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胆汁淤积是以胆汁生成障碍和胆汁排泄受阻为特征的病理性疾病，是一种临床常见的综合征[1]。胆汁淤积由胆管阻塞、肝细胞分泌缺陷等多种原因引起，肝脏和体循环中胆汁酸、胆固醇及胆红素等成分过多堆积，从而造成机体及肝细胞的损伤[2]。由于胆汁淤积的病因和损伤机制复杂，严重影响了其相关新药的开发，因此研究胆汁淤积性肝损伤的病因，寻找有效的治疗药至关重要。目前，经FDA批准用于临床治疗胆汁淤积的药物只有熊去氧胆酸（UDCA）和奥贝胆酸（OCA）[3-4]。我国中草药资源丰富，为中医药的开发和研究提供了物质基础。此中药组合物是一种用于治疗肝损伤的中药民间验方，主要由醋鳖甲、佛手、芍药等13味组成。本课题组在四氯化碳诱导的肝纤维化动物模型中证实了此中药组合物具有保肝和治疗肝纤维化等慢性肝损伤的作用[5-7]，其作用温和、无毒、无副作用，可以明显降低慢性肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的水平[6-8]，并且该作用效果可能与基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和CD147的表达增加、基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）的表达降低有关[8-9]，在肝病防治领域应用前景广泛。但到目前为止，尚未见此中药组合物从改善胆汁淤积角度进行肝病防治的研究，更未见其在α-萘异硫氰酸酯（ANIT）诱导的小鼠胆汁淤积型肝损伤模型中的相关报道。为此，本课题组采用ANIT构建小鼠胆汁淤积性肝损伤模型，研究此中药组合物在防治胆汁淤积肝病方面的研究，探索此中药组合物在防治肝病领域的理论与实践，进而为研究其在防治慢性肝病的分子机制及其临床应用方面提供理论基础。
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8周龄SPF级昆明小鼠[动物伦理号：DWLL202003225，许可证号：SCXK（豫）2021-0015，伦理负责单位：河南中医药大学]60只，雌雄各半，体质量18~22 g，由郑州大学动物实验中心提供，饲养于河南中医药大学实验动物中心；中药组合物（各组分均为颗粒剂，河南中医药大学第一附属医院中成药房）；熊去氧胆酸（UDCA）胶囊（商品名：优思弗，批号：G62222，规格：250 mg/粒，河南中医药大学第一附属医院）；水合氯醛（北京化工厂）；α-ANIT（批号：K2325417，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；全自动酶标仪[美国伯乐（BIO-RAD)]；4℃冷藏冰箱（GENERAL公司）；−80℃冰箱[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；正置显微镜[奥林巴斯集团公司（BX53）]。
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取8周龄SPF级昆明小鼠，饲养于通风、安静的环境中，定时喂食，饮水不限，进行一周的适应性饲养后随机分成6组，每组10只，分别为空白对照组（灌胃生理盐水），模型对照组（灌胃生理盐水)，中药组合物低（灌胃剂量5.25 g/kg）、中（灌胃剂量11.25 g/kg）、高（灌胃剂量20.25 g/kg）剂量组，阳性对照组（熊去氧胆酸，UDCA，0.1 g/kg）。将中药组合物颗粒与实验动物中心提供的50 ml温热纯水溶解（水温37℃），UDCA与25 ml温热纯水溶解（水温37℃），再使用超声多普勒仪器，使其充分溶解，根据体表面积法换算人与小鼠的给药剂量[10]，每日1次，灌胃7 d，第5天，除对照组外其他各组灌胃ANIT（65 mg/kg）造模，对照组灌胃给予等量橄榄油。造模48 h后，各组小鼠末次给药后30 min，收集小鼠血液和肝组织样本，进行各项指标的检测。每日定时观察小鼠进食、体质量、饮水、活动、精神、皮毛、大小便等情况。
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收集小鼠血液和肝组织样本用于各项指标分析。经腹腔注射10%水合氯醛（0.03 ml/10 g）麻醉后，摘眼球取血，放EP管中，于4℃冰箱内静置2 h左右，
3500 r/min离心20 min，取上清液，按照试剂盒说明书检测ALT、AST、ALP、TBA、γ-GT、TBIL、MDA、SOD、GSH-PX含量。打开腹腔取出肝脏，先用磷酸盐缓冲液（PBS）平衡盐溶液将上面的血液等杂质小心洗干净，用滤纸吸干，然后用刀片切下一部分左叶放入10%中性福尔马林溶液中固定，做常规病理切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，观察小鼠肝脏病理变化。剩余肝组织置于冻存管中，然后速放入液氮中，再转−80℃冰箱冻存。 -
①石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、75%酒精各5 min，然后用自来水冲洗。②苏木素染色：切片入苏木素染液3～5 min，然后用自来水冲洗，再用分化液分化，然后用自来水冲洗，再用返蓝液返蓝，再进行流水冲洗。③伊红染色：切片依次入85%、95%的酒精脱水5 min，放入伊红中染色5 min。 ④脱水封片：切片依次放入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ 、无水乙醇Ⅲ、二甲苯Ⅰ各5 min，然后再放二甲苯Ⅱ5 min进行透明，最后用中性树胶封片。
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采用SPSS 22.0软件，计量资料用均数±标准差（
$ \bar x \pm s $ ）表示，组内比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05，P<0.01为差异有统计学意义。 -
与对照组相比，给予ANIT后，模型组小鼠血清中肝功酶学指标（ALT、AST、ALP）水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，中药组合物中、高剂量组和UDCA组小鼠外周血清中ALT、AST、ALP含量明显降低（P<0.01），低剂量组ALT的表达降低（P<0.05），表明中药组合物能够改善肝损伤血清生化指标（表1）。
表 1 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血中ALT、AST、ALP含量影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 ALT（U/L） AST（U/L） ALP（金氏单位） 对照组 35.31±3.24 123.58±7.86 3.15±1.14 模型组 69.76±5.33## 186.65±8.25## 12.25±3.46## 中药组合物低剂量组 42.59±2.13* 142.12±10.34** 5.17±2.52** 中药组合物中剂量组 36.22±3.24** 125.73±9.63** 3.25±1.16** 中药组合物高剂量组 40.15±4.33** 136.68±8.45** 4.43±2.45** UDCA组 35.46±3.65** 124.24±7.41** 3.76±1.36** *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与对照组比较。 -
与对照组相比，给予ANIT后，模型组黄疸特异性指标（TBA、TBIL和γ-GT）的表达水平明显升高（P<0.01）。与模型组相比，中药组合物中、高剂量组和UDCA组能够显著降低小鼠外周血清中TBA、TBIL和γ-GT含量（P<0.01）；中药组合物低剂量组TBA和TBIL表达降低（P<0.05），γ-GT表达降低（P<0.01），表明中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠具有降低黄疸的作用（表2）。
表 2 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血中TBA、TBIL、γ-GT含量影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 TBA（μmol/L） TBIL(μmol/L) γ-GT(U/L) 对照组 2.34±1.64 12.06±4.54 2.27±1.18 模型组 10.87±2.32## 35.17±2.64## 11.37±3.54## 中药组合物低剂量组 4.36±2.25* 18.02±4.62* 3.87±2.02** 中药组合物中剂量组 3.13±1.45** 14.67±2.56** 3.27±2.21** 中药组合物高剂量组 4.36±2.16** 15.37±3.45** 3.23±1.25** UDCA组 4.21±2.58** 13.15±3.26** 3.02±1.45** *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与对照组比较。 -
与对照组相比，给予ANIT后，模型组肝脏抗氧化因子（SOD、GSH-Px）活性降低明显（P<0.01），而MDA的表达水平上升明显（P<0.01），与模型组相比，中药组合物中剂量组、高剂量组和UDCA组SOD、GSH-Px的表达水平显著升高（P<0.01），同时中药组合物低、中、高剂量组MDA的表达水平显著降低（P<0.01），中药组合物低剂量组SOD、GSH-PX的表达升高（P<0.05），UDCA组MDA的表达降低（P<0.05）。结果提示，中药组合物能够通过清除氧化自由基减少炎症反应进而保护肝脏（表3）。
表 3 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血中SOD、MDA、GSH-PX含量影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 SOD（U/ml） MDA（nmol/ml） GSH-PX[nmol·
（min·g）−1]对照组 305.65±8.21 7.75±3.24 139.58±8.02 模型组 210.46±8.96## 20.65±2.86## 86.05±9.78## 中药组合物低剂量组 257.32±5.42* 13.31±4.21** 118.87±6.52* 中药组合物中剂量组 297.35±5.64** 8.76±3.46** 130.35±4.15** 中药组合物高剂量组 275.34±6.54** 11.75±5.12** 126.48±6.06** UDCA组 300.02±7.38** 8.52±3.35* 132.34±5.47** *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与对照组比较。 -
对照组小鼠肝脏病理切片显示肝细胞胞浆丰富，肝细胞圆润饱满，小叶结构完整清晰，无纤维组织，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无炎症细胞浸润；与对照组相比，模型组小鼠肝脏病理切片显示肝脏细胞呈现脂肪变性，中央静脉周围汇管区炎症细胞浸润，部分肝细胞排列紊乱，出现点状坏死；与模型组相比，中药组合物低剂量组、高剂量组肝脏细胞炎症浸润稍微减轻，较模型组好转。中药组合物中剂量组肝脏细胞脂肪变性显著减少，肝脏细胞排列紊乱恢复，炎症细胞浸润现象较模型组改善明显，肝小叶结构完整；UDCA组部分肝细胞水肿，中央静脉周围有少量散在炎症细胞浸润，逐渐恢复细胞序列。具体见图1。
图 1 各组肝损伤病理学变化（HE染色，×400）
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目前认为胆汁淤积与各种肝脏疾病密切相关[11]，如黄疸、胆结石、急性肝炎、原发性硬化性胆管炎（PSC）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）等，其中引起成年胆汁淤积的两种最主要的疾病就是PSC和PBC，这些疾病不仅使人们的生活质量下降，也大大增加了家庭和社会负担[12]，因此，开发治疗胆汁淤积肝疾病更有效的药物是临床面临的迫切任务，深入阐述胆汁淤积肝损伤的病理机制则有助于寻找更加精准的治疗靶点。
ANIT是急性胆汁淤积肝损伤动物模型常用造模试剂，在肝脏中经细胞色素P450超家族（CYP）与谷胱甘肽（GSH）结合之后被转运至胆管并集中在胆汁内，造成胆管上皮细胞损伤，以致肝小叶间胆管炎症及肝内胆管增生，导致胆管阻塞，使胆汁酸等物质在肝脏中过度堆积，从而产生肝毒性[13-14]。同时胆汁反流及扩散，使周围的肝细胞损伤，引发系统出现炎症，进而导致高胆红素血症。
本研究通过灌胃ANIT构建小鼠胆汁淤积肝病模型，小鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL、TBA、MDA及γ-GT水平显著升高，GSH-PX、SOD表达显著下降，经苏木精-伊红染色肝脏出现病理损伤。
ALT、AST作为肝脏中不可或缺的酶，主要分布在肝细胞胞浆和线粒体内，是临床最常用的检测肝功能的指标，能在一定程度上反映肝损伤程度，随着肝细胞结构和功能的破坏，可被大量释放到外周血，其血清浓度与肝脏损伤程度呈正相关关系[6]。本研究结果显示，此中药组合物能显著降低胆汁淤积模型小鼠清中ALT、AST的表达水平，提示其具有保护肝脏免受ANIT所致损伤的作用。
临床上将血清ALP 升高作为各种原因所致胆汁淤积早期诊断的特征性指标之一[15]，当肝脏出现损伤或胆汁排泄不畅时，血清中ALP的浓度就会升高[15]。本研究结果显示，此中药组合物各剂量组能不同程度降低小鼠胆汁淤积模型血清中ALP的浓度。
肝脏是TBIL和TBA主要的代谢场所，当肝细胞发生病变或肝内外出现阻塞时，肝脏正常的代谢和排泄功能发生障碍，TBA和TBIL在血液中积聚，出现黄疸现象[16-17]。γ-GT在肝内主要分布于肝细胞胞浆和肝内胆管上皮。临床上此酶主要用于诊断肝胆疾病，是胆道梗阻和肝炎活动的指标之一。本研究结果显示，此中药组合物能显著降低胆汁淤积模型小鼠血清TBA、TBIL和γ-GT水平，改善黄疸症状。
脏损伤通常伴有氧化应激反应的发生[18-19]，因此本研究还检测了抗氧化因子SOD和GSH-PX表达。结果显示，中药组合物能够明显增加胆汁淤积小鼠血清中SOD和GSH-PX的含量，表明中药组合物能通过其抗氧化活性发挥保护肝损伤的作用。UDCA作为临床治疗胆汁淤积的常用药物，在本实验研究中，其改善胆汁淤积肝损伤血清学指标、降低黄疸以及清除氧化自由基效果明显。MDA作为机体自由基与生物膜发生脂质过氧化反应的重要产物[20-21]，其表达水平与细胞发生自由基氧化的程度密切相关，本研究结果显示此中药组合物能够显著降低胆汁淤积小鼠MDA的表达水平，提示其能够改善ANIT所致的氧化损伤。
综合肝脏病理学变化和血清生化结果，中药组合物中剂量组（11.25 g/kg）效果较为明显，其发挥改善胆汁淤积型肝病的效果较好，其整体改善作用与阳性药相当。
综上所述，此中药组合物对ANIT诱导的小鼠胆汁淤积性肝病具有明显的保护作用，其改善胆汁淤积的作用可能与改善肝损伤血清学指标、降低黄疸以及清除氧化自由基、减轻炎症反应等有关。本研究进一步丰富了此中药组合物防治肝病的研究资料，为此中药组合物防治肝病提供了参考依据和理论基础。
The protective effect of a traditional chinese medicine composition on ANIT induced liver injury in mice with cholestasis
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摘要:
目的 探讨一种中药组合物对α-萘异硫氰酸酯（ANIT）诱导的小鼠胆汁淤积肝损伤的保护作用。 方法 取8周龄SPF级昆明小鼠，随机分成6组，每组10只，分别为空白对照组（灌胃生理盐水），模型对照组（灌胃生理盐水）,中药组合物低（灌胃剂量5.25 g/kg）、中（灌胃剂量11.25 g/kg）、高（灌胃剂量20.25 g/kg）剂量组，阳性对照组（熊去氧胆酸，0.1 g/kg），每日1次，连续灌胃药7 d。第5天，空白对照组灌胃给予等量橄榄油，其他各组灌胃ANIT（65 mg/kg）造模。造模48 h后，各组小鼠末次给药后30 min，收集小鼠血液和肝组织样本，进行各项指标的检测。采用试剂盒检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆汁酸（TBA）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、总胆红素（TBIL）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和丙二醛（MDA）含量。采用HE染色观察小鼠肝脏病理学变化。 结果 与模型组相比，中药组合物各剂量组能够明显降低小鼠外周血清中ALT、AST、ALP、TBA、TBTL、γ-GT和MDA含量（P<0.05），显著提高SOD和GSH-PX水平（P<0.05）。与模型组相比，中药组合物低剂量组、高剂量组肝细胞脂肪变性减少，炎症浸润减轻；中剂量组肝脏细胞脂肪变性显著减少，炎症浸润现象明显改善，肝细胞呈索状排列，肝小叶结构完整。 结论 中药组合物能够改善肝损伤血清生化学指标、降低黄疸和清除氧化自由基，从而发挥对ANIT诱导的小鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用。 Abstract:Objective To explore the protective effect of a traditional chinese medicine composition on ANIT induced cholestasis liver injury in mice. Methods 8-week old SPF Kunming mice were randomly divided into 6 groups, 10 mice in each group which were the blank control group （normal saline gavage）, the model control group （normal saline gavage）, the low （gavage dose: 5.25 g/kg） group, the medium （gavage dose: 11.25 g/kg） group and the high （gavage dose: 20.25 g/kg） group of traditional chinese medicine composition, the positive control （Ursodeoxycholic acid, UDCA, 0.1 g/kg）. Mice were administered with continuous gavage once a day, for 7 consecutive days. On the 5th day, the blank normal control group was given an equal amount of olive oil by gavage, all other groups were given ANIT （65 mg/kg） by gavage for modeling. After 48 hours of modeling, 30 minutes after the last administration of each group of mice, blood and liver tissue samples were collected for testing of various indicators. The corresponding kits were used to detect the content of alanine transaminase （ALT）, aspartate transaminase （AST）, alkaline phosphatase （ALP）, total bile acid （TBA）, γ-glutamyl transpeptidase （γ-GT）, total bilirubin （TBIL）, superoxide dismutase （SOD）, glutathione peroxidase （GSH-PX） and malondialdehyde （MDA） in peripheral blood of mice, respectively. HE staining was used to observe the pathological changes in the liver of mice. Results Compared with the model group, each dose group of traditional chinese medicine composition reduced the levels of ALT, AST, ALP, TBA, TBIL, γ-GT and MDA （P<0.05） significantly, markedly increased the levels of SOD and GSH-PX （P<0.05）. Compared with the model group, the low-dose and high-dose groups of traditional chinese medicine composition showed a decrease in hepatic steatosis and a reduction in inflammatory. The moderate dose group showed a significant reduction in hepatic cell steatosis and a significant improvement in inflammatory infiltration, the liver cells were arranged in cords, and the structure of lobules of liver was intact. Conclusion Traditional chinese medicine composition could improve serum biochemical indicators of liver injury, reduce jaundice and eliminate oxidative free radicals, thereby exerting a protective effect against ANIT-induced cholestatic liver injury in mice. -
白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹的干燥块根，首载于《神农本草经》。白蔹是最早用于疮痈、烫伤[1]治疗的药物，具有解毒、生肌的功效。资料显示，白蔹在皮肤创伤治疗中的使用频率较高。随着白蔹药理研究的不断深入，发现白蔹还具有抗菌、抗病毒[2-6]、免疫调节及促进溃疡快速愈合等作用。
在2015版《中国药典》中，白蔹的质量标准只有定性分析而无定量分析。白蔹成分检测中发现其含大黄素等蒽醌类活性成分[7]，且白蔹中大黄素的定量测定方法文献资料[8-9]较少。本实验采用反相高效液相色谱法，建立白蔹药材中大黄素含量测定方法，为白蔹的质量控制标准提供方法和依据。
1. 试药与仪器
1.1 试药
大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110756-201512，经面积归一化法计算含量为99.1%）；甲醇（烟台远东精细有限公司，批号：160706）为色谱纯，水为超纯水，磷酸（莱阳市双双化工有限公司，批号：2010246）为分析纯，硫酸（淄博市淄川区张庄化学试剂厂，批号：950626）为分析纯。白蔹饮片（安国市弘发中药材饮片有限公司，批号：131001），经淄博市中医院药品供应科主任魏星教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹Ampelopsis japonica(Thunb.) Makino的干燥块根。
1.2 仪器
Lab Alliance PC 3000 高效液相色谱仪（美国科学系统公司），紫外检测器（北京普析通用仪器有限责任公司）；LD310-2R电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；FA/JA系列电子天平（上海上平仪器有限公司）；RE-201D型恒温水浴锅、RE-201D型旋转蒸发器（郑州博科仪器设备有限公司）；766-3型远红外快速干燥箱（江苏省南通县金余电器配件厂）。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
Apollo-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇−0.2%磷酸溶液（85:15），流速1.0 ml/min，检测波长220 nm，进样量20 μl。在此条件下，大黄素与相邻色谱峰分离度良好，无干扰，理论塔板数为2 000。对照品与供试品色谱图见图1。
2.2 溶液的配制
2.2.1 对照品溶液的制备
取大黄素对照品（含量为99.1%）约10 mg，精密称定，置于1 000 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为9.91 μg /ml 的大黄素对照品储备液，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备
取过5目筛的白蔹药材粉末，置烘箱内（70±2）℃，2 h烘干。精密称量30 g，用10倍量质量分数20%的硫酸在50 ℃条件下回流水解2 h。过滤，取滤渣。滤渣用纯化水洗至中性（pH=7），烘干。称其质量，记录。再以8倍量体积的95%乙醇在82 ℃条件下回流提取2次，每次1 h，过滤，合并乙醇提取液，减压蒸馏，浓缩至无醇味，加乙醇溶解并定容于10 ml容量瓶中，即得供试品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察
分别精密量取“2.2.1”项下制备的大黄素对照品溶液各125、250、500、1 000、2 000、4 000 μl，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成6种不同浓度的对照品溶液。依次精密吸取对照品溶液各20 μl注入高效液相色谱仪中，记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标，对照品溶液浓度X为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y = 53 962X − 966. 46，r = 0.999 7；结果表明大黄素在0.124～3.968 μg/ml浓度范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验
精密量取对照品溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。大黄素峰面积RSD为1.7%。仪器精密度良好，符合要求。
2.3.3 重复性试验
精密称取同一批号样品6份，按“2.2.2”项下方法平行制备样品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别进样，测定大黄素的峰面积，RSD为1.2%（n= 6），结果表明本方法重复性良好。
2.3.4 稳定性试验
按“2.1”项下色谱条件，分别精密量取在室温（10~30 ℃）下放置0、2.5、5、7.5、10、24 h的同一份供试品溶液各20 μl进样测定，记录大黄素的峰面积，6次进样结果表明，供试品溶液在24 h内基本稳定，RSD为1.5%。
2.3.5 加样回收率试验
取同一批次（批号：20170704）已知含量的白蔹药材样品9份，分别按相当于样品溶液中大黄素含量的80%（n=3）、100%（n=3）、120%（n=3）加入“2.3.1”项下制备的对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。计算回收率，结果见表1。
表 1 白蔹药材样品加样回收率试验结果样品含有量（m/mg） 加样量（m/mg） 测得量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD
（%）0.225 0.180 0.399 96.7 99.7 2.5 0.225 0.180 0.403 98.9 0.225 0.180 0.409 102.0 0.225 0.225 0.446 98.2 0.225 0.225 0.458 103.6 0.225 0.225 0.447 98.7 0.225 0.270 0.503 103.0 0.225 0.270 0.494 99.6 0.225 0.270 0.487 97.0 2.3.6 样品测定
取不同批次白蔹药材样品，分别按“2.3.2”项下方法制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，连续进样3次，以外标法计算含量，测定结果见表2。
表 2 白蔹样品大黄素含量测定结果(n=3)批号 含量（μg/g） RSD（%） 20170622 17.845 1.16 20170626 19.113 2.07 20170704 15.002 2.50 3. 讨论
3.1 色谱条件的选择
3.1.1 检测波长的选择
笔者所查文献[8-10]中，测量大黄素所用波长有254、290 nm等。通过实验发现，不同的波长影响其重现性及灵敏度。通过对大黄素标准品甲醇溶液全波段（200～400 nm）紫外扫描可见:其在220、254、260、272、278 nm处均具有特征吸收。通过综合比较上述波长处大黄素峰的峰形及峰面积，220 nm处波长的峰形较好、干扰少、峰面积较大，故选定220 nm作为白蔹药材中大黄素的测定波长。
3.1.2 流动相的选择
大黄素的化学名为1'3'8-三羟基-6-甲基蒽醌，具有一定的极性和酸性。所查文献中，大黄素含量测定的流动相体系有多种。在实验过程中发现，流动相对色谱峰的保留时间及分离度有较大影响。故本实验在选择流动相时，考察了不同比例的甲醇-水，乙腈-水，甲醇:0.1%磷酸溶液[8-10]，甲醇:0.5%磷酸溶液[11]，甲醇:0.2%磷酸溶液，甲醇:0.02%磷酸溶液，甲醇:1% 冰醋酸[12]等不同溶剂系统，结果表明，相同条件下，甲醇:0.2%磷酸溶液（85:15）为流动相时，可以达到基线分离，出峰时间较短，峰形较好。
3.1.3 流速与进样量的选择
在流动相及波长选定的条件下，考察了不同流速（0.5~2.0 ml/min）对出峰时间的影响，当流速小于1.0 ml/min时，保留时间延长，使流动相的用量增加，会造成试剂的浪费；当流速大于1.0 ml/min时，保留时间缩短，但大黄素的峰会与杂质峰产生重叠，影响分离度及重现性。本实验选择1.0 ml/min作为流速。
在样品浓度一定的条件下，考察了不同进样体积（10～30 μl）的影响。实验结果表明，进样体积小于20 μl时，重现性及灵敏度均下降；大于20 μl时，杂质峰明显。当进样量为20 μl时，峰的对称性得到保证。因此，本实验选择20 μl为进样量。
3.2 样品提取方法的选择
已有文献[8]对白蔹中大黄素的提取方法采用甲醇提取及三氯甲烷萃取法。通过实验发现这种方法稳定性差、步骤烦琐，且所用试剂毒性较大。本实验在上述提取方法的基础上，参照大黄药材中大黄素的提取方法[10]，通过4因素（粒度、溶剂剂量、溶剂浓度、提取时间）3水平的正交设计确定了白蔹中大黄素的提取方法。结果表明，采用过5目筛的白蔹粉末，先用20%的硫酸在50 ℃条件下回流酸水解2 h，滤渣用纯化水洗至中性。再用8倍量体积的95%乙醇，水浴回流2 h能够达到较好的提取效果。白蔹中含大黄素等游离蒽醌，还含有结合型蒽醌[13-14]。先进行酸水解，使结合型蒽醌水解，结果大黄素的含量有所提高。白蔹具有的抗菌性与其中的大黄素[15-16]有关，大黄素是白蔹的活性成分。本提取方法克服了以往相关文献报道方法的不足，分离度好、重现性好、结果准确，因此大黄素作为白蔹药材中指标成分有一定可行性，为完善白蔹药材的质量控制标准提供了方法和依据。新药临床试验的质量是药品上市后安全、有效的保障[17]，所以临床试验过程中的质量控制尤为重要。包括相似性评价（外观检测和观感评估测试）、安全性评价（常规安全性检测）、适用性评价（薄层鉴别、HPLC、指标成分测定和药理实验）和最终制剂的质量标准。临床试验过程中的质量控制所要评价的范围更广、要求更为严格，是为了确保临床数据的真实、准确、完整和可靠，为下一步临床应用提供依据，对提高医疗水平具有重大意义。
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表 1 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血中ALT、AST、ALP含量影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 ALT（U/L） AST（U/L） ALP（金氏单位） 对照组 35.31±3.24 123.58±7.86 3.15±1.14 模型组 69.76±5.33## 186.65±8.25## 12.25±3.46## 中药组合物低剂量组 42.59±2.13* 142.12±10.34** 5.17±2.52** 中药组合物中剂量组 36.22±3.24** 125.73±9.63** 3.25±1.16** 中药组合物高剂量组 40.15±4.33** 136.68±8.45** 4.43±2.45** UDCA组 35.46±3.65** 124.24±7.41** 3.76±1.36** *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与对照组比较。 
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表 2 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血中TBA、TBIL、γ-GT含量影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 TBA（μmol/L） TBIL(μmol/L) γ-GT(U/L) 对照组 2.34±1.64 12.06±4.54 2.27±1.18 模型组 10.87±2.32## 35.17±2.64## 11.37±3.54## 中药组合物低剂量组 4.36±2.25* 18.02±4.62* 3.87±2.02** 中药组合物中剂量组 3.13±1.45** 14.67±2.56** 3.27±2.21** 中药组合物高剂量组 4.36±2.16** 15.37±3.45** 3.23±1.25** UDCA组 4.21±2.58** 13.15±3.26** 3.02±1.45** *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与对照组比较。
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表 3 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血中SOD、MDA、GSH-PX含量影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 SOD（U/ml） MDA（nmol/ml） GSH-PX[nmol·
（min·g）−1]对照组 305.65±8.21 7.75±3.24 139.58±8.02 模型组 210.46±8.96## 20.65±2.86## 86.05±9.78## 中药组合物低剂量组 257.32±5.42* 13.31±4.21** 118.87±6.52* 中药组合物中剂量组 297.35±5.64** 8.76±3.46** 130.35±4.15** 中药组合物高剂量组 275.34±6.54** 11.75±5.12** 126.48±6.06** UDCA组 300.02±7.38** 8.52±3.35* 132.34±5.47** *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与对照组比较。
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