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缺血性心脏病（Ischaemic heart disease，IHD）由冠状动脉粥样硬化致狭窄/闭塞，引发心肌缺血坏死。IHD是全球主要死因之一，常表现为心肌梗死（Myocardial infarction, MI），MI可引发心力衰竭。在美国，IHD占心力衰竭病因的50%[1]；中国发病率也呈上升趋势[2]。吸烟、高血压等多种因素可致IHD[3, 4]。其发病机制复杂，仍有关键机制未明。
RNA 结合蛋白调控基因表达，与心血管疾病相关[5-11]。Pumilio2（PUM2）属PUF家族，是一种RNA结合蛋白，可抑制靶基因表达[12, 13]，还参与细胞增殖调控[14]。即IHD中，心肌缺血诱发纤维化[15]，PUM2可能通过靶基因影响IHD。本研究用双样本孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）结合实验，探究PUM2与IHD因果关系。
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本研究选择与PUM2显著相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）作为工具变量（IVs），IDH作为结局变量；通过单变量双样本MR分析评估并确定PUM2与IHD之间的因果关系；随后采用异质性检验、多效性检验、MR-PRESSO等方法验证结果的可靠性，并进一步通过敏感性分析确保研究结论的可信度。具体流程如图1所示。
图 1 图１ MR核心假设示意图
在开展MR分析的过程中，需严格遵循以下几项假设：其一，工具变量要与暴露因素存在强关联性（关联性假设）；其二，工具变量不得与结局存在关联（排他性假设）；其三，工具变量应独立于任何与暴露或结局紧密相关的混杂因素（独立性假设）。
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从eQTLGen Consortium（
https://www.eqtlgen.org/phase1.html ）平台下载外周血meta分析的显著顺式eQTL数据，并检索PUM2，获得可用的PUM2顺式eQTL [16]。IDH的数据来FinnGen数据库（https://r12.finngen.fi/ ），包括500348 名研究对象（其中8408 名IDH患者）。IDH按照国际疾病分类第十版（ICD-10）进行诊断。PUM2顺式eQTL和IDH的研究对象均为欧洲人群，且彼此不重叠，能有效减少样本重复引起的偏差，提高研究的准确性和可靠性[17]。 -
MR研究中IVs的筛选严格遵循相关性、独立性和排他性假设，具体步骤如下：SNP的初步筛选：鉴于全基因组显著性水平P≤5×10−8时，与PUM2顺式 eQTL强相关的显著SNP仅2个（数量不足），将筛选阈值调整为P<1×10−5，以获取足量候选SNP；连锁不平衡的排除：采用 r2<0.001且区域宽度10 000 kb的标准，剔除存在连锁不平衡的SNP，确保工具变量的独立性，减少等位基因非随机分布的干扰[18]；遗传信息校准：通过等位基因频率分析指定正向等位基因，并删除回文SNP，保证遗传信息解读的一致性与准确性；弱工具变量的剔除：计算各SNP的F统计量（公式：F=R2（n−k−1）/[k（1−R2）]，其中n为暴露因素全基因组关联研究样本量，k为纳入工具变量数量，R2为SNPs解释的暴露变异比例），剔除F≤10的位点[19]；同时通过R2值计算暴露的方差比例，验证工具变量与暴露因素的强相关性，最终确保纳入MR分析的SNP均满足F>10。经上述步骤筛选后，最终用于MR分析的SNP共4个。
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观察PUM2与IDH之间是否存在双向因果关联。利用异质性、水平多效性分析进行敏感性检验，确保结果可靠稳健。
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本研究借助R 4.4.1软件中的TwoSampleMR 0.6.21包与MR-PRESSO 1.0包MR分析。在分析过程中，以逆方差加权法（inverse-variance weighted, IVW）为主，同时辅以加权中位数法（weighted median estimator, WME），以此评估PUM2与IDH之间的因果关联。由于IVW法具有更高的检验效能，因此将其作为本研究的主要分析方法，研究结果的解释也以该方法所得结果为依据[20]。
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本研究采用多种统计方法对IVs的可靠性进行系统评估。采用Cochran’s Q 检验评估IVs间的异质性，以P>0.05为标准判断无显著异质性[21]；通过 MR-Egger回归分析检测遗传变异的方向性多效性，其截距项可用于评估水平多效性，当P>0.05时提示无显著多效性影响，同时该方法可提供因果效应的一致估计[22]；采用MR-PRESSO进一步识别水平多效性并修正潜在离群点，通过排除异常SNP以优化分析结果[23]；采用留一法（leave-one-out），即逐一排除单个SNP后，以剩余IVs重复双样本MR分析，以此评估单个SNP对总体因果关联的影响程度[24]。所有统计分析以P<0.05为差异具有统计学意义。
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本项MR分析所采用的数据均源自已公开发表的GWAS汇总统计结果。由于在各独立研究开展过程中，相关机构的伦理审查委员会已要求所有参与者提供书面知情同意，因此本研究无需另行申请伦理审批，亦无需再获取参与者的知情同意[25]。
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本研究共筛选到4个敏感SNPs进行PUM2与IDH因果关系的分析，纳入分析的SNPs的具体信息见表1。
表 1 与PUM2及IDH相关的SNPs信息
SNP EA/OA EAF PUM2相关 IDH相关 β SE P F β SE P rs62109732 C/T 0.0376 − 0.1438 0.0320 <0.001 19.2515 − 0.0343 0.0261 0.1887 rs59231157 G/A 0.0367 − 0.1490 0.0323 <0.001 20.1845 − 0.0335 0.0265 0.2066 rs10206812 G/A 0.0376 − 0.1438 0.0320 <0.001 19.2516 − 0.0337 0.0266 0.2049 rs10183906 C/T 0.0376 − 0.1438 0.0320 <0.001 19.2515 − 0.0337 0.0266 0.2047 EA：效应等位基因；OA：其他等位基因；EAF：效应等位基因频率；β：回归系数；SE：标准误 -
本研究主要采用IVW法对双样本MR结果进行分析（图2）。结果显示，PUM2与IDH存在显著的因果关联，即，PUM2水平升高与IDH风险降低相关（OR =
0.7923 ，95%CI：0.6627 ~0.9471 ，P =0.0260 ），为保护性因素（图3）。进一步分析显示，PUM2的加权中位数法和IVW法分析结果方向一致且有统计学意义，见表2。反向MR分析结果则表明IDH对PUM2不存在反向因果关系。
图 2 双样本MR分析散点图
图 3 双样本MR分析森林图
表 2 PUM2与IDH的MR分析结果
暴露因素 结局 方法 Nsnp OR 95% CI P PUM2 IDH IVW 4 0.7923 0.6627 ~0.9471 0.0260 PUM2 IDH WME 4 0.7913 0.6439 ~0.9724 0.0106 IVW：inverse-variance weighted；WME：weighted median estimator -
本研究通过异质性检验、敏感性分析和水平基因多效性检验对结果进行敏感性分析，以确保研究结论的可靠性。异质性检验：采用Cochran’s Q检验评估纳入分析的SNPs异质性。结果显示IVW法及MR-Egger 法的Q值分别为
0.0030 、0.0004 ，P 值分别为0.9999 、0.9998 ，说明所纳入的 SNPs 并不存在显著异质性；基因水平多效性检验：通过MR-Egger-intercept检验评估基因水平多效性，所得截距项为−0.0442 （P=0.9640 ），表明SNPs无明显水平多效性，说明研究结果被潜在混杂因素影响的可能性较小，见表3；留一法检验：采用留一法进一步验证结果的可靠性（图4）。在MR分析中依次排除单个SNP，重复分析、考察剩余SNPs 对整体因果估计的影响，结果显示整体因果关系未发生明显变化，说明结果具有稳定性；漏斗图：通过绘制漏斗图（图5）发现纳入分析的4个SNPs基本呈对称分布，表明所得的结果较为稳定可靠。表 3 敏感性分析
暴露 结局 异质性检验 水平基因多效性检验 MR-PRESSO 方法 Cochran’s Q P 截距 SE P Global Test P PUM2 IDH MR-Egger 0.0004 0.9998 − 0.0442 0.8677 0.9640 0.0054 1 IVW 0.0030 0.9999 
图 4 留一法敏感性分析
图 5 双样本MR分析漏斗图
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本研究通过双样本MR分析，首次在遗传学层面证实了RNA结合蛋白 PUM2与IHD之间的因果关系。结果显示，PUM2水平升高与IHD发病风险降低显著相关（IVW法：OR =
0.7923 ，95% CI：0.6627 ~0.9471 ，P =0.0260 ），提示 PUM2可能是IHD的保护性因素。这一发现为理解IHD的遗传调控机制提供了新视角，并为其预防和治疗靶点的开发提供了潜在方向。RNA结合蛋白在心血管疾病中的作用日益受到关注，已有研究表明此类蛋白通过转录后调控参与血管内皮功能、炎症反应及心肌重构等机制[5, 6]。PUM2作为PUF家族成员，通过与靶mRNA 3'非翻译区结合抑制翻译起始复合物形成，从而负调控细胞增殖[12, 13]。在IHD发生过程中，心肌缺血/坏死可诱发成纤维细胞过度增殖，导致心脏纤维化加重[15]。本研究结果与此相符，推测PUM2可能通过抑制成纤维细胞增殖及胶原合成（如COL1A1、COL3A1）缓解纤维化进程[14, 26]。此外，PUM2在心肌细胞存活中的调控作用亦值得注意，如在缺血模型中，其表达变化可影响细胞凋亡通路[27]，从而增强心肌耐受力，降低IHD风险。
从机制角度进一步分析，PUM2作为RNA结合蛋白，可能靶向调控下游基因，如p21等细胞周期抑制因子，通过抑制翻译过程阻碍PI3K/AKT或MAPK信号通路的激活，从而负调控细胞增殖[28]。类似地，在动脉粥样硬化相关研究中，RNA结合蛋白GIGYF2通过上调STAU1诱导mTORC1-S6K1信号影响内皮衰老[29]，而PUM2或通过类似机制抑制炎症因子（如TNF-α、IL-6）表达，减轻斑块形成[30]。此外，PUM2可能维持心肌能量代谢稳态，通过调控糖酵解或脂肪酸氧化相关mRNA（如参与代谢途径的基因）缓解缺血损伤[31]。这些机制与本研究发现一致，提示PUM2在IHD保护中的多靶点作用。在IHD方面，PUM2有可能通过类似机制，抑制这些基因或因子的表达，从而阻碍斑块的形成与发展；另外，PUM2或许能够通过调节心肌细胞内与能量代谢相关基因的mRNA，如参与糖酵解、脂肪酸氧化等过程基因的mRNA，维持心肌细胞能量代谢稳态，减轻缺血导致的心肌细胞凋亡，不过这一机制仍有待后续功能实验进一步验证。
本研究的优势在于：首先，采用MR方法，利用遗传变异作为IVs，有效降低了传统观察性研究中混杂因素和反向因果关系的干扰，增强了因果推断的科学性。其次，通过严格筛选IVs并结合Cochran's Q检验、MR-Egger回归和留一法等多种敏感性分析，全面验证了结果的稳定性，确保了研究的可靠性和可重复性。最后，本研究首次系统探讨了PUM2与IHD之间的遗传因果关联，为RNA结合蛋白在心血管疾病中的潜在作用提供了新见解。
然而，本研究也存在一些局限性：首先，研究数据主要基于欧洲人群，存在种族特异性，其结果在其他族群中的普适性需通过跨人群验证。其次，MR方法仅能揭示遗传层面的因果关系，未能深入解析PUM2在IHD发生发展中的具体分子机制，建议结合体外实验和动物模型进一步探索。第三，由于GWAS数据限制，本研究未细化分析PUM2不同表达水平对IHD亚型（如MI或不稳定型心绞痛）的差异影响。第四，未纳入环境因素或表观遗传修饰等潜在变量，可能低估了基因-环境交互作用对研究结果的影响。
综上所述，本研究通过双样本MR分析确认，PUM2水平升高与IHD发病风险降低呈显著负相关，提示其可能作为IHD的潜在保护因子。未来研究可聚焦于：一是利用分子生物学手段明确PUM2调控IHD的靶基因和信号通路；二是开展多民族队列研究以验证结果的一致性；三是探索基于PUM2的干预策略，为IHD的精准诊疗提供创新思路。
Relationship between RNA-Binding Protein PUM2 and Ischemic heart disease: a bidirectional Mendelian randomization study
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摘要:
目的 采用双样本孟德尔随机化（MR）法探究RNA结合蛋白PUM2与缺血性心脏病（IHD）的因果关系，为IHD病因研究及防治提供新靶点。 方法 从eQTLGen Consortium获取PUM2顺式eQTL数据，以FinnGen数据库IHD全基因组关联分析数据为结局，筛选PUM2相关SNP作为工具变量。采用逆方差加权法（IVW）为主，结合加权中位数法进行MR分析，通过Cochran’s Q检验、MR-Egger回归、留一法及MR-PRESSO评估异质性、水平多效性及稳健性。 结果 IVW分析显示PUM2水平升高与IHD风险降低显著相关（OR= 0.7923 ，95% CI：0.6627 ~0.9471 ，P=0.0260 ），加权中位数法结果方向一致（OR=0.7913 ，95% CI：0.6439 ~0.9724 ，P=0.0106 ）。敏感性分析未发现异质性及水平多效性，留一法显示结果稳健。反向MR未发现反向因果。结论 遗传预测的PUM2水平升高可能降低IHD风险，PUM2或为IHD潜在保护因子及防治靶点。 Abstract:Objective To investigate the causal relationship between RNA-binding protein PUM2 and ischemic heart disease （IHD） using two-sample Mendelian randomization （MR）, provide new targets for IHD etiology and prevention. Methods Cis-eQTL data for PUM2 were obtained from the eQTLGen Consortium, with IHD genome-wide association study data from the FinnGen database as the outcome. PUM2-associated SNPs were selected as instrumental variables. Inverse variance weighted （IVW） method was primarily used, supplemented by weighted median method for MR analysis. Heterogeneity, pleiotropy, and robustness were assessed by Cochran’s Q test, MR-Egger regression, leave-one-out analysis, and MR-PRESSO. Results IVW analysis showed that higher PUM2 levels were significantly associated with reduced IHD risk （OR= 0.7923 , 95% CI:0.6627 –0.9471 , P=0.0260 ）, with consistent results from the weighted median method （OR=0.7913 , 95% CI:0.6439 –0.9724 , P=0.0106 ）. Sensitivity analyses revealed no heterogeneity or pleiotropy, and leave-one-out analysis confirmed robust results. Reverse MR found no evidence of reverse causation.Conclusion Genetically predicted higher PUM2 levels may reduce IHD risk, suggesting PUM2 as a potential protective factor and therapeutic target for IHD. -
Key words:
- RNA-binding protein /
- PUM2 /
- Ischaemic heart disease /
- Mendelian randomization /
- Causal relationship
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表 1 与PUM2及IDH相关的SNPs信息
SNP EA/OA EAF PUM2相关 IDH相关 β SE P F β SE P rs62109732 C/T 0.0376 − 0.1438 0.0320 <0.001 19.2515 − 0.0343 0.0261 0.1887 rs59231157 G/A 0.0367 − 0.1490 0.0323 <0.001 20.1845 − 0.0335 0.0265 0.2066 rs10206812 G/A 0.0376 − 0.1438 0.0320 <0.001 19.2516 − 0.0337 0.0266 0.2049 rs10183906 C/T 0.0376 − 0.1438 0.0320 <0.001 19.2515 − 0.0337 0.0266 0.2047 EA：效应等位基因；OA：其他等位基因；EAF：效应等位基因频率；β：回归系数；SE：标准误 
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表 2 PUM2与IDH的MR分析结果
暴露因素 结局 方法 Nsnp OR 95% CI P PUM2 IDH IVW 4 0.7923 0.6627 ~0.9471 0.0260 PUM2 IDH WME 4 0.7913 0.6439 ~0.9724 0.0106 IVW：inverse-variance weighted；WME：weighted median estimator
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表 3 敏感性分析
暴露 结局 异质性检验 水平基因多效性检验 MR-PRESSO 方法 Cochran’s Q P 截距 SE P Global Test P PUM2 IDH MR-Egger 0.0004 0.9998 − 0.0442 0.8677 0.9640 0.0054 1 IVW 0.0030 0.9999
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