.129 2 6 1.070 9 1.137 7 表 3 1.0%生脉注射液对DPPH的清除作用的稳定性时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 1.038 5 1.078 8 2.47 4 1.105 7 8 1.072 2 24 1.080 5 48 1.065 7 72 1.110 0 2.1.3 生脉注射液抗氧化生物活性的质量评价
精密称定Trolox，加入100 μl无水乙醇溶解，纯水定容，得到初浓度为15.46 mmol/L的Trolox溶液。将其逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到的线性关系方程为Y=–0.0789X+1.1674（r=0.9951）（见图1-B），表明Trolox清除DPPH能力在作用浓度0.43~5.56 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液清除DPPH自由基的结果与Trolox比较，折算得到各批次生脉注射液相当于水溶性Trolox的作用浓度（见图1-C）。结果表明，终浓度1.0%的各批次生脉注射液清除自由基能力相对于Trolox作用浓度范围为1.2~1.9 mmol/L，在清除自由基即抗氧化能力方各批次不存在较大差异。
2.2 Griess试剂盒评价生脉注射液的抗炎活性
2.2.1 Griess试剂盒测定生脉注射液抑制NO释放能力
使用完全培养基配制为1.2%的生脉注射液样品溶液，及初浓度100μg/ml的LPS样品溶液。
取对数生长期的RAW264.7细胞，制备成2×106个/ml的细胞悬液，以每孔100 μl注入96孔板。培养24 h后，弃去培养基，每孔加入100 μl样品溶液和100 μl的LPS溶液，孵育24 h后吸取50 μl上清液，按照Griess试剂盒说明书操作，用酶标仪测定波长540 nm处的吸光度。
2.2.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：精密吸取样品编号为S6的药液，用完全培养基制成浓度为4.0%的溶液。逐级稀释，测定吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性方程为Y=–0.033ln(X)+0.243（r=0.9961）（见图2-A），表明生脉注射液具有良好的NO分泌抑制能力并具有浓度依赖性，终浓度和平均吸光度之间具有良好的线性关系，在0.2%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为1.71%（见表4），表明该法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.79%（见表4），表明该法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S6，分别于0、4、8、24和48 h时，配制得到浓度1.2%的溶液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.66%（见表5），表明该方法在48 h内稳定性良好。
图 2 生脉注射液抗炎活性评价A. 生脉注射液对RAW264.7细胞分泌NO的标准曲线；B. L-NAME对RAW 264.7细胞分泌NO的标准曲线；C. 0.60%各批次生脉注射液相当于L-NAME的量（mmol/L）表 4 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 0.276 0 0.272 9 1.71 0.272 9 0.285 0 2.79 2 0.272 3 0.281 1 3 0.265 0 0.289 0 4 0.276 1 0.291 6 5 0.275 0 0.290 6 表 5 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的稳定性考察时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 0.264 5 0.262 3 2.66 2 0.273 6 4 0.257 4 24 0.257 4 48 0.258 6 2.2.3 生脉注射液抗炎生物活性的质量评价
精密称定eNOS抑制剂L-NAME，逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作，测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性关系方程为Y=–0.052ln(X)+0.152（r=0.9957）（见图2-B），表明L-NAME抑制NO分泌能力在0.05~0.55 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液抑制NO分泌能力的结果与L-NAME比较，折算得到各批次生脉注射液相对于L-NAME的作用浓度（见图2-C）。
结果显示，除S2和S8样品外，终浓度0.6%的各批次生脉注射液对应的L-NAME浓度范围均在0.06~0.16 mmol/L范围内，表明在抑制NO分泌能力即抗炎能力方面S2和S8与其他样品存在较大差异。其中S2对应的L-NAME浓度远高于其他样品，其抗炎活性远高于其他样品组，推测这可能与化学成分含量差异有关，需要后续的实验加以证实。
3. 讨论
3.1 实验方法及阳性对照药的选择
测定抗氧化活性常用的方法有氧化自由基吸收能力（ORAC）、二苯基苦基苯肼（DPPH）法和总抗氧化能力检测（ABTS）法等，本实验首先采用DPPH法测定抗氧化能力，该方法操作简便，常用于体外评价化合物的抗氧化活性，其中Trolox和维生素C是常用的抗氧化剂对照药[13-14]，但相较之下，Trolox可通过清除自由基产生抗氧化机制，且具有剂量依赖性[15]，而维生素C稳定性较Trolox差，所以该方法选择了该药作为阳性对照。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）诱导产生NO是NO产生的重要途径[16]，L-NAME作为eNOS抑制剂，选择其作为对照药可以更加直观地评价药物对细胞产生NO的抑制能力。
3.2 结果分析
参考2015版药典生物测定方法，该试验通过测定生脉注射液的抗炎和抗氧化能力，初步建立了生脉注射液的生物效应质量控制方法，该方法不仅能满足方法学要求，而且可以克服现行质量控制方法的局限性，还可以有效的评价中药复方制剂在治疗过程中产生的效应强度，实现“质-量-效”的有效结合[17]。
4. 展望
中药复方是一个组分复杂，不仅化学成分复杂，未知组分众多，而且其可能通过不同成分的配伍产生作用机制，即其药理机制不是单一化学成分能够阐明的，因此，仅对中药复方的化学成分进行评价难以对其成分及作用进行全面阐述。生物效应质量控制方法能对中药复方的整体组分药效进行把控，从药理活性方面评价中药复方质量，弥补现有质控方法的不足。在生物效应质控方法建立过程中，应注意以下问题：①质控方法应根据药效及药理机制研究选择合适的生物效应指标，充分反映该药的药理活性特征；②选择的对照药应具有足够的专属性、关联性和可测性，能够充分准确地反映药物的生物效应[18-20]。参考已有的生物质量控制研究[11，21]并对生脉注射液可能的药理活性进行筛选，对此进行考察。重点考察其方法学验证，结果显示该方法可行性高，方法学符合生物效应评价要求，可以反映生脉注射液的整体生物效应。但抗炎活性的测定实验要求较高的实验操作，且该方法对中药复方的整体生物活性进行测定，并未对可能产生药理活性的化学组分和含量进行探究和测定，可能产生药理活性的化学成分及作用机制尚不明确，值得后续的探讨。
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图 1 复方首乌藤合剂多糖色谱图
A.供试品溶液；B. 对照品溶液；1.PMP；2. D-甘露糖；3. D-盐酸氨基葡萄糖；4. D-半乳糖醛酸；5. D-葡萄糖；6.半乳糖；7. L-阿拉伯糖
表 1 复方首乌藤合剂加样回收率试验结果（n=6)
样品加入量 (μg) 葡萄糖加入量 (μg) 吸光度 测定量 (μg) 回收率 (%) 平均回收率 (%) RSD (%) 30.50 31.50 0.445 62.00 100.00 100.45 1.57 30.50 31.50 0.442 61.67 99.46 30.50 31.50 0.457 63.33 102.15 30.50 31.50 0.456 63.67 102.69 30.50 31.50 0.441 61.33 98.92 30.50 31.50 0.453 61.67 99.46 
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表 2 复方首乌藤合剂含量测定结果（n=3）
批号 总多糖含量/(mg/ml) 平均值/(mg/ml) RSD/(%) 201906211 14.24 14.24 0.25 201906211 14.20 201906211 14.27 201906132 21.09 21.09 0.66 201906132 20.95 201906132 21.23 201906133 17.76 17.85 0.66 201906133 17.80 201906133 17.98 20190624 18.15 18.17 0.58 20190624 18.07 20190624 18.28
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