花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

杨贺英; 罗彩萍; 彭婷; 梁文仪; 沈颂章; 苏娟

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

杨贺英^1,,
罗彩萍²,
彭婷²,
梁文仪²,
沈颂章²,
苏娟^{1, 2, ,}

1.
上海大学医学院, 上海 200444
2.
海军军医大学军事药学国家级实验教学示范中心, 上海 200433

基金项目: 国家自然科学基金（82304813）；大学生创新能力培养项目（FH2023095）

详细信息

作者简介:
杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏　娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim

1.
School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China
2.
National Demonstration Center for Experimental Military Pharmacy Education, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

摘要: 目的优化大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺条件，并进行成分分析。方法单因素实验与正交试验相结合，以羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）含量为指标，确定最佳工艺参数。利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS^E）技术定性分析生物碱类化学成分。结果最佳条件为选用三菱HP-20型大孔树脂，上样液浓度为0.2 g生药/ml，生药量与树脂体积比为1 g∶2.5 ml，树脂柱径高比为1∶7，以每小时4倍柱体积（BV）的速率动态吸附，静置1 h；20%乙醇2 BV除杂；80%乙醇5 BV洗脱。HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%，共鉴定出20种生物碱。结论该方法稳定可行，得到高纯度多种类的花椒生物碱，可用于花椒生物碱的富集纯化。
- 花椒 /
- 生物碱 /
- 大孔树脂 /
- 正交设计 /
- 超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱
Abstract: Objective To optimize the process conditions and analyze the components of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim（Z. bungeanum）using macroporous resin. Methods Combining single factor tests and orthogonal tests, the content of hydroxy-α-sanshool（HAS）and hydroxy-β-sanshool（HBS）were considered as indexes to determine the best process parameters. Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole tandem time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS^E）was used to identify the structures of alkaloids. Results The optimal conditions were Mitsubishi HP-20 macroporous resin, the loading solution concentration was 0.2 g crude drug/ml, the ratio of crude drug to resin volume was 1 g∶2.5 ml, the diameter/height ratio of resin column was 1∶7, the dynamic adsorption flow rate was 4 times of bed volume（BV）per hour, and the adsorption time was 1 h. Impurities were removed by using 2 BV of 20% ethanol, 5 BV of 80% ethanol was used to elution, and the content of HAS and HBS was 4.71% and 1.02%, respectively. A total of 20 alkaloids were identified from Z. bungeanum. Conclusion This method was stable and feasible, obtaining high purity and various kinds of alkaloids, which could be used for the enrichment and purification of alkaloids from Z. bungeanum.
- Zanthoxylum bungeanum Maxim /
- alkaloids /
- macroporous resin /
- orthogonal design /
- UPLC-Q-TOF-MS^E

随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药^[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端^[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得^[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等^[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖^[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上^[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用^[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍^[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。

1. 材料与仪器

1.1 实验材料

黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。

1.2 实验试剂

D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：20230420）、丙酮（批号：20230807）、石油醚（批号：20220507）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。

1.3 实验仪器

鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。

1.4 实验动物

SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。

2. 方法

2.1 黑蒜多糖的提取

取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。

2.2 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法^[14]测定多糖含量。

2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制

精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。

2.2.2 样品测定

精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。

计算公式：黑蒜多糖得率（%）=$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $

黑蒜多糖纯度（%）=$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $

式中：$ W $1为黑蒜质量（g）；$ W $2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $为提取溶剂体积（ml）；$ D $为样品稀释倍数。

2.3 动物实验给药剂量及配置

乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d^[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。

CO.D混悬液：参考贾红慧等^[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。

黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等^[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。

墨汁^[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。

含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。

2.4 实验动物分组及给药方法

2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验

小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。

按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。

计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%

2.4.2 小鼠排便实验

分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。

计算公式：粪便含水量（%）=$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $

式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。

2.5 统计学方法

采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（$ \bar{X} $±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。

3. 结果与分析

3.1 黑蒜多糖的得率和纯度

精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=2.2829 X+0.0764，相关系数r=0.9982，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。

3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响

从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。

表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响

组别	小鼠小肠墨汁推进实验		排便实验
组别	初始体重（m/g）	最终体重（m/g）	初始体重（m/g）	最终体重 (m/g)
空白组	21.28±1.15	22.23±1.19	21.80±1.02	22.90±0.61
模型组	21.20±1.36	22.24±1.22	21.58±1.00	22.64±0.84
阳性组	21.17±1.18	22.31±1.28	21.42±1.01	22.81±0.91
黑蒜多糖低剂量组	21.44±1.32	22.38±1.54	21.98±1.20	23.02±1.20
黑蒜多糖中剂量组	21.06±1.13	22.16±0.77	21.59±1.10	22.38±1.08
黑蒜多糖高剂量组	21.42±1.15	22.54±1.26	21.79±1.29	22.85±0.98

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3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响

从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。

表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响

组别	碳末推进距离（l/cm）	小肠总长度（l/cm）	墨汁推进率（%）
空白组	28.86±3.25	34.87±1.60	82.90±9.97
模型组	9.60±0.73^***	34.09±2.31	29.50±1.35^***
阳性组	26.94±3.55^###	34.15±1.60	79.00±9.92^###
黑蒜多糖低剂量组	12.58±1.15^###	34.35±1.67	36.80±4.42^#
黑蒜多糖中剂量组	16.01±2.06^###	34.48±3.18	46.30±4.19^###
黑蒜多糖高剂量组	19.95±1.60^###	34.66±1.96	57.60±4.06^###
注：^P<0.05，^P<0.01，^**P<0.001，与空白组比较；^#P<0.05，^##P<0.01， ^###P<0.001，与模型组比较。

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3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响

从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。

表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响

组别	首黑便时间（t/min）	6 h排便数（粒）	6 h排便湿重（m/g）	6 h排便干重（m/g）	含水量（%）
空白组	111.50±8.98	16.50±3.51	0.46±0.10	0.22±0.04	52.16±2.53
模型组	241.50±19.54^***	11.13±2.75^**	0.19±0.02^***	0.13±0.01^***	32.58±2.35^***
阳性组	121.50±110.81^###	15.13±4.09^#	0.41±0.12^###	0.20±0.06^##	50.06±1.83^###
黑蒜多糖低剂量组	138.75±10.79^###	13.75±2.71	0.32±0.08^##	0.19±0.42^#	42.34±2.27^###
黑蒜多糖中剂量组	132.88±8.34^###	14.63±3.66^#	0.34±0.10^##	0.19±0.05^##	43.26±2.68^###
黑蒜多糖高剂量组	130.88±9.09^###	14.75±3.73^#	0.34±0.12^##	0.19±0.05^##	44.25±6.72^###
注：^P<0.05，^P<0.01，^**P<0.001，与空白组比较；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001，与模型组比较。

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4. 讨论

CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药^[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10^[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况^[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。

FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关^[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖^[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便^[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因^[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。

图 1 供试品溶液的HPLC图

1.羟基-α-山椒素；2.羟基-β-山椒素

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图 2 三菱HP-20型大孔树脂动态吸附泄漏曲线

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图 3 不同上样条件对HAS、HBS总得率的影响

A.上样液浓度；B树脂柱径高比；C吸附流速^*P<0.05,^**P<0.01，与白色组比较。

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图 4 正离子模式下花椒生物碱BPI图

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表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表

条件	水平	因素
条件	水平	A因素溶剂	B因素体积（BV）	C因素流速（BV/h）
除杂	1	蒸馏水	1	2
	2	10%乙醇	2	3
	3	20%乙醇	3	5
洗脱	1	55%乙醇	3	2
	2	70%乙醇	5	3
	3	80%乙醇	8	5

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表 2 不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响（n=3）

树脂类型	HAS、HBS 总浓度（mg/ml）	HAS、HBS 总含量（%）	$ \bar{X} $±SD（%）
APS-17	2.42	4.06	4.06±2.17
NKA-9	2.08	3.50	3.50±1.76
宝恩HP-20	3.68	6.19	6.19±1.09
AB-8	3.58	6.02	6.02±1.28
HPD-400	3.59	6.03	6.03±0.98
三菱HP-20	4.10	6.89	6.89±0.62

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表 3 除杂条件L₉（3³）正交设计及结果

编号	因素			总得率（%）
编号	除杂溶剂（A）	除杂体积（B）	除杂流速（C）	总得率（%）
1	1	1	1	7.87
2	1	2	2	9.09
3	1	3	3	9.31
4	2	1	2	10.33
5	2	2	3	10.42
6	2	3	1	10.67
7	3	1	3	11.82
8	3	2	1	10.73
9	3	3	2	11.66
k1	8.75	10.06	9.71	−
k2	10.44	10.07	10.34	−
k3	11.37	10.48	10.52	−
R	2.62	0.64	0.81	−

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表 4 洗脱条件L₉（3³）正交设计及结果

编号	因素			总得率（%）
编号	洗脱溶剂（A）	洗脱体积（B）	洗脱流速（C）	总得率（%）
1	1	1	1	2.55
2	1	2	2	5.38
3	1	3	3	7.15
4	2	1	2	5.75
5	2	2	3	8.11
6	2	3	1	9.57
7	3	1	3	9.20
8	3	2	1	8.28
9	3	3	2	6.36
k1	5.03	5.83	6.80	−
k2	7.81	7.26	5.83	−
k3	7.95	7.69	8.15	−
R	2.92	1.86	2.32	−

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表 5 最佳工艺验证结果

编号	得膏率（%）	富集前总含量（%）	富集后总含量（%）	富集后总含量RSD（%）
1	6.88	0.82	5.73	0.87
2	6.91	0.81	5.72	0.87
3	6.95	0.82	5.64	0.87

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表 6 正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果

峰号	保留时间（t/min）	化合物	分子式	离子模式	理论值（m/z）	实测值（m/z）	误差（ppm）	碎片离子（m/z）	参考文献
1	4.716	木兰花碱	C₂₀H₂₄NO₄⁺	[M]⁺	342.170 5	342.169 0	−4.38	342.169 0[M]⁺, 297.110 6[M-C₂H₇N]⁺, 282.088 2[M-C₂H₇N-CH₃]⁺, 265.085 2[C₁₇H₁₃O₃]⁺, 222.065 3[C₁₅H₁₀O₂]⁺, 191.084 6[C₁₅H₁₁]⁺, 194.071 4[C₁₄H₁₀O]⁺, 165.069 3[C₁₃H₉]⁺	[17]
2	5.483	ZP-amide D	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18]
3	5.877	ZP-amide E	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	320.182 5[M+Na]⁺	[18]
4	6.043	ZP-amide A	C₁₆H₂₅NO₄	[M+Na]⁺	318.168 1	318.168 5	1.26	613.338 5[2M+Na]⁺, 319.169 2[M+H+Na]⁺, 318.168 5[M+Na]⁺, 296.183 8[M+H]⁺, 278.175 6[M-OH]⁺	[18-19]
5	6.724	ZP-amide B	C₁₆H₂₅NO₄	[M+Na]⁺	318.168 1	318.168 5	1.26	613.338 5[2M+Na]⁺, 319.169 2[M+H+Na]⁺, 318.168 5[M+Na^]+, 296.183 8[M+H]⁺, 278.175 6[M-OH]⁺	[18-19]
6	6.793	ZP-amide C	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18, 20]
7	7.222	ZP-amide L	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18]
8	7.902	ZP-amide K	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18]
9	12.427	ZP-amide N	C₁₈H₃₁NO₄	[M+Na]⁺	348.215 1	348.213 0	−6.03	349.217 7[M+H+Na]⁺, 348.213 0[M+Na]⁺	[18]
10	16.168	茵芋碱	C₁₄H₁₃NO₄	[M+H]⁺	260.092 3	260.092 3	0.00	229.037 0[M-2CH₃]⁺, 227.056 6[C₁₃H₉NO₃]+, 202.046 8[C₁₁H₈NO₃]⁺, 199.062 5[C₁₂H₉NO₂], 184.037 9[C₁₁H₆NO₂]⁺, 156.043 4[C₁₀H₆NO]⁺, 77.037 7[C₆H₅]⁺	[21]
11	22.312	羟基-ε-山椒素	C₁₆H₂₅NO₂	[M+Na]⁺	286.178 3	286.178 3	0.00	302.171 4[M+K]⁺, 286.178 3[M+Na]⁺, 246.184 4[M-OH]⁺	[22]
12^*	22.701	羟基-α− 山椒素	C₁₆H₂₅NO₂	[M+Na]⁺	286.178 3	286.178 3	0.00	287.179 5[M+H+Na]⁺, 286.178 3[M+Na]⁺, 246.184 4[M-OH]⁺	[23]
13^*	23.113	羟基-β− 山椒素	C₁₆H₂₅NO₂	[M+Na]⁺	286.178 3	286.178 3	0.00	287.179 5[M+H+Na]⁺, 286.178 3[M+Na]⁺, 246.187 5[M-OH]⁺	[23]
14	23.605	Zanthoamides A	C₁₈H₂₇NO₄	[M-OH]⁺	304.191 3	304.191 3	0.00	345.184 4[M+H+Na]⁺, 344.181 6[M+Na]⁺	[24]
15	26.156	羟基-γ−山椒素	C₁₈H₂₇NO₂	[M+Na]⁺	312.193 9	312.193 5	−1.28	601.398 7[2M+Na]⁺, 313.164 8[M+H+Na]⁺, 312.193 5[M+Na]⁺, 272.200 9[M-OH]⁺	[22]
16	26.379	羟基-γ− 异山椒素	C₁₈H₂₇NO₂	[M+Na]⁺	312.193 9	312.193 5	−1.28	601.398 7[2M+Na]⁺, 313.164 8[M+H+Na]⁺, 312.193 5[M+Na]⁺, 272.200 9[M-OH]⁺	[22]
17	26.786	bungeanool	C₁₈H₂₉NO₂	[M-OH]⁺	274.217 1	274.216 5	−2.19	565.363 6[2M-OH]⁺, 314.210 3[M+Na]⁺	[15]
18	26.957	isobungeanool	C₁₈H₂₉NO₂	[M-OH]⁺	274.217 1	274.216 5	−2.19	565.363 6[2M-OH]⁺, 314.210 3[M+Na]⁺	[15]
19	27.586	α−山椒素	C₁₆H₂₅NO	[M+H]⁺	248.201 4	248.201 2	−0.81	286.178 3[M+K]⁺	[23]
20	29.068	四氢花椒素	C₁₈H₃₃NO₂	[M+H]⁺	296.259 0	296.257 7	−4.39	318.237 8[M+Na]⁺, 279.137 4[M+H-OH]⁺	[25]
^*：为与对照品比对的化合物。

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图(4) / 表(6)

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花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，味辛，性温，具有温中止痛、杀虫止痒的功效，主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛^[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分，组成丰富、结构多样，具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性^[2-8]。其中，不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）已经被证实能够调节脂质代谢，对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果^[9]。然而，对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础，有利于花椒药用价值的深度开发，因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。

大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段，具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点，在中药材、中药制剂方面应用广泛^[10-11]。因此，本实验以HAS、HBS的得率为指标，筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型，采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件，建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS^E）技术鉴定成分，以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。

1. 材料

1.1. 样品

花椒药材（批号：20220705-2，购于陕西省渭南韩城市），经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）的干燥果皮。

1.2. 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱（美国沃特世科技有限公司）；R-100型旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；XS205DU电子分析天平（梅特勒托利多科技公司）。

HAS对照品（纯度≥98%，批号：P2834270，源叶）；HBS对照品（纯度≥98%，批号：P2832664，诗丹德）；95%乙醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技公司）；APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；HPD-400型大孔吸附树脂（上海一飞生物科技有限公司）；HP-20型大孔吸附树脂（日本三菱化学株式会社）。

2. 方法

2.1. 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立

2.1.1. 溶液的配制

称取50 g花椒于圆底烧瓶中，加入500 ml的50%乙醇，95℃水浴加热，回流提取1 h，共提取3次。过滤后合并滤液，45℃减压浓缩至无醇味，过滤，加水分散至250 ml，即得上样液。

取216 ml上样液，上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱，动态吸附30 min，静置1 h后，取216 ml 20%乙醇除杂24 min；540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得提取物粉末。

对照品溶液：精密称定HAS、HBS对照品适量，加50%乙醇定容，分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液：精密称定适量提取物粉末，加50%乙醇定容后，0.45 μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。

2.1.2. 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C₁₈柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；流速：0.3 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：5 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%三乙胺（B）；洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~30 min，35%→50%A；30~36 min，50%→90%A，36~39 min，90%A，39~40 min，90%→10%A。

2.1.3. 线性关系

取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.2”项下色谱条件下进样。

2.1.4. 精密度

取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤，连续进样6次。

2.1.5. 稳定性

取“2.1.1”项下的供试品溶液，于0、1、2、4、8、24 h分别进样。

2.1.6. 重复性

按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份，在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。

2.1.7. 加样回收率

精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份，分别准确加入HAS、HBS对照品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，进样分析并计算加样回收率。

2.2. 大孔树脂纯化富集工艺优化

2.2.1. 树脂类型

95%乙醇浸泡树脂24 h，充分溶胀后湿法装柱，95%乙醇淋至洗脱液澄清透明，水洗至洗脱液无醇味，备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样，计算HAS、HBS的总得率。

2.2.2. 上样量

湿法装柱，取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml，以2 BV/h上样，流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样，以累计上样体积（V/ml）为横坐标（X），以HAS、HBS的总泄漏率（%）为纵坐标（Y），绘制泄漏曲线。

2.2.3. 单因素实验考察上样条件

除变量外固定其他工艺条件（树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇，2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h）不变的情况下，分别考察上样液浓度（0.1、0.2、0.4 g生药/ml）、树脂柱径高比（1∶5、1∶7、1∶9）及吸附流速（1、2、4 BV/h）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。

2.2.4. 正交试验考察除杂、洗脱条件

在单因素实验的基础上，采用L9（3³）正交试验进一步分析除杂条件（除杂溶剂、体积、流速）、洗脱条件（洗脱溶剂、体积、流速）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响（表1），总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。

表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表

条件	水平	因素
条件	水平	A因素溶剂	B因素体积（BV）	C因素流速（BV/h）
除杂	1	蒸馏水	1	2
	2	10%乙醇	2	3
	3	20%乙醇	3	5
洗脱	1	55%乙醇	3	2
	2	70%乙醇	5	3
	3	80%乙醇	8	5

2.3. 花椒生物碱的化学成分分析

2.3.1. 样品制备

精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg，50%甲醇定容至25 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

2.3.2. 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY HSS T₃柱（2.1×100 mm, 1.7 μm）；检测波长：270 nm；流速：0.3 ml/min；柱温：30℃；进样量：3 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~24 min，35%→46%A；24~30 min，46%→90%A；30~32 min，90%A；32~33 min，90%~10%A；33~36 min，10%A。

2.3.3. 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式扫描。离子源温度120℃，雾化气流速为800 L/h，毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V，补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV，高能量扫描电压30~60 eV；喷雾器压力为6.5×10⁵ Pa，气帘气体积流量为50 L/h，扫描范围m/z为50~1500。亮氨酸-脑啡肽（m/z∶ 554.261 5 [M-H]⁻）和（m/z∶ 556.277 1[M+H]⁺）作为外标进行质量实时校正，体积流量设为5 μl/min。

MassLynx V4.1工作站使用MS^E模式采集质谱数据。

4. 讨论

实验前期，考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法，经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时，耗时长、水溶性杂质较多，而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应，破坏分子结构，综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。

HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱，具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性，受到研究者的广泛关注^[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱，显著提高HAS、HBS含量，为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分，但UPLC-Q-TOF-MS^E得到的BPI图中，8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离，后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。

本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺，利用UPLC-Q-TOF-MS^E对生物碱成分进行分析鉴定，使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效，可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据，对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。

参考文献 (25)

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花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

作者简介: 杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏 娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim

1. 材料与仪器

1.1 实验材料

1.2 实验试剂

1.3 实验仪器

1.4 实验动物

2. 方法

2.1 黑蒜多糖的提取

2.2 多糖含量的测定

2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制

2.2.2 样品测定

2.3 动物实验给药剂量及配置

2.4 实验动物分组及给药方法

2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验

2.4.2 小鼠排便实验

2.5 统计学方法

3. 结果与分析

3.1 黑蒜多糖的得率和纯度

3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响

3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响

3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响

4. 讨论

计量

出版历程

花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

1. 上海大学医学院, 上海 200444 2. 海军军医大学军事药学国家级实验教学示范中心, 上海 200433

作者简介: 杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏 娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

English Abstract

Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim

1. School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China 2. National Demonstration Center for Experimental Military Pharmacy Education, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

全文HTML

1.1. 样品

1.2. 仪器与试剂

2.1. 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立

2.1.1. 溶液的配制

2.1.2. 色谱条件

2.1.3. 线性关系

2.1.4. 精密度

2.1.5. 稳定性

2.1.6. 重复性

2.1.7. 加样回收率

2.2. 大孔树脂纯化富集工艺优化

2.2.1. 树脂类型

2.2.2. 上样量

2.2.3. 单因素实验考察上样条件

2.2.4. 正交试验考察除杂、洗脱条件

2.3. 花椒生物碱的化学成分分析

2.3.1. 样品制备

2.3.2. 色谱条件

2.3.3. 质谱条件

3.1. HPLC图与方法学实验结果

3.1.1. 花椒生物碱的HPLC图

3.1.2. 线性关系考察结果

3.1.3. 精密度实验结果

3.1.4. 稳定性实验结果

3.1.5. 重复性实验结果

3.1.6. 加样回收率实验结果

3.2. 大孔树脂纯化富集工艺

3.2.1. 树脂类型的确定

3.2.2. 上样量的确定

3.2.3. 上样条件的确定

3.2.4. 除杂、洗脱条件的确定

3.2.5. 花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证

3.3. 生物碱类化合物的鉴定

目录

全文HTML

1.1. 样品

1.2. 仪器与试剂

2.1. 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立

2.1.1. 溶液的配制

2.1.2. 色谱条件

2.1.3. 线性关系

2.1.4. 精密度

作者简介:
杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏　娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

1. 上海大学医学院, 上海 200444

2. 海军军医大学军事药学国家级实验教学示范中心, 上海 200433

作者简介:
杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏　娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

1. School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China

2. National Demonstration Center for Experimental Military Pharmacy Education, Naval Medical University, Shanghai 200433, China