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2型糖尿病（T2DM）是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，主要是由于胰岛素分泌不足而导致的空腹血糖升高[1]。冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD，简称冠心病）是一种常见的心血管疾病，主要是由于冠状动脉的粥样性硬化引起的血管阻塞或管腔狭窄，从而导致心肌缺血或缺氧性坏死，进而影响心脏功能[2]。近年来，T2DM的患病人数不断增加。据相关不完全统计，预计到2045年，全球T2DM患病人数将增加至7.83亿，已成为全球关注的重要人类问题之一[3]。目前，我国60岁以上的老年人中T2DM患病率超过20%，其中心血管疾病是最常见的并发症，而CHD则是T2DM患者最常见的致残或致死原因[4, 5]。有研究表明，T2DM患者发生心血管疾病的概率是非T2DM人群的2~4倍，葡萄糖耐受量受损是影响CHD进展的重要因素[6]。由此可见，T2DM与CHD相互影响，相互促进。
中药复方制剂麝香保心丸源于宋代《太平惠民和剂局方》中治疗“寒闭证”的经典名方苏合香丸，由戴瑞鸿教授在1972年改良而来。麝香保心丸已在临床应用40余年，方中麝香通窍温阳、活血化瘀为君药；苏合香辟秽通窍、人参扶正益气为臣药；牛黄开窍醒神、肉桂助阳通脉、蟾酥开窍止痛为佐药；冰片开窍醒神为使药。全方寒温并用、通补兼施、益气强心，主要用于治疗气滞血瘀所致的胸痹，症见心前区疼痛固定不移，心肌缺血所致的心绞痛、心肌梗死等[7-9]。目前临床上将麝香保心丸与基础西药中的降糖药联合应用，表现出比单用降糖药更好的血糖调节效果[10]，还可以降低患者血清胆固醇水平[11]，显著降低心血管事件发生率[12]。但目前关于麝香保心丸“异病同治”T2DM和CHD共同作用机制的研究相对不足。本研究旨在通过运用网络药理学方法，探索麝香保心丸“异病同治”T2DM和CHD的共同作用机制，为今后的研究和应用提供理论依据。
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运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中药成分数据库（TCMID）、中医药百科全书数据库（ETCM）和BATMAN-TCM数据库，以“人工麝香、人参提取物、人工牛黄、苏合香、蟾酥、肉桂、冰片”为关键词，检索麝香保心丸的化学成分。将口服生物利用度（OB）≥20%、类药性（DL）≥0.1，同时文献报道具有确切活性的化合物，以及本课题组前期研究鉴定的入血成分，均视为麝香保心丸的活性化合物。取BATMAN-TCM中score≥48、TCMID中score≥400、ETCM中score≥0.8的靶点，同时将仅有1个成分对应的靶点去除，筛选得到麝香保心丸的潜在作用靶点，然后通过Uniprot数据库规范靶点蛋白的基因名。
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在DisGeNET数据库和GeneCards数据库中以“type 2 diabetes mellitus”和“coronary heart disease”为关键词筛选出T2DM和CHD的相关靶点，为获得与疾病相关度更高的靶点，将GeneCards数据库中score≤10的靶点去除。
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绘制麝香保心丸组方中筛选出的化合物靶点、T2DM相关靶点和CHD相关靶点的Venn图，取三者交集，得到麝香保心丸同时治疗T2DM和CHD的潜在作用靶点。
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运用Cytoscape 3.8.2软件构建麝香保心丸发挥“异病同治”作用的“药物-成分-靶点”网络图，运用“Network Analyzer”功能进行分析，其中节点代表药物、成分、靶点，边代表药物与成分、成分与靶点之间的关系。
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运用STRING数据库，导入“药物-疾病”交集靶点，物种限制为“人”，构建PPI网络图，然后将STRING数据库得到的数据导入Cytoscape 3.8.2软件进行网络分析，依据度值筛选出核心靶点。
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运用DAVID在线数据库导入交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，研究麝香保心丸治疗T2DM和CHD可能靶点的潜在关键生物学过程和相关通路。
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通过TCMSP、TCMID、ETCM和BATMAN-TCM数据库共检索得到2 535个化学成分，以OB≥20%、DL≥0.1，文献报道具有确切活性的化合物，以及本课题组前期研究鉴定的入血成分，并以BATMAN-TCM中取score≥48；TCMID中取score≥400；ETCM中取score≥0.8，同时将仅有1个成分对应的潜在靶点去除为标准，共筛选出七味中药的108个活性成分，对应451个靶点。
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在DisGeNET和GeneCards数据库中共检索筛选得到T2DM相关靶点5 777个，CHD相关靶点3 433个。利用Venn图将麝香保心丸预测筛选出的活性成分潜在靶点与疾病靶点作交集，得到麝香保心丸作用于T2DM和CHD的潜在共同靶点229个（图1）。
图 1 麝香保心丸治疗T2DM和CHD的靶点Venn图
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运用Cytoscape 3.8.2软件构建“药物-成分-靶点”网络图，网络中共有337个节点，其中药物7个、活性成分101个、靶点229个。其中绿色代表麝香保心丸组方中的7味中药，蓝色代表活性成分，红色代表作用于疾病的靶点。根据度值大小筛选贡献较大的活性成分，其中鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、肉桂醛、胆汁酸、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rb1、肉桂酸等活性成分排名靠前，可能是麝香保心丸发挥治疗T2DM和CHD作用的主要贡献成分（图2）。
图 2 药物-成分-靶点网络图
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将麝香保心丸229个交集靶点导入STRING数据库中，并利用Cytoscape 3.8.2软件对PPI图进行可视化分析（图3）。根据度值由大到小对节点进行筛选，选取排名前10的潜在核心靶点，分别是胰岛素（INS）、白蛋白（ALB）、蛋白激酶B（Akt1）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、环腺苷酸反应元件结合蛋白1（CREB1）、白细胞介素-1（IL-1β）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG），这些靶点可能是麝香保心丸治疗T2DM和CHD的关键核心靶点。
图 3 PPI网络图
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将麝香保心丸229个交集靶点导入DAVID在线数据库进行GO功能富集分析，以P≤0.05为筛选标准，共筛选出生物过程（BP）724条、细胞成分（CC）112条、分子功能（MF）208条，分别选取前10条绘制气泡图（图4）。BP主要涉及对外源性刺激的反应、炎症反应、基因表达的正调控等过程；CC主要涉及质膜、电压门控钙通道复合物、神经元细胞体等过程；MF主要涉及RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活序列特异性DNA结合、类固醇结合、氧化还原酶活性等过程。
图 4 GO功能富集分析
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通过KEGG通路富集分析229个交集靶点，以P≤0.05为筛选标准，共得到麝香保心丸治疗T2DM和CHD的188条信号通路，选取排名前20的绘制气泡图（图5）。cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路、钙信号传导通路等可能在麝香保心丸治疗T2DM和CHD中发挥重要作用。
图 5 KEGG通路富集分析
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中医将以多饮、多食、多尿、身体消瘦为主要特征的T2DM归结为“消渴症”范畴，以气阴两虚和阴虚内热为主要病机[13]。CHD以气虚血瘀为主要病机，虚证多以阳虚、气虚、气阴两虚为主，实证多以气滞血瘀、痰凝寒浊为主[14]。中药复方制剂麝香保心丸作为中医经典名方“苏合香丸”的发展延续，是我国目前最常用的芳香温通类药物，为益气活血剂，临床上广泛应用于治疗心血管疾病[15]。由于T2DM与CHD均有“气阴两虚”表型，故现临床上将麝香保心丸用于治疗T2DM比单用西药进行基础治疗表现出更好的控制血糖、促进心功能恢复、改善糖尿病患者微循环障碍、降低血液粘度等作用[15, 16]。虽然麝香保心丸在治疗T2DM和CHD方面具有良好的临床疗效，但其“异病同治”的作用机制尚不明确。本研究主要运用网络药理学方法，探讨麝香保心丸“异病同治”T2DM和CHD的潜在作用机制。
本研究运用网络药理学分析方法共筛选得到麝香保心丸的101个活性成分和“异病同治”T2DM和CHD的共同靶点229个。其中人参总皂苷提取物是麝香保心丸的臣药，文献报道其具有抑制IL-1β等炎性因子的表达[17]，调节线粒体能量代谢和糖脂代谢，改善胰岛素抵抗、抑制心肌细胞凋亡[18]的作用，人参皂苷Rg1、Rb1可通过抑制IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达，减轻肝脏损伤和胰岛素抵抗[19] ，缓解心肌损伤[20]。已有研究表明，肉桂提取物可以减少氧化应激，保护胰岛β细胞，增加胰岛素分泌[21]，改善血脂异常[22]，减轻糖尿病心肌并发症症状。肉桂中的有效成分肉桂醛[23]可通过自噬途径减轻缺氧复氧导致的H9C2心肌细胞的损伤，抑制自噬水平，增强心肌细胞活力。肉桂酸[24]则能通过激活PI3K/Akt/FoxO1信号通路，降低db/db小鼠空腹血糖水平、调节血脂、改善胰岛素抵抗。牛黄中的有效成分熊去氧胆酸可增加肝脏能量消耗、改善线粒体功能和胆汁酸代谢，减少甘油三酯（TG）和FFA，改善糖脂代谢[25]。由此可见，麝香保心丸治疗T2DM和CHD可能是其多个活性成分共同发挥作用的结果。
绘制PPI网络图，根据度值分析得到排名前10的核心靶点，INS、ALB、Akt1、IL-6、TNF、CREB1、IL-1β、MAPK3、PPAGR、ACTB是麝香保心丸“异病同治”T2DM和CHD的潜在核心靶点。研究表明，促炎细胞因子和炎症相关核转录因子与胰岛素分泌受损有关，可能会诱导T2DM的发生[26]，例如，IL-6被认为可能与胰岛素抵抗和β细胞功能障碍有关[27]。此外，有研究表明，在血管生物学中，IL-6还可能与动脉粥样硬化形成相关的成纤维细胞和内皮细胞分泌有关[28]。因此，抑制IL-6炎症因子的激活能有效改善胰岛素抵抗，缓解动脉粥样硬化。有研究表明，PPARG（即PPARγ）是一种过氧化物酶体增殖受体，是配体激活受体，参与能量稳态调节，其在脂肪组织、脾脏和大肠中的表达最高，主要表现为调节脂肪生成、脂质和葡萄糖代谢以及炎症途径，因此，激活PPARG受体不仅可以改善胰岛素敏感性，还可以调节血管生成[29]。ACTB是一种β-肌动蛋白，是重要的细胞骨架蛋白，可以通过调节内皮NO合酶活性改变NO产生，从而导致内皮功能障碍，这被认为可能是导致CHD的潜在作用机制[30]。同时有研究表明，ACTB是与T2DM风险有关的一种可靠的基因蛋白[31]。由此可见，麝香保心丸通过作用于多个靶点发挥“异病同治”T2DM和CHD的治疗作用。
GO生物功能分析发现，麝香保心丸“异病同治”T2DM和CHD的潜在调控生物过程，主要涉及炎症反应、基因表达的正调控、对脂多糖的反应、酶结合、蛋白质结合、受体结合、电压门控钙通道复合物等生物过程。KEGG通路富集分析发现，麝香保心丸治疗T2DM和CHD的通路主要富集在脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、cGMP-PKG信号通路等信号通路。晚期糖基化终产物（AGEs）是游离还原性糖和蛋白质、脂质、核酸之间非酶促糖化反应的结果，主要发生于持续高血糖状态的患者体内，属于有害分子，AGEs会与其晚期糖基化终产物受体（RAGE）发生非特异性作用[32]，产生氧化应激，导致促炎细胞因子产生和炎症反应，从而干扰细胞内信号，导致胰岛素抵抗[33]。有研究表明，AGE水平升高与动脉壁硬度增加、冠状动脉疾病等心血管风险有关，与T2DM患者冠状动脉粥样硬化的严重程度和心血管事件的发生有关，这主要是因为AGE诱导的血管和心肌蛋白交联会降低血管弹性和心肌灵活性，导致血管壁柔韧性降低，血管和心肌僵硬以及影响细胞内皮功能，最终导致CHD[34]。Toll样受体（TLRs）属于炎症小体，主要有2个亚型：①在其外域中具有多个半胱氨酸簇的TLR（mccTLRs）；②在其外域中具有单个半胱氨酸簇的TLR（sccTLRs）[35]。动脉粥样硬化主要是由慢性炎症引起的血管壁结构和功能异常，TLR信号通路的激活参与动脉粥样硬化的炎症过程，其中TLR2和TLR4在动脉硬化过程中上调使CHD进一步加剧[36]。胰岛素抵抗是T2DM的主要症状之一，起因之一是肥胖，脂肪组织分泌各种激素和细胞因子，在代谢应激的作用下，TLR4信号传导的激活会引起免疫细胞释放促炎因子，使脂肪组织中的巨噬细胞聚集极化为M1和M2亚型，导致慢性低度炎症，干扰代谢组织中的胰岛素信号传导，进而发展成T2DM[37]。cAMP是一种单磷酸腺苷，由腺嘌呤、核糖以及磷酸基团组成，是细胞内的第二信使分子。cAMP信号通路主要包括cAMP合成环化酶、降解磷酸二酯酶（PDE）和cAMP效应，主要来源是细胞质膜上的跨膜腺苷酸环化酶（tmACs）和细胞内的可溶性腺苷酸环化酶（sAC），负责激素诱导的肝糖原分解[38]，可刺激胰岛素分泌，是胰岛素依赖性cAMP信号通路[39]。蛋白激酶A（PKA）是主要的cAMP效应靶标，cAMP水平升高和PKA激活可调节内皮屏障稳态，促进血管舒张[40]。上述分析结果表明，麝香保心丸发挥治疗T2DM和CHD的作用是方中的多种化学成分作用于多个信号通路的结果，主要涉及氧化应激和炎症反应。
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“异病同治”治疗思想是中医对《黄帝内经》“同病异治”传统理论的继承与发展，目前临床应用广泛，但相关作用机制尚不明确[41]。本文运用网络药理学方法研究发现，麝香保心丸“异病同治”T2DM和CHD的靶点和信号通路主要涉及炎症反应和氧化应激，与目前关于T2DM和CHD的相关作用机制研究相符，证实麝香保心丸通过多成分、多靶点、多通路发挥治疗T2DM和CHD的共同作用。研究结果为麝香保心丸的临床应用及进一步实验验证研究提供了理论依据。
Mechanisms of Shexiang Baoxin Pill in homo-therapy for heteropathy in type 2 diabetes mellitus and coronary heart disease based on network pharmacology
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摘要:
目的 基于网络药理学方法研究麝香保心丸“异病同治”2型糖尿病（T2DM）和冠心病（CHD）的作用机制。 方法 运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中药成分数据库（TCMID）、中医药百科全书数据库（ETCM）和BATMAN-TCM数据库筛选麝香保心丸中七味中药的化学成分和作用靶点，利用DisGeNET和GeneCards数据库获取与CHD和T2DM相关的疾病靶点。运用Cytoscape3.8.2软件构建“药物-成分-靶点”网络图，利用STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络图，利用DAVID在线数据库对麝香保心丸治疗T2DM和CHD的共同作用靶点进行GO生物过程分析和KEGG通路富集分析。 结果 共筛选出麝香保心丸治疗T2DM和CHD的潜在活性成分101个，对应229个靶点。网络分析结果表明，麝香保心丸治疗T2DM和CHD的共同主要成分可能是鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、肉桂醛、胆汁酸、肉桂酸及人参皂苷类成分。通路富集分析结果显示，麝香保心丸“异病同治”T2DM和CHD的作用机制可能与抑制炎症反应和氧化应激有关。 结论 麝香保心丸可通过多成分、多靶点、多途径发挥“异病同治”T2DM和CHD的作用，为麝香保心丸的临床应用及进一步研究提供理论基础。 Abstract:Objective To probe into the mechanism of Shexiang Baoxin Pill in homo-therapy for heteropathy for type 2 diabetes mellitus （T2DM） and coronary heart disease （CHD） based on network pharmacology. Methods All chemical components and action targets of these seven traditional Chinese medical in Shexiang Baoxin Pill were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）, Traditional Chinese Medicines Integrated Database （TCMID）, The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine （ETCM） and BATMAN-TCM platform, and the DisGeNET and GeneCards databases were used to obtain CHD and T2DM-related Disease targets. The “drug-component-target” network map was constructed by Cytoscape 3.8.2 software, the protein-protein interaction （PPI） network map was constructed by STRING database, and the GO biological process analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed on the common targets of Shexiang Baoxin Pill for T2DM and CHD using DAVID online database. Results A total of 101 potential active ingredients for the treatment of T2DM and CHD in Shexiang Baoxin Pill were screened out, corresponding to 229 targets. Network analysis results showed that the common main active ingredients in Shexiang Baoxin Pill for treating T2DM and CHD might be chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, cinnamic aldehyde, bile acids, cinnamic acid, and ginsenosides. The results of pathway enrichment analysis showed that the mechanism of action of Shexiang Baoxin Pill in the treatment of type 2 diabetes and coronary heart disease in treating T2DM and CHD might be related to the inhibition of inflammatory response and oxidative stress. Conclusion Shexiang Baoxin Pill could play a role in treating CHD and T2DM through multiple components, multiple targets and multiple pathways, which provided a certain theoretical basis for the clinical application and further research of Shexiang Baoxin Pill. -
中药红花（Carthami Flos）是菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，传统本草学著作《本草纲目》记载，红花具有活血散瘀，通经止痛的功效[1]，其药材和制剂在临床上被广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。现代药理研究表明，其主要药效物质是以羟基红花黄色素A（hydroxysafflower yellow A，HSYA）为代表的查尔酮类化合物和以菸花苷为代表的黄酮醇类化合物，这些化合物均具有良好的心脑血管损伤保护活性[2-3]。红花药材的产量偏低，每平方千米产量仅为18.0～22.5 t[4]，其中特有的HSYA[5]、红花红色素等查尔酮类成分在不同品种间差异较大[6]。由于红花中的查尔酮类成分仅特异性地存在于花冠中[7]，加之体外组织培养再生率低[8]等原因，对其功能基因的研究工作一直进展缓慢。特别是对于HSYA等红花特有的有效成分，其生物合成相关的功能基因尚不完全清楚，合成通路也未被完全解析[9]。因此，用现代分子生物学技术手段以提高药效物质的含量，是提高红花品质，节约土地资源、降低制药成本的一条新途径。
短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductases，SDR）在植物次生代谢物的生物合成中广泛参与各类碳-氧双键，碳-碳双键以及烯酮键的氧化还原催化反应。根据SDRs基因序列的特征结构，SDRs超家族可以被分为5个亚家族[10-14]。最早发现并且进行鉴定的两类主要短链还原酶命名为classical和extend，classical类的SDRs基因拥有长度约为250个氨基酸残基，被称为Extended类的SDRs基因在碳基末端因其含有多余的约100个氨基酸残基而得名。另外3种类型SDRs基因分别被命名为intermediate、complex和divergent。这些类型的SDRs基因基于其结合辅酶类型和结合催化位点的不同进行命名分类。此外，SDRs存在与传统类型不同的含有“rossmann-fold”保守结构域的氧化还原酶结构[15-18]。
黄酮类化合物起源于莽草酸途径和苯丙素生物合成途径，1个香豆酰辅酶A（coumaroyl CoA）和3个丙二酰辅酶A（malonyl CoA）在查尔酮合酶的作用下生成二氢查尔酮，然后经查尔酮异构酶催化为二氢黄酮，进一步在各类还原酶，聚合酶和糖基转移酶的作用下，生成终端次生代谢产物组合[19-21]。红花中所含的主要有效成分HSYA具有查尔酮式结构，本课题组前期研究认为：HSYA从前体物质到合成，中间存在必不可少的氧化还原过程。短链脱氢还原酶家族广泛参与植物体内次生代谢，这一类还原酶都带有相似的折叠结构以及催化位点，已有研究表明，其对苯丙烷代谢途径起重要作用[22-23]，但有关红花中还原酶基因相关报道较少[24]。故笔者通过对红花转录组数据库、基因表达谱数据库以及代谢组数据库进行分析，筛选在HSYA生物合成途径的关键还原酶基因，并进行功能验证，以期揭示红花次生代谢成分生物合成途径，为定向调控红花的品质提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
云南巍山红花品系（ZHH0119），采自海军军医大学药学系温室，经海军军医大学郭美丽教授鉴定为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）。红花种植条件：温度恒定25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。采集相关花与组织后迅速存放于液氮或者−80 ℃冰箱中冷冻。
1.2 RNA提取及cDNA第一链合成
按照Trans ZOL Plant植物总RNA提取试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法提取红花花冠总RNA，按照Transtart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix逆转录试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法进行cDNA第一链的合成。cDNA于−20 ℃保存。
1.3 基因筛选
基于数据库中的基因注释以“黄酮还原酶”和“黄酮类化合物生物合成”作为关键词进行检索，筛选出其中可能与HSYA生物合成相关的还原酶基因，将筛选基因不同花期时间的表达量，将其与红花代谢组数据库中同花期的芦丁（rutin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、HSYA、柚皮素（naringenin）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（kaempferol-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-gluciside）、Carthamin、芹菜素（apigenin）、黄芩素（scutellarein）、木犀草素（luteolin）、苯丙氨酸（D-phenylalanine） 12个主要成分的含量[12,25]进行皮尔森相关性分析。
1.4 全长克隆及生物信息学分析
基于红花花冠EST转录组文库，结合第三代测序技术[26-29]红花花冠全长转录组数据库筛选得到目的基因序列。在其5'端、3'端分别设计特异性引物。按照2× Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）高保真酶（南京诺唯赞公司，中国）说明书进行PCR扩增，扩增片段经EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书操作回收后，连接于pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金公司，中国）载体上，转化至大肠杆菌T1感受态细胞（北京全式金公司，中国）后，涂布在LBA平板上，恒温培养37 ℃过夜，挑取阳性单克隆菌落[30-31]，送至上海生工生物有限公司进行菌液测序。
用ExPASyProtParam工具（http://web.expasy.org/compute/）对目的基因的理论等电点（pI），蛋白分子量（MW）和蛋白分子式进行预测。通过Simple Molecule Architecture Research Tool工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对目的基因编码的蛋白质结构功能域进行分析。使用ProtScale（http://us.Expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）以及TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质的亲/疏水性和跨膜区域做出预测。使用SignaIP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测目的蛋白是否含有信号肽。使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对筛选出的SDRs基因进行BLAST序列比对。通过Neighbor-Joining相邻节点法构建系统发育进化树，自展分析法进行1000次重复[32-34]。使用PBILYON-GRLAND数据库预测构建蛋白质二级结构模型。蛋白三级结构由Protein Homology/analogy Recognition Engine预测。用WOLFPSORT软件（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测。
1.5 目的基因表达模式分析
取盛花期新鲜红花根、茎、叶、花冠4个部位的新鲜组织和花期Ⅰ（开花前3 d）、花期Ⅱ（开花当天）、花期Ⅲ（开花后1 d）、花期Ⅳ（开花后3 d）4个花期的新鲜花冠，提取总RNA，合成cDNA第一链后，在靠近5'端处对各个基因设计引物，依据Transtart Top Green qPCR super Mix（北京全式金公司，中国）试剂盒推荐体系，以Ct60s（KJ634810）作为内参标记基因，进行qRT-PCR实验，结果使用2−ΔΔCt的方法进行计算分析[35]。
1.6 植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
根据CtSDR3的开放阅读框和植物真核表达载体pMT-39序列信息，设计无缝克隆引物。以红花cDNA做模板，使用高保真酶进行PCR反应。产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经NcoI酶切线性化的pMT-39载体进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性克隆菌株扩大培养后抽提质粒，提取的pMT39-CtSDR3质粒用冷冻法转至农杆菌GV3101中。LBK+Rif平板筛选阳性克隆后，取1ml OD600 = 0.8的菌液经6 000 r/min，离心3 min后用1 ml 5%蔗糖溶液重悬，加入Silwet-L 1μl，用注射器注射于红花花柱，套袋避光[35]。
在pMT-39的35 s启动子区域设计5'端特异性引物，在目的基因CtSDR3中设计3'端引物。取T2代新鲜叶cDNA第一链作为模板，2× Easy Taq PCR Mix（北京全式金，中国）推荐体系进行PCR反应，确定是否存在目的条带。采集CtSDR3阳性植株花冠以及pMT-39空载体对照植株的花冠，按照上述的qRT-PCR反应体系评价CtSDR3基因的过表达水平，使用UPLC-Q-TOF/MS 检测CtSDR3过表达组和空载体对照组的黄酮代谢物含量，选择以HSYA为代表性成分的8个黄酮类化合物作为检测对象。
1.7 原核表达载体构建及蛋白表达
根据CtSDR3的开放阅读框及蛋白表达载体pGEX-6p-1以及pET-28a序列信息，设计同源重组克隆引物[34]。以红花花冠cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR反应。PCR产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经XhoI、BamHI酶切线性化的载体pGEX-6p-1以及pET-28a进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性菌株克隆扩大培养后抽提质粒，提取的重组质粒用热激法转至大肠杆菌Rosseta（DE3）（上海唯地生物，中国）中。
在20 ml LBA液体培养基中培养至OD600为0.6左右，分2份10 ml菌液各加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG和生理盐水。恒温培养箱中16 ℃，100 r/min继续培养16 h[35-36]。菌液离心弃上清液，用1×PBS缓冲液洗涤两次后重悬。超声破碎仪中40 kW，工作时间5 s，循环间隔时间25 s，共15个循环进行破碎[16]，裂解完成后取上清与沉淀15 μl，上样检测。
2. 结果
2.1 基因筛选
通过分析，得到contig325、contig483、contig2863共3个与HSYA具有强相关性的基因（r>0.85），见图1。
2.2 全长克隆和生物信息学分析
3个目的基因序列信息经测序验证结果如下：contig325全长共1523 bp，开放阅读框1341bp，编码446个氨基酸；contig483全长1393 bp，开放阅读框792 bp，编码263个氨基酸；contig2863全长序列1527 bp，开放阅读框1023 bp，编码340个氨基酸。PCR产物电泳结果如图2所示。
contig325基因编码446个氨基酸，命名为CtSDR1（GenBank登录号：MW792035）；Contig483基因编码263个氨基酸，命名为CtSDR2（GenBank登录号：MW792036）；Contig2863基因编码339个氨基酸，命名为CtSDR3（GenBank登录号：MW792037）。系统进化树表明CtSDR1与蓟Cirsium japonicum (QQH14901.1)同源性最高；CtSDR2与小蓬草Erigeron canadensis (XP_043636506.1)同源性最高；CtSDR3与小豆蔻Cynara cardunculus var. scolymus (KVI09206.1)同源性最高。Prot-param分析CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C2230H3346N606O639S7，相对分子量为49.2×103，理论等电点pI=9.61；CtSDR2基因所编码的蛋白质分子式C1289H2072N360O379S13，相对分子量为29×103，理论等电点pI=8.63；CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C1691H2614N442O481S9，相对分子量为37.1×103，理论等电点pI=6.80。Prot Scale分析预测CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白为亲水性蛋白，无信号肽属非分泌蛋白。蛋白跨膜性分析显示CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3不含有跨膜区域，为非跨膜蛋白。对CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白二级结构的预测显示均属于不规则结构。对CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3蛋白质三维结构预测如图3所示。系统进化树如图4所示。亚细胞定位预测显示，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3均可能定位于细胞质。
2.3 目的基因表达模式分析
取红花花期的Ⅳ期的红花各个部位进行分析，发现红花花冠内的CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3基因表达量从高到低依次均为花冠>叶>茎>根。其中CtSDR1在花冠中的相对表达量约为根中的3倍、而CtSDR2、CtSDR3在花冠中的相对表达量约为根中的4倍。将4个花期的红花花冠进行qRT-PCR分析表明，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3花冠中表达量均随着花冠发育逐渐升高，特别是CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3的Ⅳ期花冠对比Ⅲ期花冠的表达量分别提高了7.2倍、2.7倍、2.3倍（图5）。
2.4 CtSDR3植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
构建真和表达载体并通过PCR鉴定后，我们从19株农杆菌浸染的子代植株中得到5株pMT39-CtSDR3阳性红花植株（图6）。通过qPCR对其CtSDR3基因转录水平进行测定，结果发现阳性红花植株中CtSDR3基因的转录水平得到显著增加，约为空白组株系的2～3倍，CtSDR3的在花冠部位的高表达也证明了研究成功获取CtSDR3过表达红花植株（图7）。通过UPLC-QTOF/MS技术测定阳性转基因红花株系组和空白对照组的目标化合物含量，包括7个红花花冠主要黄酮类化合物及苯丙烷类代谢途径上游关键物质苯丙氨酸（图8），分别为：野黄芩素（scutellarein）、Carthamin、HSYA、山柰酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucoside）、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（kaempferol-3-O-β-rutinoside）、芦丁（rutin）和苯丙氨酸（D-Phenylalanine）。由图8可知，与空白组相比，CtSDR3过表达株系相较于空白组野黄芩素提高了3.6%～9.8%，HSYA提高了7.1%～16.6%，以及苯丙氨酸含量提高了5.5%～15.7%，具有显著性升高。其他化合物含量则有无显著性变化趋势。通过对过表达株系与空白组的含量分析，我们认为CtSDR3基因过表达会引起红花中黄酮类物质的变化，尤其是HSYA含量升高显著。同时，苯丙氨酸代谢途径属于植物重要的次生代谢途径，过表达组引起苯丙氨酸含量的显著上升，上述指标性成分的变化也进一步说明CtSDR3对红花黄酮类化合物次生代谢途径具有一定的影响，但目前我们尚难以判断CtSDR3红花中影响次生代谢产物积累的明确途径。
图 6 真核表达载体构建及阳性鉴定电泳图注：1. CtSDR3基因开放阅读框（ORF）区扩增产物电泳图，a、b泳道均为CtSDR3基因ORF区克隆PCR产物；2. 真核表达载体pMT-39载体酶切产物电泳图，a、b泳道为CtSDR3 PCR产物，c泳道为pMT-39载体，d、e泳道为pMT-39线性化载体；3. pMT39-CtSDR3重组载体阳性转化子鉴定电泳图，a、b泳道为阳性转化子菌液PCR产物；4. pMT39-CtSDR3质粒转化农杆菌GV3101，a、c和e泳道为空白对照组，b、d和f泳道为阳性克隆菌液PCR产物；5. 红花pMT39-CtSDR3阳性转化植株鉴定PCR产物电泳图，1～19为待鉴定植株，p为pMT39-CtSDR3质粒，k为空白组，WT为野生型红花植株
图 8 阳性植株黄酮类化合物含量测定注：A.黄芩素；B.Carthamin；C.HSYA；D.山柰酚；E.山柰酚-3-O-葡萄糖苷；F.山柰酚-3-O-芸香糖苷；G.芦丁；H.苯丙氨酸；CK.空白组株系；OVX.阳性过表达株系2.5 原核表达载体构建及蛋白表达
目的片段成功扩增，将目的条带进行胶回收、纯化。CtSDR1、CtSDR1、CtSDR1构建的pGEX-6p-1、pET-28a原核表达载体均有在大肠杆菌内表达，但是CtSDR1-pGEX-6p-1、 CtSDR2-pGEX-6p-1、CtSDR3-pGEX-6p-1、CtSDR1-pET-28、CtSDR2-pET-28a、CtSDR3-pET-28a表达的目的蛋白均形成包涵体，存在于沉淀中。无法进行下一步大量纯化实验，唯有CtSDR2-pGEX-6p-1诱导表达了存在于上清液的目的蛋白，明显可以在上清液中观察到分子量约为50 000的蛋白条带（图9）。
图 9 目的片段PCR产物电泳及表达蛋白电泳分析注：A.目的片段PCR产物电泳：1～5为CtSDR1，6～10为CtSDR2，11～15为CtSDR3（其对应的PCR反应Tm值分别为67 ℃、65 ℃、63 ℃、59 ℃、57 ℃）；B.pGEX-6p-1蛋白表达电泳分析；C.pET-28a蛋白表达电泳分析3. 讨论
越来越多的红花药理学相关研究表明，红花的主要药效物质包括查尔酮类、黄酮醇类等多种黄酮类化合物，其中，查尔酮类HSYA对脑缺血具有保护作用，并且还能抗脑血栓形成以及抗氧化等。研究HSYA的生物合成分途径，对于HSYA的工业化生产具有重要意义。
本研究借助生物学分子技术、结合代谢组分析测定，筛选出3个参与HSYA生物合成途径的关键短链脱氢还原酶基因CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3，这3个基因序列具有高度保守性，在不同器官的表达模式均呈现出花冠>叶>茎>根的特点，而且在花冠中的表达量随花冠发育逐渐升高，表明其很有可能参与红花中HSYA等主要药用成分的积累。进一步研究发现，转CtSDR3过表达T2代阳性植株花冠中CtSDR3基因的转录水平增加了2~3倍，次生代谢物HSYA的含量提高了7.1%～16.6%（P<0.05），验证了我们对CtSDR3在红花体内参与黄酮类化合物生物合成功能的推测。本研究中，体外表达CtSDR3蛋白，得到目的蛋白条带，但由于包涵体等原因，蛋白表达和纯化条件仍需要进一步摸索。下一步，我们将对可能起黄酮类生物合成途径的关键SDRs进行深入的生物学特性特别是酶结合位点的研究，为更好地阐释SDRs的生物学功能、利用分子生物育种技术培育高HSYA含量的红花新品种奠定基础。
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