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失眠是现代社会常见的临床症状之一，对人们的身心健康和生活质量造成严重影响，同时还会伴发多种躯体和精神疾病。随着社会的高速发展，工作压力大，生活不规律，导致失眠的发病率逐年上升且呈现低龄化趋势，引起社会各界的高度重视[1]。有研究表明，我国大约有45.5%的人群有不同程度的睡眠障碍[2]。夜宁胶囊为联勤保障部队第904医院（本院）自制制剂，该制剂是《中华人民共和国药典》（一部）2020版收载的夜宁糖浆[3]的改剂型，主要由合欢皮、灵芝、首乌藤等7味药材组成，具有镇静、养心、安神的功效，用于改善心血不足所致的失眠、多梦、头晕、乏力。该文通过研究夜宁胶囊对小鼠自主活动、协同阈上/阈下戊巴比妥钠催眠作用以及小鼠脑组织中γ-氨基丁酸（GABA）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）含量变化的影响，验证夜宁胶囊的镇静催眠作用，并初步对其作用机制进行探讨。
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雄性ICR小鼠[体质量为（20±2） g，SPF级 ，常州卡文斯实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（苏）2016-0010]。动物在温度为25 ℃±2 ℃，湿度为55％±10％的环境中适应性饲养7 d，自由摄取饮用水和标准饲料，保持昼夜节律和环境干净整洁。
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夜宁胶囊（批号：2020081，本院院内自制制剂）；艾司唑仑片（批号：20200111，常州四药）；戊巴比妥钠（批号：191201，Sigma分装）；生理盐水（批号：020100201，四川科伦药业股份有限公司）；GABA ELISA试剂盒（货号：xy-E12157，信裕生物）；NE ELISA试剂盒（货号：MBS2600834，Mybiosource）；DA ELISA试剂盒（货号：MBS269234，Mybiosource）；5-HT ELISA试剂盒（货号：MBS266457，Mybiosource）。
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电子分析天平（XS105型，梅特勒托利多仪器有限公司）；超声波清洗机（FQ-1006HTD型，杭州法兰特超声波科技有限公司）；旋转蒸发器（RE-5C式，上海青浦沪西仪器厂）；电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）； CT-C-O型烘箱（常州市范氏干燥设备有限公司）；自制开野实验敞箱（50 cm×50 cm×30 cm），箱内为黑色，箱底画出25个同等面积的方格；酶标仪（ELX 800型，Bio-Tex）；离心机（80-2型，上海手术器械厂）；可调高速匀浆机（FSH-2A型，常州翔天实验仪器厂）。
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夜宁胶囊的制法为：浮小麦加水浸泡2 h，煮沸，于80 ℃～90 ℃温浸2次，每次2 h，滤过合并温浸液；灵芝粉碎成粗粉，用95%乙醇浸泡7 d，压榨滤过，滤液减压浓缩干燥，粉碎成细粉，过80目筛，备用；上述灵芝粗粉药渣与合欢皮、首乌藤、大枣、女贞子、甘草加水煎煮滤过，滤液和上述温浸液合并，减压浓缩干燥，碎成细粉，过80目筛，加入灵芝细粉，混匀装胶囊，即得夜宁胶囊，规格为400 mg/粒，推荐服用量约10粒/日。按照一个成年人体质量60 kg，服用剂量约为60 mg/kg，换算得到小鼠的中剂量约为600 mg/kg。将ICR小鼠随机分成5组（每组10只）：① 空白对照组（相应体积的溶剂灌胃）；② 艾司唑仑组（0.8 mg/kg）；③ 夜宁胶囊低剂量组（400 mg/kg，YNL组）；④ 夜宁胶囊中剂量组（600 mg/kg，YNM组）；⑤ 夜宁胶囊高剂量组（800 mg/kg，YNH组）。每天下午5点灌胃给药，连续灌胃8 d。
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在第6天给药30 min后，将小鼠放置在开野实验敞箱中先适应1 min，待适应时间结束后观察小鼠5 min内自主活动，记录其活动次数，实验过程中保持环境安静。自主活动包括：① 舔爪、清洗整理身体、擦脸均可记为清洗身体1次；② 四肢全部进入一格记为水平走格1次；③ 前肢攀附箱壁或离箱底站立记为站立1次。每只小鼠录像结束后需清理敞箱，以免对下一只小鼠造成干扰。
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基于前期研究戊巴比妥钠剂量的预实验，选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液的阈下剂量为35 mg/kg。在第7天给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠溶液（35 mg/kg），观察15 min内小鼠睡眠情况，若小鼠翻正反射消失且持续1 min以上认为进入睡眠状态，根据睡眠小鼠只数，计算入睡率。入睡率（%）=（进入睡眠动物只数/总动物只数）×100%。
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基于前期研究戊巴比妥钠剂量的预实验，选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液的阈上剂量为41 mg/kg。在第8天给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠溶液（41 mg/kg），注射后立刻计时并观察，记录小鼠入睡潜伏期和睡眠时长。评判标准：① 入睡潜伏期指的是小鼠从注射阈上剂量戊巴比妥钠至翻正反射消失的时间；② 睡眠时长指小鼠从翻正反射消失至翻正反射恢复的时间。
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行为学实验结束后，在末次给药24 h后脱臼处死小鼠，取出小鼠大脑，用冰冷生理盐水进行冲洗，滤纸吸干后称重。随后匀浆机匀浆（4℃），以4 000 r/min，离心10 min，收集上清液。按照试剂盒说明书操作，采用ELISA法测定小鼠脑组织中GABA、5-HT、DA、NE的水平。
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采用SPSS 19.0 软件对实验数据进行分析处理。实验数据组间比较采用单因素方差分析法，组间两两比较采用LSD-t检验；阈下剂量戊巴比妥钠实验数据采用Fisher精确检验分析。实验结果均用（
$ \bar{x} $ ± SEM）表示，当P<0.05时即认为其有统计学意义。 -
实验结果如表1所示，与空白对照组相比，艾司唑仑组（P<0.05）、YNM组（P<0.05）、YNH组（P<0.01）均显著降低了小鼠自主活动的次数。由此表明，YNM组和YNH组具有明显的镇静作用。
表 1 夜宁胶囊对小鼠自主活动的影响（
$ \bar{x} $ ±SEM，n=10）组别 剂量（mg/kg） 小鼠自主活动次数 空白对照组 − 188.90±7.78 艾司唑仑组 0.8 160.50±7.10* YNL组 400 169.60±13.15 YNM组 600 156.80±8.34* YNH组 800 151.70±7.28** 注：*P<0.05，** P<0.01，与空白对照组比较。 -
实验结果如表2所示，与空白对照组相比，艾司唑仑组（P<0.001）、YNM组（P<0.05）、YNH组（P<0.01）的小鼠入睡率显著增加，结果表明YNM组和YNH组具有明显的镇静催眠作用。
表 2 夜宁胶囊对阈下剂量戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响（n=10）
组别 剂量（mg/kg） 入睡数量（只） 入睡比率（%） 空白对照组 − 0 0 艾司唑仑组 0.8 9 90*** YNL组 400 1 10 YNM组 600 5 50* YNH组 800 7 70** 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白对照组比较。 -
实验结果如表3所示，与空白对照组相比，艾司唑仑组（P<0.01）、YNM组（P<0.05）、YNH组（P<0.01）均显著增加了小鼠的睡眠时长；艾司唑仑组（P<0.05）、YNM组（P<0.05）、YNH组（P<0.05）显著缩短了小鼠的入睡潜伏期。结果表明YNM组和YNH组具有明显的镇静催眠作用。
表 3 夜宁胶囊协同阈上剂量戊巴比妥钠对小鼠睡眠时长和入睡潜伏期的影响（
$ \bar{x} $ ±SEM，n=10）组别 剂量（mg/kg） 睡眠潜伏期（t/min） 睡眠时长（t/min） 空白对照组 − 5.69±0.69 8.20±3.23 艾司唑仑组 0.8 3.86±0.45* 34.20±5.89** YNL组 400 4.73±0.18 17.86±3.63 YNM组 600 4.05±0.17* 22.15±4.66* YNH组 800 3.83±0.21* 28.26±4.38** 注：*P<0.05，**P<0.01，与空白对照组比较。 -
各组小鼠脑组织中各神经递质的检测结果如表4所示，与空白对照组相比：艾司唑仑组（P<0.01）和YNH组（P<0.05）小鼠脑组织中GABA含量显著增加；艾司唑仑组（P<0.05）和YNH组（P<0.05）小鼠脑组织中5-HT含量显著增加；艾司唑仑组（P<0.001）和YNH组（P<0.05）小鼠脑组织中DA含量显著增加；艾司唑仑组（P<0.01）和YNH组（P<0.01）小鼠脑组织中NE含量显著增加。结果表明，YNH组能显著性升高小鼠脑组织中的GABA、5-HT、DA和NE水平。
表 4 夜宁胶囊对小鼠脑组织中GABA、5-HT、DA和NE水平的影响（
$ \bar{x} $ ±SEM，n=10）组别 剂量（mg/kg） GABA含量（μmol/g） 5-HT含量（μg/g） DA含量（ng/g） NE含量（ng/g） 空白对照组 − 1.08±0.11 0.52±0.11 153.61±16.88 66.74±6.14 艾司唑仑组 0.8 2.33±0.28** 1.16±0.18* 327.14±22.77*** 155.14±19.12** YNL组 400 1.02±0.12 0.52±0.09 152.72±26.68 80.50±7.25 YNM组 600 1.17±0.20 0.75±0.13 168.17±14.90 91.76±12.66 YNH组 800 1.80±0.21* 1.02±0.14* 235.99±27.31* 116.31±13.02** 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白对照组比较。 -
目前临床上治疗失眠的镇静催眠药物主要是以苯二氮䓬类为主的西药，长期服用此类药物不但带来严重的不良反应，还会产生明显的耐受性、依赖性[5]。而中医药在治疗失眠方面具有疗效好、安全性高和无成瘾性等特点，相较于西药有着独特优势，是目前研究镇静催眠药物的新方向[6]。夜宁胶囊的主要成分为合欢皮、首乌藤、灵芝、大枣、浮小麦、女贞子、甘草，有安神、养心之功效，用于治疗头昏失眠、神经衰弱、血虚多梦[7]。其中合欢皮舒肝解郁、悦心安神，用于治疗烦躁不宁、失眠多梦之症；首乌藤养心安神、祛风通络，可治疗阴虚血少而致的虚烦不眠、多梦易惊等症；灵芝利益气血，安神健脾，用于治疗心悸、失眠、虚劳、头晕等症；甘草、大枣补中益气，养血安神，缓和药性；女贞子补肝肾阴；浮小麦敛汗、益气、除热。七味药相互促进、相互依赖，协同发挥了养血安神的作用[8]。
该研究通过建立小鼠开野实验、阈上、阈下戊巴比妥钠协同作用实验等用于考察镇静催眠药物的经典的药理实验模型，对夜宁胶囊的镇静催眠作用进行了研究，并进一步考察了夜宁胶囊对小鼠脑内GABA、5-HT、DA和NE等神经递质含量的影响。在研究镇静催眠药物时，开野实验、阈上、阈下戊巴比妥钠协同作用实验均为经典的、可靠的、简单易行的动物模型，而氨基酸类神经递质GABA以及单胺类神经递质5-HT、NE和DA均为公认的参与睡眠-觉醒机制的经典神经递质，当其水平提高时，睡眠质量随之提升[9-11]。研究结果显示，在开野实验中，YNM组、YNH组能显著降低小鼠自主活动的次数；在阈上戊巴比妥钠协同作用实验中，YNM组、YNH组能明显缩短小鼠的入睡潜伏期、延长小鼠的睡眠时间；在阈下戊巴比妥钠协同作用实验中，YNM组、YNH组能显著增加小鼠的入睡率，这表明夜宁胶囊具有显著的镇静催眠作用。进一步研究发现，YNH组可显著性增加小鼠脑组织中的GABA、5-HT、DA和NE含量。综上所述，夜宁胶囊具有良好的镇静催眠作用，并初步推测其镇静催眠作用机制与GABA、5-HT、DA和NE等神经递质水平改变有关。该研究为夜宁胶囊的开发利用提供了更多的科学依据，在此基础上，其具体的作用机制有待进一步探索研究。
Sedative and hypnotic effects and mechanism of Yening Capsules on mice
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摘要:
目的 研究夜宁胶囊对小鼠的镇静催眠作用，并初步探究其作用机制。 方法 将小鼠随机分成空白对照组，艾司唑仑组（0.8 mg/kg），夜宁胶囊低、中和高剂量组（400、600和800 mg/kg），通过开野实验，协同阈上和阈下剂量戊巴比妥钠对小鼠睡眠影响的实验，观察并记录夜宁胶囊对小鼠自主活动、入睡潜伏期、睡眠时长和入睡率的影响。用酶联免疫法检测小鼠脑组织中γ-氨基丁酸（GABA）、5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）的水平。 结果 与空白对照组相比，夜宁胶囊中、高剂量组（P<0.05、P<0.01）能显著降低小鼠自主活动次数；夜宁胶囊中、高剂量组能显著缩短小鼠入睡潜伏期（P<0.05、P<0.05），并延长睡眠时间（P<0.05、P<0.01）；夜宁胶囊中、高剂量组（P<0.05、P<0.01）能显著增加小鼠的入睡率。与空白对照组相比，高剂量的夜宁胶囊可明显增加小鼠脑组织中GABA（P<0.05）、5-HT（P<0.05）、DA（P<0.05）、NE（P<0.01）含量。 结论 夜宁胶囊具有良好的镇静催眠作用，其作用机制与提高脑内GABA、5-HT、DA和NE水平有关。 Abstract:Objective To study the sedative and hypnotic effects of Yening Capsules and investigate its bioactive mechanism in mice. Methods The mice were randomly divided into control group, estazolam group （0.8 mg/kg）, low, medium and high-dose Yening Capsules groups （400, 600 and 800 mg/kg）. The locomotor activity, latency to persistent sleep, sleep duration and sleep rate were determined respectively in mice via the open field test and injection of pentobarbital sodium in subthreshold and suprathreshold doses. The content of GABA, 5-HT, DA and NE in brain tissue of mice were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Results Compared with the control group, Yening Capsules medium and high dose group （P<0.05, P<0.01）significantly decreased the locomotor activity of mice.The sleep latency in Yening Capsules medium and high dose group were significantly shorten （P<0.05, P<0.05）and the sleep duration （P<0.05, P<0.01）were extended. The sleep rate of Yening Capsules medium and high dose groups （P<0.05, P<0.01） was significantly increased. Compared with the control group, high dose of Yening Capsules can significantly increase GABA (P<0.05), 5-HT (P<0.05), DA (P<0.05), NE (P<0.01) in mouse brain tissue. Conclusion Yening Capsules had obvious sedative and hypnotic effects, and its mechanism may be related to the increasement of GABA, 5-HT, DA and NE level in brain tissue of mice. -
Key words:
- Yening Capsules /
- sedative hypnosis /
- insomnia /
- pentobarbital sodium /
- neurotransmitter
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奥卡西平(oxcarbazepine, OXC)是第二代抗癫痫药物，可用于儿童全面强直-阵挛发作，部分伴或不伴继发性全面发作的一线治疗[1]，其具有与传统的抗癫痫药物（AEDs）如苯妥英钠、卡马西平和丙戊酸钠相同的疗效，但其对肝药酶和自身的诱导作用小，药物间相互作用较少，临床上可用于替代传统的AEDs。OXC是卡马西平（carbamazepine, CBZ）的一种10-酮类衍生物，但两者之间的药动学存在差异，OXC的耐受性好且不良反应少[2]。OXC是无活性的前体药物，在体内经过肝脏内细胞溶质芳基酮还原酶的作用转化为具有药理活性的中间代谢产物单羟基卡马西平（monohydroxy carbamazepine, MHD）[3-4]。国际抗癫痫联盟推荐MHD血清浓度的参考范围为3～35 μg/ml[5]，有研究表明，当血药浓度高于30 μg/ml时，容易发生药物不良反应，且在许多患者中，不良反应间歇性的发生与MHD浓度的波动有关[6]。在临床用药中也发现OXC服药后的药物浓度个体化差异大，年龄、性别、体重、肝肾功能等均会影响MHD的药动学参数[7]，故需要对其血药浓度进行监测。本研究在参考既往研究的基础上[8-12]，对色谱条件进行了优化，并简化了血样处理的过程，建立了HPLC法测定OXC活性代谢产物MHD血药浓度的方法，该方法快速、简单、准确、选择性好、灵敏度高，为临床监测血药浓度、调整给药剂量提供了手段。
1. 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；H1850R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科仪器有限公司）；SHB-B95A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Discovery DV215CD型分析天平（美国OHAUS公司）；Vortex-5型涡旋混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2 材料
MHD对照品（美国CATO公司）；内标：奥硝唑（中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海科丰化学试剂有限公司）；空白血浆（医院血库提供）；超纯水（实验室自制）。
2. 实验方法
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），预柱为Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈（80:20，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μl；双波长检测：在192 nm处检测MHD，318 nm处检测奥硝唑。
2.2 溶液及血浆样品的配制
2.2.1 储备液的配制
精密称取MHD对照品10 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为1 mg/ml的储备液，置于−20 ℃下保存。
2.2.2 内标工作液的配制
精密称取奥硝唑1.4 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为140 μg/ml的内标工作液，置于−20 ℃下保存。
2.2.3 血浆标准曲线和质控样品的配制
分别精密量取适量储备液，用甲醇稀释成20、50、100、200、300、400、500 μg/ml浓度梯度的标准对照溶液。取以上6个标准对照溶液，加入适量空白血浆，得2、5、10、20、30、40、50 μg/ml系列浓度的血浆标准曲线样品。同法配制相应的低、中、高浓度的血浆质控样品（QC），使得MHD对应的浓度分别为5、15、40 μg/ml。
2.3 血浆样品的预处理
取200 μl血浆样品，加入200 μl内标工作液、400 μl甲醇，涡旋混合30 s，10 ℃条件下13 000 r/min离心10 min，取上清液直接进样。
3. 结果
3.1 专属性试验
通过考察6份不同生物来源的空白血浆样品色谱图、空白血浆样品加入MHD对照品和内标的色谱图，以及临床实际用药后的患者血浆样品色谱图，以此反映方法的专属性。由图1可见，在本实验条件下，被测物MHD与内标的色谱峰分离良好，且血浆中的内源性物质不干扰测定。MHD和内标的保留时间分别为9.5 min和6.1 min。
3.2 标准曲线与线性范围
取上述浓度为2、5、10、20、30、40、50 μg/ml的血浆标准曲线样品按“2.3”项下方法处理。经HPLC法分析，以测得OXC的峰面积与内标峰面积之比（Y）作为纵坐标，以血浆MHD浓度（X）为横坐标，得到回归方程为：Y=0.047 1X+0.022 2（r=0.998 6）。线性范围：根据标准曲线，MHD血药浓度在2～50 μg/ml范围内线性关系良好，其定量下限浓度为2 μg/ml。
3.3 日内、日间精密度和准确度
配制定量下限、低、中、高（2、5、15、40 μg/ml）4种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理后测定，连续测定3 d，以当天的标准曲线计算QC样品的测定浓度，计算日内、日间精密度以及准确度。经测定，MHD的日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，均符合生物样品的测定要求，结果见表1。
表 1 单羟基卡马西平日内、日间精密度和准确度（n=6）理论浓度
（μg/ml）实测浓度
（μg/ml）RSD（%） RE（%） 日内精密度 日间精密度 2 1.85±0.16 8.64 12.21 −3.63 5 4.93±0.24 4.86 7.68 −4.43 15 14.32±0.37 6.86 6.16 −3.11 40 41.80±1.26 3.03 5.33 0.59 3.4 提取回收率
配制低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理。同时另取18份空白血浆，除了不加系列对照品溶液和内标外，按“2.3”项下方法处理，在获得的上清液中加入MHD和内标溶液至相应浓度。进样分析，以每一浓度中2种不同处理方法的峰面积比值计算提取回收率。经测定，本法中MHD的平均提取回收率在89.62%～95.32%之间；内标的平均提取回收率为98.76%，符合生物学样品的分析要求，结果见表2。
表 2 单羟基卡马西平、MHD和内标提取回收率试验结果（n=6）化合物 浓度（μg/ml） 提取回收率（%） MHD 5 89.62±4.82 15 94.67±6.76 40 95.32±4.90 内标 140 98.76±5.92 3.5 稳定性试验
3.5.1 室温稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并在室温条件下放置4 h和10 h后测定样品血药浓度，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在室温下放置10 h后仍稳定，RSD均小于4.47%，RE值在1.50%～2.98%之间，结果见表3。
表 3 奥卡西平代谢产物单羟基卡马西平稳定性试验结果 (n=5)储存条件 理论浓度（μg/ml） 实测浓度（μg/ml） RSD（%） RE（%） 室温10 h 5 5.15±0.19 3.60 2.98 15 15.39±0.69 4.47 2.62 40 40.60±0.40 0.98 1.50 冻融3次 5 5.47±0.15 2.83 9.41 15 15.79±0.32 2.06 5.24 40 40.75±1.10 2.71 1.86 处理后36 h 5 5.39±0.27 5.09 7.74 15 15.66±0.58 3.70 4.39 40 39.46±1.80 4.57 −1.34 −20 ℃，30 d 5 5.16±0.23 4.39 3.19 15 14.62±0.39 2.64 −2.53 40 40.37±0.58 1.44 0.93 3.5.2 冻融稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并于−20 ℃冰箱中冷冻保存24 h后室温下解冻1 h后测定，反复冻融3次，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品反复冻融3次后仍能保持稳定，RSD均小于2.83%，RE值在1.86%～9.41%之间，结果见表3。
3.5.3 处理后的血浆样品在自动进样器中储存的稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆QC样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，然后放置在自动进样器内12 h、36 h后再次测定，求得RSD和RE值。经测定处理后的MHD血浆样品在进样器内放置36 h仍能保持稳定，RSD均小于5.09%，RE值在−1.34%～7.74%之间，结果见表3。
3.5.4 长期稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆质控样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，并置于−20 ℃冰箱中冻存30 d后取出解冻后测定，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在−20 ℃冰箱中冻存30 d后仍能保持稳定，RSD均小于4.39%，RE值在−2.53%～3.19%之间，结果见表3。
4. 讨论
目前，有关MHD的检测方法的文献很多，其中,高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法都有报道，后者虽有灵敏度高、专属性强的特点，但其仪器昂贵，且需专业人员进行操作，很难在大部分的医疗机构普及[13-15]。另外，国内外文献报道中多使用固液萃取法或液液萃取法进行血样的前处理，但这种处理过程相对复杂、耗时，且经济成本较高[11, 16]。本方法采用甲醇沉淀蛋白进行血样的前处理，建立了HPLC法测定人血浆中MHD血药浓度的方法，整个过程操作简单、快速，样品分析时间较短，适用于临床大量样品的连续检测。
文献报道的流动相有乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钾溶液（33∶67，V/V）[12]、水-乙腈（65∶35，V/V）[17]、水-甲醇-乙腈（64∶30∶6，V/V/V）[18]等。本方法采用了水-乙腈，按不同的配比进行试验，发现当水-乙腈的比例为80∶20时，色谱峰的峰形、出峰时间及分离度最佳。文献采用卡马西平[17]、苯巴比妥[19]和奥硝唑[20]等作为内标，本研究通过筛选发现奥硝唑的保留时间为6.1 min，不仅与MHD的保留时间相近，又能与其有很好的分离，且其性质稳定，满足内标的要求。
本实验建立的测定人血浆中OXC活性代谢产物MHD的HPLC法，MHD线性回归方程中的r=0.998 6，说明血药浓度在2～50 μg/ml范围内具有良好的线性关系，日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，MHD及内标的平均提取回收率在89.62%～98.76%之间。血浆样品的稳定性试验证明，在室温放置10 h、反复冻融、处理后放置进样器36 h以及低温保存30 d的情况下，样品未见明显降解，仍能保持稳定。本研究建立的HPLC法操作快速简单，精密度、回收率高，稳定性好，专属性强，不受血浆中内源性物质的干扰，结果准确可靠，且灵敏度高，适用于奥卡西平临床血药浓度的监测。
目前癫痫治疗主要以药物治疗为主，奥卡西平是第二代抗癫痫药物，我国诸多癫痫病专家也建议将其作为癫痫部分性发作和全面强直阵挛发作的首选药物[21]。但奥卡西平使用过程中可能出现瘙痒、荨麻疹、血管性水肿等超敏反应，包括Stevens Johnson综合征中毒性表皮坏死松解症[22]等，还可引起低钠血症、头晕、胃肠道不适等不良反应，有文献报道，其疗效及不良反应可能与血药浓度密切相关[23]，因此开展奥卡西平血药浓度的测定，能提高药物治疗的疗效，同时可以有效避免或减少可能产生的药物不良反应，提高癫痫患者服药的依从性。本研究建立了测定人血浆中MHD血药浓度的方法，应用于临床，为临床个体化给药提供依据，值得临床推广使用。
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表 1 夜宁胶囊对小鼠自主活动的影响（
$ \bar{x} $ ±SEM，n=10）组别 剂量（mg/kg） 小鼠自主活动次数 空白对照组 − 188.90±7.78 艾司唑仑组 0.8 160.50±7.10* YNL组 400 169.60±13.15 YNM组 600 156.80±8.34* YNH组 800 151.70±7.28** 注：*P<0.05，** P<0.01，与空白对照组比较。 
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表 2 夜宁胶囊对阈下剂量戊巴比妥钠镇静催眠作用的影响（n=10）
组别 剂量（mg/kg） 入睡数量（只） 入睡比率（%） 空白对照组 − 0 0 艾司唑仑组 0.8 9 90*** YNL组 400 1 10 YNM组 600 5 50* YNH组 800 7 70** 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白对照组比较。
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表 3 夜宁胶囊协同阈上剂量戊巴比妥钠对小鼠睡眠时长和入睡潜伏期的影响（
$ \bar{x} $ ±SEM，n=10）组别 剂量（mg/kg） 睡眠潜伏期（t/min） 睡眠时长（t/min） 空白对照组 − 5.69±0.69 8.20±3.23 艾司唑仑组 0.8 3.86±0.45* 34.20±5.89** YNL组 400 4.73±0.18 17.86±3.63 YNM组 600 4.05±0.17* 22.15±4.66* YNH组 800 3.83±0.21* 28.26±4.38** 注：*P<0.05，**P<0.01，与空白对照组比较。
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表 4 夜宁胶囊对小鼠脑组织中GABA、5-HT、DA和NE水平的影响（
$ \bar{x} $ ±SEM，n=10）组别 剂量（mg/kg） GABA含量（μmol/g） 5-HT含量（μg/g） DA含量（ng/g） NE含量（ng/g） 空白对照组 − 1.08±0.11 0.52±0.11 153.61±16.88 66.74±6.14 艾司唑仑组 0.8 2.33±0.28** 1.16±0.18* 327.14±22.77*** 155.14±19.12** YNL组 400 1.02±0.12 0.52±0.09 152.72±26.68 80.50±7.25 YNM组 600 1.17±0.20 0.75±0.13 168.17±14.90 91.76±12.66 YNH组 800 1.80±0.21* 1.02±0.14* 235.99±27.31* 116.31±13.02** 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白对照组比较。
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