下载:
下载:
-
尽管强效且具有高度选择性的小分子抑制剂仍在不断得到开发与应用，但这类传统药物并不能直接调控细胞内目标蛋白的含量，难以靶向缺乏配体结合口袋的“难成药”靶点[1-3]，且起效剂量较大，长期使用耐药性明显[4-6]。因此，随着研究的不断深入，利用细胞内固有的蛋白降解机制靶向降解特定蛋白的方式，引起了科学界的极大关注，并成为一种颇具前景的治疗手段。
泛素-蛋白酶体系统（UPS）是细胞内降解受损或错误折叠蛋白质的核心机制，参与胞内80%以上蛋白质的降解[7]。其主要过程为：首先，泛素（Ub）与泛素激活酶（E1）形成硫酯键；活化的泛素通过硫酯交换反应被转移至泛素结合酶（E2）；随后，泛素连接酶（E3）同时结合“E2-泛素复合物”与靶蛋白，使两者在空间上充分接近，驱动泛素转移至靶蛋白。该过程由ATP供能，多次重复可使底物被泛素链标记，最终被蛋白酶体识别并降解[8-9]（图1）。基于UPS的靶向蛋白降解技术中，研究最为成熟的包括PROTAC和分子胶。
图 1 基于UPS的靶向蛋白降解机制
除UPS外，在真核生物中还普遍存在另一种降解途径，即溶酶体介导的降解途径。该途径涉及的底物范围十分广泛，包括衰老或受损的细胞器、蛋白质聚集体以及入侵的病原微生物等，与UPS互为补充。溶酶体降解途径主要包括内体-溶酶体途径（ELP）[10]和自噬-溶酶体途径（ALP）[11-12]，因此，基于ELP的靶向降解技术主要应用于胞外蛋白和膜蛋白的靶向降解，例如LYTAC；ELP是指细胞通过受体介导的内吞作用将胞外物质或膜蛋白与内体融合，并最终转运至溶酶体中降解的过程（图2A）；ALP通常是指在自噬关键蛋白LC3的参与下，通过形成自噬小体将底物包裹，最终与溶酶体融合实现降解的过程（图2B）。基于ALP的靶向降解技术进一步拓展了靶向降解胞内蛋白（包括蛋白聚集体）的技术手段，并成功应用于降解受损细胞器和其它非蛋白生物分子，主要降解技术包括ATTEC、AUTAC和AUTOTAC等。
图 2 基于ELP和ALP的靶向降解机制
基于以上两种途径的靶向蛋白降解技术，利用“事件驱动”（event driven）而非“占据驱动”（occupation driven）的作用模式发挥功能，理论上仅需催化量的药物即可发挥较强疗效，在靶向“难成药”靶点、提高选择性、克服耐药、降低毒副作用等方面表现出较大的优势，具有广阔的应用前景。本文综述了近年来兴起的代表性的靶向降解策略，并讨论其优势与局限性。
-
PROTAC是一类异双功能分子，一端为靶蛋白配体，另一端为E3连接酶配体，中间通过Linker相连。在细胞中PROTAC通过同时结合底物蛋白和E3，形成“靶蛋白-PROTAC分子-E3”三元复合物，诱导靶蛋白的泛素化和蛋白酶体降解。自2001年Crews等首次提出PROTAC的概念以来[13]，该技术不断发展与完善，越来越多的科研人员致力于通过PROTAC靶向降解目标蛋白。目前已有多种类型靶标蛋白质可通过该策略实现降解，包括核受体（ER[14]、AR[15-27]等）、蛋白激酶（CDK4[28-29]、CDK9[30-32]、ALK[33-34]等）、蛋白转录调控蛋白（BRD4[35-40]、HDAC6[41-43]、Sirt2[44-45]等）、调节蛋白（AHR[46]等）、神经性疾病相关蛋白（Tau[47-49]等）、细胞代谢酶（MetAP2[13]等）以及融合蛋白（HaloTag[50]）等。此外，尽管人类基因组可以编码600多个E3连接酶[51]，但是仅有Cereblon（CRBN）、von Hippel-Lindau （VHL）、mouse double minute 2 homologue （MDM2）和cellular inhibitor of apoptosis protein-1（cIAP）等有限的几个成功用于PROTAC的构建（图3）。
图 3 常见的E3连接酶及其配体
以经典靶点BRD4蛋白为例，作为BET蛋白家族中最重要的一员，BRD4在人体中广泛分布，对细胞正常生长及细胞周期的调控具有重要意义，亦是肿瘤发生的重要参与者，针对BET的抑制剂已有长期研究基础。2015年，Crews课题组设计了一种新型小分子PROTAC：ARV-825（化合物7，图4A），其一端为泊马度胺（pomalidomide），可被E3泛素连接酶CRBN识别，另一端为已进入临床试验的BRD4抑制剂OTX015，两者通过聚乙二醇链相连，用于靶向降解BRD4蛋白。Western Blot实验表明，化合物7能在BL细胞中成功诱导BRD4的高效降解（DC50<1 nmol/L）。该研究为BRD4的靶向降解提供了强有力的手段，具有深远的临床价值和治疗意义；且首次实现E3连接酶CRBN在PROTAC中的应用，为小分子PROTAC的设计奠定了基础[52]。
图 4 化合物7~9（PROTAC）的化学结构
PROTAC策略正持续赋能针对多种疾病相关靶点的药物开发，当前已有约20个PROTAC分子进入临床研究阶段[53]。其中，ARV-110（化合物8，图4B）与ARV-471（化合物9，图4C）是最早进入临床研究的PROTAC药物，分别通过靶向雄激素受体（AR）与雌激素受体（ER）治疗转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）和ER+/HER2-晚期乳腺癌患者[54-56]。据Arvinas公司公布的Ⅰ期和Ⅱ临床试验数据，ARV-110对携带ART878或H875突变患者具有较强治疗作用；ARV-471能够显著降低ER+/HER2-晚期乳腺癌患者肿瘤组织中的ER表达水平，可达到38%的临床获益率（CBR）。
尽管PROTAC技术给药物开发带来了新的机遇，但也面临一些关键挑战，例如：①分子量过大、透膜性差导致的成药性问题，多数降解剂无法通过口服给药，甚至一些基于寡核苷酸或多肽的PROTAC，需要通过特殊的药物递送系统进入细胞；②E3连接酶在不同细胞和组织中的表达不同，可用于构建PROTAC的E3连接酶仅有CRBN和VHL等少数几个，针对E3连接酶配体的类药性优化难度较大；③hook effect，即PROTAC在低浓度下药效较弱，在高浓度下又因无法形成三元复合物抑制泛素化降解的过程。
-
分子胶是利用UPS实现细胞内蛋白靶向降解的另一种技术手段。分子胶通常符合“类药五原则”，与PROTAC相比具有更小的分子量（通常小于600）、更好的膜通透性和成药性，但是并不等同于“去掉连接子的PROTAC”。分子胶通过诱导或稳定E3连接酶与靶蛋白之间的“蛋白-蛋白相互作用”，介导靶蛋白泛素化和随后的蛋白酶体降解。分子胶的发现大多是偶然的，尚难以实现理性设计[57]。2014年，Ebert课题组发现免疫抑制药物Thalidomide（沙利度胺）、Pomalidomide（泊马度胺）和Lenalidomide（来那度胺）（化合物1~3，图3）在与CRBN结合后可促使锌指转录因子IKZF1和IKZF3泛素化并产生降解，进而发挥免疫调节和抗肿瘤作用[58]。后续研究发现，化合物3与CRBN的结合还可诱导酪蛋白激酶1α（CK1α）的降解[59]。在上述研究中，化合物1~3均位于E3连接酶CRBN及靶蛋白之间，充当了分子胶的作用。
化合物10（图5A）是一种具有选择性抗肿瘤活性的芳基磺胺类药物，但其作用机制一直不明[60]。2017年，Nijhawan课题组证实化合物10在E3连接酶CUL4-DCAF15和RNA剪切因子RBM39间作为分子胶粘合剂诱导RBM39的泛素化和降解，与其结构类似的化合物11（图5B）和化合物12（图5C）也有相同机制[61]。2020年，Bussiere等解析出DCAF15-DDB1-DDA1-indisulam-RBM39的晶体结构，直观地证实了其分子胶的作用[62]。
图 5 化合物10~13（分子胶）的化学结构
目前已有多个分子胶进入临床研究阶段。例如，诺华公司开发的分子胶DKY709（化合物13，图5D）能够靶向降解转录因子IKZF2，正在作为单一药物，或与抗PD-1单克隆抗体联用进行I期临床试验，用于治疗晚期实体瘤患者；BioTheryX公司研发的分子胶BTX-1188（结构尚未披露）被FDA批准开展I期临床试验，通过降解GSPT1、IKZF1/3等多种蛋白质，实现对白血病及实体瘤的治疗作用。
尽管基于UPS 的靶向蛋白降解技术已经在新药研发领域得到了广泛应用，但受限于UPS的细胞内定位以及蛋白酶体狭窄的内径，UPS仅能降解具有胞质结构域的单体蛋白，对于胞外蛋白、蛋白聚集体及非蛋白物质无能为力。因此亟待拓展新的降解途径，为靶向蛋白的降解提供更多技术手段。
-
基于溶酶体途径有望解决PROTAC等技术的瓶颈问题，发挥协同或补偿作用。其中依赖ELP的策略包括LYTAC，依赖ALP的策略包括ATTEC、AUTAC以及AUTOTAC。
-
针对胞内蛋白的干扰和调控已经有相对成熟的研究和应用，但有约40%的基因编码产物为胞外及膜相关蛋白，例如细胞因子、趋化因子等，它们与肿瘤发生，衰老相关疾病以及自身免疫病等息息相关[63-64]。选择性降解该类蛋白具有改善人类健康的前景，但目前仍缺乏有力手段。2020年，斯坦福大学Bertozzi课题组首次提出LYTAC的概念[65]，通过将小分子或抗体与低聚M6Pn糖肽配体相连，得到LYTAC分子。其作用机制如下：首先，低聚M6Pn糖肽配体与细胞表面溶酶体靶向受体CI-M6PR结合，另一端的小分子或抗体与靶蛋白特异性结合，在细胞膜上形成“CI-M6PR-LYTAC-靶蛋白”三元复合物；随后，CI-M6PR介导细胞膜凹陷，形成囊泡结构并包裹该复合物，转运至溶酶体中使底物降解，而CI-M6PR可返回细胞膜循环利用。
根据上述原理，该研究选择临床相关的靶点作为研究对象，验证LYTAC技术的可行性。以载脂蛋白E4（ApoE4）为例，研究人员将糖肽配体与多克隆抗小鼠IgG偶联形成LYTAC分子（化合物14，图6A）。生物实验结果显示，与单独使用小鼠ApoeE4一抗相比，化合物14使K562细胞中ApoE4-647的摄取增加了13倍，且在孵育后1 h和24 h均可观察到荧光信号与溶酶体的共定位。研究人员还将表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）阻断抗体西妥昔单抗（cetuximab，ctx）与糖肽配体偶联得到靶向EGFR的LYTAC分子（化合物15，图6B）。生物实验表明，10 nmol/L化合物15与Hela细胞孵育24 h后可诱导胞内超过70%的EGFR降解。此外，研究人员将Jurkat细胞与小鼠抗铁转蛋白受体-1（CD71）抗体和化合物14共孵育24 h后观察到高于80%的CD71降解；将抗程序性死亡配体1（PD-L1）抗体与糖肽配体相连形成LYTAC分子（化合物16，图6C），并用其处理PD-L1阳性的MDA-MB-231细胞，观察到细胞表面PD-L1水平降低了33%。
图 6 化合物14~19（LYTAC）的结构示意
2021年，Bertozzi课题组再次基于LYTAC策略开发出多种具有肝组织特异性的LYTAC分子，并成功靶向降解肝癌细胞中的EGFR、HER2以及多种整合素蛋白[66]。去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是一种在肝细胞膜特异性表达的溶酶体靶向受体，而三元N-乙酰半乳糖胺（tri-GalNAc）被证明是一种高效ASGPR配体。研究人员首先将ctx连接至tri-GalNAc基团，得到靶向EGFR的LYTAC分子（化合物17，图6E），Western Blot实验表明，化合物17在10 nmol/L下成功降解HEP3B细胞70%以上的表面EGFR蛋白，且在HeLa-GFP（ASGPR−，EGFR+，M6PR+）细胞中并未观察到EGFR的下调，证实了化合物17的肝组织靶向特异性；接着将HER2抗体pertuzumab（Ptz）连接至tri-GalNAc基团，得到靶向HER2的LYTAC分子（化合物18，图6F），实验表明，该化合物在100 nmol/L浓度下成功降解HEPG2细胞中75%的HER2蛋白，而单独的Ptz作用仅能下调30% HER2含量。
此外，该课题组还将多聚特异性整合素结合肽（PIP）连接至tri-GalNAc基团，得到靶向整合素家族蛋白的LYTAC分子（化合物19，图6G），生物实验表明，化合物19在100 nmol/L下成功降解HEPG2细胞中60%的整合素蛋白。
总之，LYTAC策略首次通过溶酶体途径选择性降解胞外及膜蛋白，为该类蛋白的调控提供了有价值的工具[67]。
-
亨廷顿舞蹈症（Huntington’s disease，HD）是一种目前无法治愈的神经退行性疾病，其主要发病机理为致病突变亨廷顿蛋白（mHTT）在细胞内聚集。mHTT相比野生型亨廷顿蛋白（wtHTT）在结构上拥有一段多余的谷氨酰胺重复序列[68]（PolyQ）。2019年，复旦大学鲁伯埙课题组在Nature发表研究成果，并首次提出ATTEC技术[69]。其作用机理类似于分子胶，能够同时结合LC3蛋白与mHTT，驱动mHTT进入自噬小体进行随后的降解。研究人员首先通过基于小分子微阵列（SMM）的高通量筛选，得到两个ATTEC小分子，即化合物20（KSP小分子抑制剂ispinesib，图7A）和化合物21（图7B）。结构分析发现，它们均含有一个芳环，并连接到卤素取代的芳基内酰胺双环。接着基于类似物筛选又得到另外两个ATTEC小分子，即化合物22（图7C）和化合物23（图7D）。这四种分子能够特异性识别mHTT中的PolyQ，而不与wtHTT相互作用。体外实验表明，这些ATTEC分子均能在50~100 nmol/L的浓度范围下有效降解HD小鼠原代皮层神经元中的mHTT，且不影响wtHTT。研究人员进一步考察了这些化合物在HD转基因果蝇和小鼠体内模型中的影响，证明了这些ATTEC分子能明显下调果蝇体内以及小鼠大脑皮层中mHTT的含量，并改善疾病相关的表型。该研究开创性地提出了一种新的靶向蛋白降解策略，首次使用小分子化合物参与自噬途径实现选择性降解，为polyQ相关疾病提供了有前景的治疗手段。
图 7 ATTEC 20~23的化学结构
2021年，四川大学欧阳亮课题组基于ATTEC设计思路，以化合物 21为LC3蛋白配体，BET经典抑制剂JQ1为BRD4配体，两者通过不同类型和长度的Linker相连，合成了一系列靶向BRD4的自噬降解剂。其中活性最优的化合物24（图8A）在多种癌细胞中均能诱导BRD4的有效降解，并发挥抗增殖作用。该研究成功利用ATTEC策略拓展了经典靶点BRD4的降解途径[70]。
图 8 化合物24~25的化学结构
基于相似的策略，笔者所在的课题组以ispinesib（化合物20，图7A）为LC3配体， NAMPT抑制剂MS2为靶蛋白配体，设计了一系列靶向烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的自噬降解剂。其中，活性最优的化合物25（图8B）在100 nmol/L浓度下可降解A2780细胞中90%的NAMPT，且化合物25对于A2780细胞的抑制活性（IC50=46 nmol/L）显著高于NAMPT抑制剂MS2（IC50=490 nmol/L），具有进一步研究的价值[71]。
脂肪液滴（LD）是普遍存在于细胞中的储脂结构，通过磷脂单分子膜将其中的脂类物质（如三酰甘油等）包裹。LD的异常积聚与多种疾病有关，如脂肪肝、神经退行性病变以及心血管疾病等。2021年，鲁伯埙课题组基于ATTEC策略设计了4种靶向LD的小分子化合物（化合物26~29，图9），它们以化合物21或化合物23作为LC3配体，通过Linker与LD配体苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ相连。生物实验表明，所有化合物在5 μmol/L下均能显著降低脂肪细胞内的LD含量。此外，通过腹腔注射化合物28和化合物29（30 mg/kg，每天1次），肥胖症小鼠模型（db/db小鼠，C57BL/6J - Leprdb/Leprdb）的体重在2周内显著降低约15%；给药结束后处死小鼠并取出肝脏，观察到小鼠血清和肝脏中的三酰甘油和总胆固醇含量显著降低。在CDAHFD诱导的非酒精性脂肪肝（NASH）小鼠模型的体内实验中也观察到与上述一致的结论。细胞内非蛋白致病底物一直以来都是极具挑战性的课题，该研究首次利用ATTEC策略靶向清除非蛋白物质并改善相关表型，丰富了靶向降解的应用范围[72]。
图 9 化合物26~29的化学结构
-
K63泛素化修饰是一种靶向自噬-溶酶体途径的特异信号，即底物蛋白与泛素K63位连接后，可被细胞内固有的自噬受体（p62/SQSTM1，简称p62）通过泛素相关结合域（UBA）选择性识别，p62再通过特定活性位点与LC3蛋白结合，进而诱导底物进入自噬小体，最后与溶酶体融合完成降解[73]。2019年，Arimoto课题组在一项关于抗菌自噬的研究中得到启发，证明了S-鸟苷化（S-guanylation）可以介导底物的K63泛素化和选择性自噬清除，并基于此提出AUTAC技术[74]。AUTAC由3部分构成：靶蛋白配体，作为降解标签的S-鸟嘌呤衍生物，以及将两者相连的Linker。该类分子通过靶蛋白配体与底物结合，降解标签进一步诱导靶蛋白发生K63泛素化，再被p62识别并基于ALP降解。
该研究共设计了4种AUTAC分子（化合物30~33，图10），其中化合物30~32分别靶向MetAP2、FKBP12和BRD4蛋白。Western blot结果显示，化合物30在1~100 μmol/L的浓度梯度下均可显著下调Hela细胞内MetAP2的水平；化合物 31在10 μmol/L浓度下能有效降解Hela细胞内FKBP12蛋白；值得注意的是，化合物32以相同方式处理Hela细胞后，在不同浓度下仅表现出微弱的降解作用，这可能与BRD4蛋白的核定位有关。
图 10 化合物30~33的化学结构
此外，AUTAC技术还可以用于靶向降解线粒体碎片等细胞器。唐氏综合征（DS）是一种遗传疾病，线粒体功能障碍是其核心致病因素。DS患者成纤维细胞（Detroit 532细胞）中线粒体形态比野生型成纤维细胞更加碎片化，且部分膜电位丢失。利用化合物33（10 μmol/L）处理Detroit 532细胞，可在24~72 h内诱导细胞内线粒体自噬，并观察到细胞线粒体形态和膜电位显著改善。
该研究为靶向蛋白降解领域增添了新的化学工具，给线粒体功能损伤相关疾病的治疗提供了新的思路。但该手段依赖泛素化过程，目前已报道的相关应用较少，普适性仍有待验证，且S-鸟嘌呤衍生物诱导K63泛素化的机制仍有待阐明，降解标签的类药性优化也颇具挑战性。
-
2022年，Yong课题组首次提出AUTOTAC技术[75]。AUTOTAC是一种异双功能分子，一端为p62配体，另一端为靶蛋白配体，两者通过Linker相连。具体作用机制如下：AUTOTAC与p62和靶蛋白同时结合，形成三元复合物，导致p62构象发生变化，产生自身寡聚并暴露出LC3（light-chain 3）结合域，进而与 LC3的结合，介导底物隔离至自噬小体并通过溶酶体途径降解。
研究人员首先筛选并优化得到了4个拥有p62高亲和力的分子：化合物34~37（图11A、11B、11C、11D）。接着，以这些分子的片段为p62配体，设计合成了多个AUTOTAC分子，即化合物38~40（图11E、11F、11G），分别用于靶向降解ERβ、AR和MetAP2。生物实验表明，化合物38能在HEK293T细胞中基于自噬溶酶体途径高效降解ERβ（DC50=1.48 nmol/L）；靶向AR的化合物39和靶向MetAP2的AUTOTAC 40分别能有效降解LNCaP前列腺癌细胞中的AR（DC50=211.08 nmol/L）或HEK293T细胞中的MetAP2（DC50 ≈ 0.70 μmol/L）。
图 11 化合物34~41的化学结构
此外，在神经退行性病变等蛋白质病中，错误折叠的蛋白质容易形成聚集体。Anle138b是一种处于临床研究阶段的可选择性结合蛋白聚集体的小分子药物，研究人员将p62配体与Anle138b通过聚乙二醇链相连得到了靶向蛋白聚集体的AUTOTAC分子（化合物41，图11H），其在10 nmol/L下能高效降解SHSY5Y细胞中的P301L tau突变体（DC50=3 nmol/L）。
该研究首次通过靶向自噬受体实现了对多种单体蛋白及致病蛋白聚集体的清除，不依赖泛素化过程，为基础研究和药物开发提供了一项选择性自噬降解蛋白的技术。
-
靶向蛋白降解技术利用真核细胞内固有的两大蛋白降解系统——泛素-蛋白酶体系统（UPS）和溶酶体途径，实现了多种疾病相关蛋白的靶向降解，正引领着下一代小分子药物的发展方向。目前已经有多个PROTAC分子或分子胶在临床试验中取得了积极的结果，但大部分的靶向蛋白降解技术尚处于研究的早期阶段，并面临着诸多挑战。例如：①大部分异双功能降解剂分子量较大，相比传统药物透膜性和口服生物利用度较差，难以实现临床转化；②某些基于多肽和寡核苷酸的降解剂面临着储存、递送和体内代谢稳定性的难题；③多数蛋白降解技术的机制研究尚不完善，例如LC3配体与蛋白如何作用、S-鸟苷化如何诱导底物K63泛素化等问题仍有待研究；④基于溶酶体途径的降解策略普遍活性有限，活性提升难度较大，已报道的体内研究较少，普适性有待验证。
近年来，研究人员围绕上述问题积极探索，开发了多维度的靶向蛋白降解技术，例如：①基于点击化学提出的CLIPTAC以小分子形式被细胞摄取，进入细胞后通过点击反应形成活性PROTAC分子发挥作用，有望提高药物的水溶性及细胞渗透性[76]；②靶向递送策略，包括抗体偶联蛋白降解剂[77]、光控PROTAC（如pc-PROTAC[78]和photoPROTAC[79]）等对降低毒副作用，提高药物靶向性具有深远意义。下一阶段，科研人员一方面需要不断开发新的降解技术，挑战更多“难成药”靶点，另一方面，应持续优化现有降解技术，包括扩展E3连接酶的选择并进行合理的PROTAC设计，完善选择性自噬降解机制的研究，提高蛋白降解剂的成药性并实现临床转化。
Advances and prospects in targeted protein degradation
-
摘要: 靶向蛋白降解技术（TPD）通过调动细胞内固有的两大蛋白降解机制——泛素-蛋白酶体系统（UPS）或溶酶体途径下调致病靶蛋白，有望克服传统抑制剂的局限性，挑战“难成药”靶点，为药物开发提供新的靶向治疗手段。重点关注多种有前景的靶向蛋白降解技术，包括蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）、分子胶、溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）、自噬体绑定化合物（ATTEC）、自噬靶向嵌合体AUTAC和AUTOTAC，分析代表性的案例及其潜在的应用与挑战。Abstract: Targeted protein degradation (TPD) techniques eliminate pathogenic proteins by hijacking the intracellular proteolysis machinery which includes the ubiquitin-proteasome system (UPS) and the lysosomal degradation pathway, holding promise to overcome the limitations of traditional inhibitors and further broaden the target space including many “undruggable” targets, and provide new targeted treatments for drug discovery. In this review, recent advances in a variety of promising TPD strategies were summarized, such as proteolysis targeting chimera (PROTAC), molecular glue, lysosome-targeting chimaera (LYTAC), autophagosome-tethering compound (ATTEC), autophagy-targeting chimera AUTAC and AUTOTAC, particularly. The representative case studies, potential applications and challenges were analyzed.
-
中药红花（Carthami Flos）是菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，传统本草学著作《本草纲目》记载，红花具有活血散瘀，通经止痛的功效[1]，其药材和制剂在临床上被广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。现代药理研究表明，其主要药效物质是以羟基红花黄色素A（hydroxysafflower yellow A，HSYA）为代表的查尔酮类化合物和以菸花苷为代表的黄酮醇类化合物，这些化合物均具有良好的心脑血管损伤保护活性[2-3]。红花药材的产量偏低，每平方千米产量仅为18.0～22.5 t[4]，其中特有的HSYA[5]、红花红色素等查尔酮类成分在不同品种间差异较大[6]。由于红花中的查尔酮类成分仅特异性地存在于花冠中[7]，加之体外组织培养再生率低[8]等原因，对其功能基因的研究工作一直进展缓慢。特别是对于HSYA等红花特有的有效成分，其生物合成相关的功能基因尚不完全清楚，合成通路也未被完全解析[9]。因此，用现代分子生物学技术手段以提高药效物质的含量，是提高红花品质，节约土地资源、降低制药成本的一条新途径。
短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductases，SDR）在植物次生代谢物的生物合成中广泛参与各类碳-氧双键，碳-碳双键以及烯酮键的氧化还原催化反应。根据SDRs基因序列的特征结构，SDRs超家族可以被分为5个亚家族[10-14]。最早发现并且进行鉴定的两类主要短链还原酶命名为classical和extend，classical类的SDRs基因拥有长度约为250个氨基酸残基，被称为Extended类的SDRs基因在碳基末端因其含有多余的约100个氨基酸残基而得名。另外3种类型SDRs基因分别被命名为intermediate、complex和divergent。这些类型的SDRs基因基于其结合辅酶类型和结合催化位点的不同进行命名分类。此外，SDRs存在与传统类型不同的含有“rossmann-fold”保守结构域的氧化还原酶结构[15-18]。
黄酮类化合物起源于莽草酸途径和苯丙素生物合成途径，1个香豆酰辅酶A（coumaroyl CoA）和3个丙二酰辅酶A（malonyl CoA）在查尔酮合酶的作用下生成二氢查尔酮，然后经查尔酮异构酶催化为二氢黄酮，进一步在各类还原酶，聚合酶和糖基转移酶的作用下，生成终端次生代谢产物组合[19-21]。红花中所含的主要有效成分HSYA具有查尔酮式结构，本课题组前期研究认为：HSYA从前体物质到合成，中间存在必不可少的氧化还原过程。短链脱氢还原酶家族广泛参与植物体内次生代谢，这一类还原酶都带有相似的折叠结构以及催化位点，已有研究表明，其对苯丙烷代谢途径起重要作用[22-23]，但有关红花中还原酶基因相关报道较少[24]。故笔者通过对红花转录组数据库、基因表达谱数据库以及代谢组数据库进行分析，筛选在HSYA生物合成途径的关键还原酶基因，并进行功能验证，以期揭示红花次生代谢成分生物合成途径，为定向调控红花的品质提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
云南巍山红花品系（ZHH0119），采自海军军医大学药学系温室，经海军军医大学郭美丽教授鉴定为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）。红花种植条件：温度恒定25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。采集相关花与组织后迅速存放于液氮或者−80 ℃冰箱中冷冻。
1.2 RNA提取及cDNA第一链合成
按照Trans ZOL Plant植物总RNA提取试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法提取红花花冠总RNA，按照Transtart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix逆转录试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法进行cDNA第一链的合成。cDNA于−20 ℃保存。
1.3 基因筛选
基于数据库中的基因注释以“黄酮还原酶”和“黄酮类化合物生物合成”作为关键词进行检索，筛选出其中可能与HSYA生物合成相关的还原酶基因，将筛选基因不同花期时间的表达量，将其与红花代谢组数据库中同花期的芦丁（rutin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、HSYA、柚皮素（naringenin）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（kaempferol-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-gluciside）、Carthamin、芹菜素（apigenin）、黄芩素（scutellarein）、木犀草素（luteolin）、苯丙氨酸（D-phenylalanine） 12个主要成分的含量[12,25]进行皮尔森相关性分析。
1.4 全长克隆及生物信息学分析
基于红花花冠EST转录组文库，结合第三代测序技术[26-29]红花花冠全长转录组数据库筛选得到目的基因序列。在其5'端、3'端分别设计特异性引物。按照2× Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）高保真酶（南京诺唯赞公司，中国）说明书进行PCR扩增，扩增片段经EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书操作回收后，连接于pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金公司，中国）载体上，转化至大肠杆菌T1感受态细胞（北京全式金公司，中国）后，涂布在LBA平板上，恒温培养37 ℃过夜，挑取阳性单克隆菌落[30-31]，送至上海生工生物有限公司进行菌液测序。
用ExPASyProtParam工具（http://web.expasy.org/compute/）对目的基因的理论等电点（pI），蛋白分子量（MW）和蛋白分子式进行预测。通过Simple Molecule Architecture Research Tool工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对目的基因编码的蛋白质结构功能域进行分析。使用ProtScale（http://us.Expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）以及TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质的亲/疏水性和跨膜区域做出预测。使用SignaIP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测目的蛋白是否含有信号肽。使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对筛选出的SDRs基因进行BLAST序列比对。通过Neighbor-Joining相邻节点法构建系统发育进化树，自展分析法进行1000次重复[32-34]。使用PBILYON-GRLAND数据库预测构建蛋白质二级结构模型。蛋白三级结构由Protein Homology/analogy Recognition Engine预测。用WOLFPSORT软件（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测。
1.5 目的基因表达模式分析
取盛花期新鲜红花根、茎、叶、花冠4个部位的新鲜组织和花期Ⅰ（开花前3 d）、花期Ⅱ（开花当天）、花期Ⅲ（开花后1 d）、花期Ⅳ（开花后3 d）4个花期的新鲜花冠，提取总RNA，合成cDNA第一链后，在靠近5'端处对各个基因设计引物，依据Transtart Top Green qPCR super Mix（北京全式金公司，中国）试剂盒推荐体系，以Ct60s（KJ634810）作为内参标记基因，进行qRT-PCR实验，结果使用2−ΔΔCt的方法进行计算分析[35]。
1.6 植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
根据CtSDR3的开放阅读框和植物真核表达载体pMT-39序列信息，设计无缝克隆引物。以红花cDNA做模板，使用高保真酶进行PCR反应。产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经NcoI酶切线性化的pMT-39载体进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性克隆菌株扩大培养后抽提质粒，提取的pMT39-CtSDR3质粒用冷冻法转至农杆菌GV3101中。LBK+Rif平板筛选阳性克隆后，取1ml OD600 = 0.8的菌液经6 000 r/min，离心3 min后用1 ml 5%蔗糖溶液重悬，加入Silwet-L 1μl，用注射器注射于红花花柱，套袋避光[35]。
在pMT-39的35 s启动子区域设计5'端特异性引物，在目的基因CtSDR3中设计3'端引物。取T2代新鲜叶cDNA第一链作为模板，2× Easy Taq PCR Mix（北京全式金，中国）推荐体系进行PCR反应，确定是否存在目的条带。采集CtSDR3阳性植株花冠以及pMT-39空载体对照植株的花冠，按照上述的qRT-PCR反应体系评价CtSDR3基因的过表达水平，使用UPLC-Q-TOF/MS 检测CtSDR3过表达组和空载体对照组的黄酮代谢物含量，选择以HSYA为代表性成分的8个黄酮类化合物作为检测对象。
1.7 原核表达载体构建及蛋白表达
根据CtSDR3的开放阅读框及蛋白表达载体pGEX-6p-1以及pET-28a序列信息，设计同源重组克隆引物[34]。以红花花冠cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR反应。PCR产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经XhoI、BamHI酶切线性化的载体pGEX-6p-1以及pET-28a进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性菌株克隆扩大培养后抽提质粒，提取的重组质粒用热激法转至大肠杆菌Rosseta（DE3）（上海唯地生物，中国）中。
在20 ml LBA液体培养基中培养至OD600为0.6左右，分2份10 ml菌液各加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG和生理盐水。恒温培养箱中16 ℃，100 r/min继续培养16 h[35-36]。菌液离心弃上清液，用1×PBS缓冲液洗涤两次后重悬。超声破碎仪中40 kW，工作时间5 s，循环间隔时间25 s，共15个循环进行破碎[16]，裂解完成后取上清与沉淀15 μl，上样检测。
2. 结果
2.1 基因筛选
通过分析，得到contig325、contig483、contig2863共3个与HSYA具有强相关性的基因（r>0.85），见图1。
2.2 全长克隆和生物信息学分析
3个目的基因序列信息经测序验证结果如下：contig325全长共1523 bp，开放阅读框1341bp，编码446个氨基酸；contig483全长1393 bp，开放阅读框792 bp，编码263个氨基酸；contig2863全长序列1527 bp，开放阅读框1023 bp，编码340个氨基酸。PCR产物电泳结果如图2所示。
contig325基因编码446个氨基酸，命名为CtSDR1（GenBank登录号：MW792035）；Contig483基因编码263个氨基酸，命名为CtSDR2（GenBank登录号：MW792036）；Contig2863基因编码339个氨基酸，命名为CtSDR3（GenBank登录号：MW792037）。系统进化树表明CtSDR1与蓟Cirsium japonicum (QQH14901.1)同源性最高；CtSDR2与小蓬草Erigeron canadensis (XP_043636506.1)同源性最高；CtSDR3与小豆蔻Cynara cardunculus var. scolymus (KVI09206.1)同源性最高。Prot-param分析CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C2230H3346N606O639S7，相对分子量为49.2×103，理论等电点pI=9.61；CtSDR2基因所编码的蛋白质分子式C1289H2072N360O379S13，相对分子量为29×103，理论等电点pI=8.63；CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C1691H2614N442O481S9，相对分子量为37.1×103，理论等电点pI=6.80。Prot Scale分析预测CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白为亲水性蛋白，无信号肽属非分泌蛋白。蛋白跨膜性分析显示CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3不含有跨膜区域，为非跨膜蛋白。对CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白二级结构的预测显示均属于不规则结构。对CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3蛋白质三维结构预测如图3所示。系统进化树如图4所示。亚细胞定位预测显示，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3均可能定位于细胞质。
2.3 目的基因表达模式分析
取红花花期的Ⅳ期的红花各个部位进行分析，发现红花花冠内的CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3基因表达量从高到低依次均为花冠>叶>茎>根。其中CtSDR1在花冠中的相对表达量约为根中的3倍、而CtSDR2、CtSDR3在花冠中的相对表达量约为根中的4倍。将4个花期的红花花冠进行qRT-PCR分析表明，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3花冠中表达量均随着花冠发育逐渐升高，特别是CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3的Ⅳ期花冠对比Ⅲ期花冠的表达量分别提高了7.2倍、2.7倍、2.3倍（图5）。
2.4 CtSDR3植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
构建真和表达载体并通过PCR鉴定后，我们从19株农杆菌浸染的子代植株中得到5株pMT39-CtSDR3阳性红花植株（图6）。通过qPCR对其CtSDR3基因转录水平进行测定，结果发现阳性红花植株中CtSDR3基因的转录水平得到显著增加，约为空白组株系的2～3倍，CtSDR3的在花冠部位的高表达也证明了研究成功获取CtSDR3过表达红花植株（图7）。通过UPLC-QTOF/MS技术测定阳性转基因红花株系组和空白对照组的目标化合物含量，包括7个红花花冠主要黄酮类化合物及苯丙烷类代谢途径上游关键物质苯丙氨酸（图8），分别为：野黄芩素（scutellarein）、Carthamin、HSYA、山柰酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucoside）、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（kaempferol-3-O-β-rutinoside）、芦丁（rutin）和苯丙氨酸（D-Phenylalanine）。由图8可知，与空白组相比，CtSDR3过表达株系相较于空白组野黄芩素提高了3.6%～9.8%，HSYA提高了7.1%～16.6%，以及苯丙氨酸含量提高了5.5%～15.7%，具有显著性升高。其他化合物含量则有无显著性变化趋势。通过对过表达株系与空白组的含量分析，我们认为CtSDR3基因过表达会引起红花中黄酮类物质的变化，尤其是HSYA含量升高显著。同时，苯丙氨酸代谢途径属于植物重要的次生代谢途径，过表达组引起苯丙氨酸含量的显著上升，上述指标性成分的变化也进一步说明CtSDR3对红花黄酮类化合物次生代谢途径具有一定的影响，但目前我们尚难以判断CtSDR3红花中影响次生代谢产物积累的明确途径。
图 6 真核表达载体构建及阳性鉴定电泳图注：1. CtSDR3基因开放阅读框（ORF）区扩增产物电泳图，a、b泳道均为CtSDR3基因ORF区克隆PCR产物；2. 真核表达载体pMT-39载体酶切产物电泳图，a、b泳道为CtSDR3 PCR产物，c泳道为pMT-39载体，d、e泳道为pMT-39线性化载体；3. pMT39-CtSDR3重组载体阳性转化子鉴定电泳图，a、b泳道为阳性转化子菌液PCR产物；4. pMT39-CtSDR3质粒转化农杆菌GV3101，a、c和e泳道为空白对照组，b、d和f泳道为阳性克隆菌液PCR产物；5. 红花pMT39-CtSDR3阳性转化植株鉴定PCR产物电泳图，1～19为待鉴定植株，p为pMT39-CtSDR3质粒，k为空白组，WT为野生型红花植株
图 8 阳性植株黄酮类化合物含量测定注：A.黄芩素；B.Carthamin；C.HSYA；D.山柰酚；E.山柰酚-3-O-葡萄糖苷；F.山柰酚-3-O-芸香糖苷；G.芦丁；H.苯丙氨酸；CK.空白组株系；OVX.阳性过表达株系2.5 原核表达载体构建及蛋白表达
目的片段成功扩增，将目的条带进行胶回收、纯化。CtSDR1、CtSDR1、CtSDR1构建的pGEX-6p-1、pET-28a原核表达载体均有在大肠杆菌内表达，但是CtSDR1-pGEX-6p-1、 CtSDR2-pGEX-6p-1、CtSDR3-pGEX-6p-1、CtSDR1-pET-28、CtSDR2-pET-28a、CtSDR3-pET-28a表达的目的蛋白均形成包涵体，存在于沉淀中。无法进行下一步大量纯化实验，唯有CtSDR2-pGEX-6p-1诱导表达了存在于上清液的目的蛋白，明显可以在上清液中观察到分子量约为50 000的蛋白条带（图9）。
图 9 目的片段PCR产物电泳及表达蛋白电泳分析注：A.目的片段PCR产物电泳：1～5为CtSDR1，6～10为CtSDR2，11～15为CtSDR3（其对应的PCR反应Tm值分别为67 ℃、65 ℃、63 ℃、59 ℃、57 ℃）；B.pGEX-6p-1蛋白表达电泳分析；C.pET-28a蛋白表达电泳分析3. 讨论
越来越多的红花药理学相关研究表明，红花的主要药效物质包括查尔酮类、黄酮醇类等多种黄酮类化合物，其中，查尔酮类HSYA对脑缺血具有保护作用，并且还能抗脑血栓形成以及抗氧化等。研究HSYA的生物合成分途径，对于HSYA的工业化生产具有重要意义。
本研究借助生物学分子技术、结合代谢组分析测定，筛选出3个参与HSYA生物合成途径的关键短链脱氢还原酶基因CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3，这3个基因序列具有高度保守性，在不同器官的表达模式均呈现出花冠>叶>茎>根的特点，而且在花冠中的表达量随花冠发育逐渐升高，表明其很有可能参与红花中HSYA等主要药用成分的积累。进一步研究发现，转CtSDR3过表达T2代阳性植株花冠中CtSDR3基因的转录水平增加了2~3倍，次生代谢物HSYA的含量提高了7.1%～16.6%（P<0.05），验证了我们对CtSDR3在红花体内参与黄酮类化合物生物合成功能的推测。本研究中，体外表达CtSDR3蛋白，得到目的蛋白条带，但由于包涵体等原因，蛋白表达和纯化条件仍需要进一步摸索。下一步，我们将对可能起黄酮类生物合成途径的关键SDRs进行深入的生物学特性特别是酶结合位点的研究，为更好地阐释SDRs的生物学功能、利用分子生物育种技术培育高HSYA含量的红花新品种奠定基础。
-
[1] FERGUSON F M, GRAY N S. Kinase inhibitors: the road ahead[J]. Nat Rev Drug Discov,2018,17(5):353-377. doi: 10.1038/nrd.2018.21 [2] HARMSEN S, KOK R J. Kinase inhibitor conjugates[J]. Curr Pharm Des,2012,18(20):2891-2900. doi: 10.2174/138161212800672778 [3] FISCHER P M. Approved and experimental small-molecule oncology kinase inhibitor drugs: a mid-2016 overview[J]. Med Res Rev,2017,37(2):314-367. doi: 10.1002/med.21409 [4] OZVEGY-LACZKA C, CSEREPES J, ELKIND N B, et al. Tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer: role of ABC multidrug transporters[J]. Drug Resist Updat,2005,8(1-2):15-26. doi: 10.1016/j.drup.2005.02.002 [5] BABINA I S, TURNER N C. Advances and challenges in targeting FGFR signalling in cancer[J]. Nat Rev Cancer,2017,17(5):318-332. doi: 10.1038/nrc.2017.8 [6] DONG L J, LEI D, ZHANG H J. Clinical strategies for acquired epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor resistance in non-small-cell lung cancer patients[J]. Oncotarget,2017,8(38):64600-64606. doi: 10.18632/oncotarget.19925 [7] CROMM P M, CREWS C M. The proteasome in modern drug discovery: second life of a highly valuable drug target[J]. ACS Cent Sci,2017,3(8):830-838. doi: 10.1021/acscentsci.7b00252 [8] HERSHKO A, CIECHANOVER A. The ubiquitin system[J]. Annu Rev Biochem,1998,67:425-479. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.425 [9] PICKART C M. Mechanisms underlying ubiquitination[J]. Annu Rev Biochem,2001,70:503-533. doi: 10.1146/annurev.biochem.70.1.503 [10] WATTS C. The endosome-lysosome pathway and information generation in the immune system[J]. Biochim Biophys Acta,2012,1824(1):14-21. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.07.006 [11] MIZUSHIMA N, KOMATSU M. Autophagy: renovation of cells and tissues[J]. Cell,2011,147(4):728-741. doi: 10.1016/j.cell.2011.10.026 [12] MIZUSHIMA N, LEVINE B, CUERVO A M, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature,2008,451(7182):1069-1075. doi: 10.1038/nature06639 [13] SAKAMOTO K M, KIM K B, KUMAGAI A, et al. Protacs: Chimeric molecules that target proteins to the Skp1–Cullin–F box complex for ubiquitination and degradation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(15):8554-8559. doi: 10.1073/pnas.141230798 [14] HU J T, HU B, WANG M L, et al. Discovery of ERD-308 as a highly potent proteolysis targeting Chimera (PROTAC) degrader of estrogen receptor (ER)[J]. J Med Chem,2019,62(3):1420-1442. doi: 10.1021/acs.jmedchem.8b01572 [15] SALAMI J, ALABI S, WILLARD R R, et al. Androgen receptor degradation by the proteolysis-targeting chimera ARCC-4 outperforms enzalutamide in cellular models of prostate cancer drug resistance[J]. Commun Biol,2018,1:100. doi: 10.1038/s42003-018-0105-8 [16] HAN X, WANG C, QIN C, et al. Discovery of ARD-69 as a highly potent proteolysis targeting Chimera (PROTAC) degrader of androgen receptor (AR) for the treatment of prostate cancer[J]. J Med Chem,2019,62(2):941-964. doi: 10.1021/acs.jmedchem.8b01631 [17] ZHAO L J, HAN X, LU J F, et al. A highly potent PROTAC androgen receptor (AR) degrader ARD-61 effectively inhibits AR-positive breast cancer cell growth in vitro and tumor growth in vivo[J]. Neoplasia,2020,22(10):522-532. doi: 10.1016/j.neo.2020.07.002 [18] HAN X, ZHAO L J, XIANG W G, et al. Discovery of highly potent and efficient PROTAC degraders of androgen receptor (AR) by employing weak binding affinity VHL E3 ligase ligands[J]. J Med Chem,2019,62(24):11218-11231. doi: 10.1021/acs.jmedchem.9b01393 [19] HAN X, ZHAO L J, XIANG W G, et al. Strategies toward discovery of potent and orally bioavailable proteolysis targeting Chimera degraders of androgen receptor for the treatment of prostate cancer[J]. J Med Chem,2021,64(17):12831-12854. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c00882 [20] MATSUMOTO A. Faculty opinions recommendation of discovery of ARD-2585 as an exceptionally potent and orally active PROTAC degrader of androgen receptor for the treatment of advanced prostate cancer[J]. J Med Chem,2021,64(18):13487-13509. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c00900 [21] TAKWALE A D, JO S H, JEON Y U, et al. Design and characterization of cereblon-mediated androgen receptor proteolysis-targeting chimeras[J]. Eur J Med Chem,2020,208:112769. doi: 10.1016/j.ejmech.2020.112769 [22] CHEN L R, HAN L Q, MAO S J, et al. Discovery of A031 as effective proteolysis targeting chimera (PROTAC) androgen receptor (AR) degrader for the treatment of prostate cancer[J]. Eur J Med Chem,2021,216:113307. doi: 10.1016/j.ejmech.2021.113307 [23] KIM G Y, SONG C W, YANG Y S, et al. Chemical degradation of androgen receptor (AR) using bicalutamide analog–thalidomide PROTACs[J]. Molecules,2021,26(9):2525. doi: 10.3390/molecules26092525 [24] SCOTT D E, ROONEY T P C, BAYLE E D, et al. Systematic investigation of the permeability of androgen receptor PROTACs[J]. ACS Med Chem Lett,2020,11(8):1539-1547. doi: 10.1021/acsmedchemlett.0c00194 [25] LEE G T, NAGAYA N, DESANTIS J, et al. Effects of MTX-23, a novel PROTAC of androgen receptor splice variant-7 and androgen receptor, on CRPC resistant to second-line antiandrogen therapy[J]. Mol Cancer Ther,2021,20(3):490-499. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-20-0417 [26] LIANG J J, XIE H, YANG R H, et al. Designed, synthesized and biological evaluation of proteolysis targeting chimeras (PROTACs) as AR degraders for prostate cancer treatment[J]. Bioorg Med Chem,2021,45:116331. doi: 10.1016/j.bmc.2021.116331 [27] BHUMIREDDY A, BANDARU N V M R, RAGHURAMI REDDY B, et al. Design, synthesis, and biological evaluation of phenyl thiazole-based AR-V7 degraders[J]. Bioorg Med Chem Lett,2022,55:128448. doi: 10.1016/j.bmcl.2021.128448 [28] ZHAO B S, BURGESS K. PROTACs suppression of CDK4/6, crucial kinases for cell cycle regulation in cancer[J]. Chem Commun (Camb),2019,55(18):2704-2707. doi: 10.1039/C9CC00163H [29] JIANG B S, WANG E S, DONOVAN K A, et al. Development of dual and selective degraders of cyclin-dependent kinases 4 and 6[J]. Angew Chem Int Ed Engl,2019,58(19):6321-6326. doi: 10.1002/anie.201901336 [30] ROBB C M, CONTRERAS J I, KOUR S, et al. Chemically induced degradation of CDK9 by a proteolysis targeting chimera (PROTAC)[J]. Chem Commun (Camb),2017,53(54):7577-7580. doi: 10.1039/C7CC03879H [31] OLSON C M, JIANG B S, ERB M A, et al. Pharmacological perturbation of CDK9 using selective CDK9 inhibition or degradation[J]. Nat Chem Biol,2018,14(2):163-170. doi: 10.1038/nchembio.2538 [32] BIAN J L, REN J, LI Y R, et al. Discovery of Wogonin-based PROTACs against CDK9 and capable of achieving antitumor activity[J]. Bioorg Chem,2018,81:373-381. doi: 10.1016/j.bioorg.2018.08.028 [33] POWELL C E, GAO Y, TAN L, et al. Chemically induced degradation of anaplastic lymphoma kinase (ALK)[J]. J Med Chem,2018,61(9):4249-4255. doi: 10.1021/acs.jmedchem.7b01655 [34] ZHANG C W, HAN X R, YANG X B, et al. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) of anaplastic lymphoma kinase (ALK)[J]. Eur J Med Chem,2018,151:304-314. doi: 10.1016/j.ejmech.2018.03.071 [35] WINTER GEORG E, BUCKLEY DENNIS L, JOSHIAWA P, et al. DRUG DEVELOPMENT. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation[J]. Science,2015,348(6241):1376-1381. doi: 10.1126/science.aab1433 [36] RAINA K, LU J, QIAN Y M, et al. PROTAC-induced BET protein degradation as a therapy for castration-resistant prostate cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2016,113(26):7124-7129. doi: 10.1073/pnas.1521738113 [37] BAI L C, ZHOU B, YANG C Y, et al. Targeted degradation of BET proteins in triple-negative breast cancer[J]. Cancer Res,2017,77(9):2476-2487. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-16-2622 [38] ZENGERLE M, CHAN K H, CIULLI A. Selective small molecule induced degradation of the BET bromodomain protein BRD4[J]. ACS Chem Biol,2015,10(8):1770-1777. doi: 10.1021/acschembio.5b00216 [39] ZHOU B, HU J T, XU F M, et al. Discovery of a small-molecule degrader of bromodomain and extra-terminal (BET) proteins with picomolar cellular potencies and capable of achieving tumor regression[J]. J Med Chem,2018,61(2):462-481. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01816 [40] QIN C, HU Y, ZHOU B, et al. Discovery of QCA570 as an exceptionally potent and efficacious proteolysis targeting Chimera (PROTAC) degrader of the bromodomain and extra-terminal (BET) proteins capable of inducing complete and durable tumor regression[J]. J Med Chem,2018,61(15):6685-6704. doi: 10.1021/acs.jmedchem.8b00506 [41] YANG K, SONG Y L, XIE H B, et al. Development of the first small molecule histone deacetylase 6 (HDAC6) degraders[J]. Bioorg Med Chem Lett,2018,28(14):2493-2497. doi: 10.1016/j.bmcl.2018.05.057 [42] WU H, YANG K, ZHANG Z R, et al. Development of multifunctional histone deacetylase 6 degraders with potent antimyeloma activity[J]. J Med Chem,2019,62(15):7042-7057. doi: 10.1021/acs.jmedchem.9b00516 [43] AN Z X, LV W X, SU S, et al. Correction to: developing potent PROTACs tools for selective degradation of HDAC6 protein[J]. Protein Cell,2019,10(11):854-855. doi: 10.1007/s13238-019-0613-4 [44] SCHIEDEL M, HERP D, HAMMELMANN S, et al. Chemically induced degradation of sirtuin 2 (Sirt2) by a proteolysis targeting Chimera (PROTAC) based on sirtuin rearranging ligands (SirReals)[J]. J Med Chem,2018,61(2):482-491. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01872 [45] HONG J Y, JING H, PRICE I R, et al. Simultaneous inhibition of SIRT2 deacetylase and defatty-acylase activities via a PROTAC strategy[J]. ACS Med Chem Lett,2020,11(11):2305-2311. doi: 10.1021/acsmedchemlett.0c00423 [46] LEE H, PUPPALA D, CHOI E Y, et al. Targeted degradation of the aryl hydrocarbon receptor by the PROTAC approach: a useful chemical genetic tool[J]. ChemBioChem,2007,8(17):2058-2062. doi: 10.1002/cbic.200700438 [47] CHU T T, GAO N, LI Q Q, et al. Specific knockdown of endogenous tau protein by peptide-directed ubiquitin-proteasome degradation[J]. Cell Chem Biol,2016,23(4):453-461. doi: 10.1016/j.chembiol.2016.02.016 [48] LU M C, LIU T, JIAO Q, et al. Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway[J]. Eur J Med Chem,2018,146:251-259. doi: 10.1016/j.ejmech.2018.01.063 [49] WANG W J, ZHOU Q Z, JIANG T, et al. A novel small-molecule PROTAC selectively promotes tau clearance to improve cognitive functions in Alzheimer-like models[J]. Theranostics,2021,11(11):5279-5295. doi: 10.7150/thno.55680 [50] BUCKLEY D L, RAINA K, DARRICARRERE N, et al. HaloPROTACS: use of small molecule PROTACs to induce degradation of HaloTag fusion proteins[J]. ACS Chem Biol,2015,10(8):1831-1837. doi: 10.1021/acschembio.5b00442 [51] SCHAPIRA M, CALABRESE M F, BULLOCK A N, et al. Targeted protein degradation: expanding the toolbox[J]. Nat Rev Drug Discov,2019,18(12):949-963. doi: 10.1038/s41573-019-0047-y [52] LU J, QIAN Y M, ALTIERI M, et al. Hijacking the E3 ubiquitin ligase cereblon to efficiently target BRD4[J]. Chem Biol,2015,22(6):755-763. doi: 10.1016/j.chembiol.2015.05.009 [53] HE M, CAO C G, NI Z H, et al. PROTACs: great opportunities for academia and industry (an update from 2020 to 2021)[J]. Signal Transduct Target Ther,2022,7(1):181. doi: 10.1038/s41392-022-00999-9 [54] SUN X Y, GAO H Y, YANG Y Q, et al. PROTACs: great opportunities for academia and industry[J]. Signal Transduct Target Ther,2019,4:64. doi: 10.1038/s41392-019-0101-6 [55] PETRYLAK D P, GAO X, VOGELZANG N J, et al. First-in-human phase I study of ARV-110, an androgen receptor (AR) PROTAC degrader in patients (pts) with metastatic castrate-resistant prostate cancer (mCRPC) following enzalutamide (ENZ) and/or abiraterone (ABI).[J]. J Clin Oncol,2020,38:3500. doi: 10.1200/JCO.2020.38.15_suppl.3500 [56] FLANAGAN J J, QIAN Y, GOUGH S M, et al. ARV-471, an oral estrogen receptor PROTAC degrader for breast cancer[J]. Cancer Research, 2019, 79(4): P5-04-18. [57] DONG G Q, DING Y, HE S P, et al. Molecular glues for targeted protein degradation: from serendipity to rational discovery[J]. J Med Chem,2021,64(15):10606-10620. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c00895 [58] KRÖNKE J, UDESHI N D, NARLA A, et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells[J]. Science,2014,343(6168):301-305. doi: 10.1126/science.1244851 [59] KRÖNKE J, FINK E C, HOLLENBACH P W, et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1α in del(5q) MDS[J]. Nature,2015,523(7559):183-188. doi: 10.1038/nature14610 [60] OZAWA Y, KUSANO K, OWA T, et al. Therapeutic potential and molecular mechanism of a novel sulfonamide anticancer drug, indisulam (E7070) in combination with CPT-11 for cancer treatment[J]. Cancer Chemother Pharmacol,2012,69(5):1353-1362. doi: 10.1007/s00280-012-1844-8 [61] HAN T, GORALSKI M, GASKILL N, et al. Anticancer sulfonamides target splicing by inducing RBM39 degradation via recruitment to DCAF15[J]. Science, 2017, 356(6336): 7977. [62] BUSSIERE D E, XIE L L, SRINIVAS H, et al. Structural basis of indisulam-mediated RBM39 recruitment to DCAF15 E3 ligase complex[J]. Nat Chem Biol,2020,16(1):15-23. doi: 10.1038/s41589-019-0411-6 [63] UHLEN M, FAGERBERG L, HALLSTROM B M, et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome[J]. Science,2015,347(6220):1260419. doi: 10.1126/science.1260419 [64] BROWN K J, SEOL H, PILLAI D K, et al. The human secretome atlas initiative: implications in health and disease conditions[J]. Biochim Biophys Acta BBA Proteins Proteom,2013,1834(11):2454-2461. doi: 10.1016/j.bbapap.2013.04.007 [65] BANIK S M, PEDRAM K, WISNOVSKY S, et al. Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins[J]. Nature,2020,584(7820):291-297. doi: 10.1038/s41586-020-2545-9 [66] AHN G, BANIK S M, MILLER C L, et al. LYTACs that engage the asialoglycoprotein receptor for targeted protein degradation[J]. Nat Chem Biol,2021,17(9):937-946. doi: 10.1038/s41589-021-00770-1 [67] RAMADAS B, KUMAR PAIN P, MANNA D. LYTACs: an emerging tool for the degradation of non-cytosolic proteins[J]. ChemMedChem,2021,16(19):2951-2953. doi: 10.1002/cmdc.202100393 [68] SCHERZINGER E, LURZ R, TURMAINE M, et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo[J]. Cell,1997,90(3):549-558. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80514-0 [69] LI Z Y, WANG C, WANG Z Y, et al. Allele-selective lowering of mutant HTT protein by HTT–LC3 linker compounds[J]. Nature,2019,575(7781):203-209. doi: 10.1038/s41586-019-1722-1 [70] PEI J P, PAN X L, WANG A X, et al. Developing potent LC3-targeting AUTAC tools for protein degradation with selective autophagy[J]. Chem Commun (Camb),2021,57(97):13194-13197. doi: 10.1039/D1CC04661F [71] DONG G Q, WU Y, CHENG J F, et al. Ispinesib as an effective warhead for the design of autophagosome-tethering chimeras: discovery of potent degraders of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT)[J]. J Med Chem,2022,65(11):7619-7628. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c02001 [72] FU Y H, CHEN N X, WANG Z Y, et al. Degradation of lipid droplets by chimeric autophagy-tethering compounds[J]. Cell Res,2021,31(9):965-979. doi: 10.1038/s41422-021-00532-7 [73] ANDING A L, BAEHRECKE E H. Cleaning House: Selective Autophagy of Organelles[J]. Dev Cell,2017,41(1):10-22. doi: 10.1016/j.devcel.2017.02.016 [74] TAKAHASHI D, MORIYAMA J, NAKAMURA T, et al. AUTACs: cargo-specific degraders using selective autophagy[J]. Mol Cell,2019,76(5):797-810. doi: 10.1016/j.molcel.2019.09.009 [75] JI C H, KIM H Y, LEE M J, et al. Author Correction: the AUTOTAC chemical biology platform for targeted protein degradation via the autophagy-lysosome system[J]. Nat Commun,2022,13:2108. doi: 10.1038/s41467-022-29845-w [76] LEBRAUD H, WRIGHT D J, JOHNSON C N, et al. Protein degradation by In-cell self-assembly of proteolysis targeting chimeras[J]. ACS Cent Sci,2016,2(12):927-934. doi: 10.1021/acscentsci.6b00280 [77] COTTON A D, NGUYEN D P, GRAMESPACHER J A, et al. Development of antibody-based PROTACs for the degradation of the cell-surface immune checkpoint protein PD-L1[J]. J Am Chem Soc,2021,143(2):593-598. doi: 10.1021/jacs.0c10008 [78] XUE G, WANG K, ZHOU D L, et al. Light-induced protein degradation with photocaged PROTACs[J]. J Am Chem Soc,2019,141(46):18370-18374. doi: 10.1021/jacs.9b06422 [79] PFAFF P, SAMARASINGHE K T G, CREWS C M, et al. Reversible spatiotemporal control of induced protein degradation by bistable PhotoPROTACs[J]. ACS Cent Sci,2019,5(10):1682-1690. doi: 10.1021/acscentsci.9b00713 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 7777
- HTML全文浏览量: 9946
- PDF下载量: 193
- 被引次数: 0
