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多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性最常见的一种生殖内分泌疾病，其特征以生化或临床高雄激素血症、无排卵和卵巢多囊样改变等为主要表现[1-2]。流行病学显示PCOS在全世界范围内的总体发病率约为6%~20%[3]，而由PCOS引发的排卵障碍所致的不孕症占40%[4]。PCOS不仅影响女性的正常生殖功能，还会导致女性发生代谢系统方面的障碍，如高胰岛素血症、胰岛素抵抗，增加女性继发糖尿病、心血管疾病及子宫内膜癌的风险，对女性健康造成严重不良影响[2]。肥胖是PCOS发生的重要危险因素之一[5]。研究数据表明，28.3%的超重或肥胖的女性患有PCOS[6]，多达42%的PCOS患者超重或肥胖[7]。肥胖对PCOS的发展和进展产生显著影响，研究发现，脂肪细胞主要通过分泌脂肪因子，如IL-1、IL-6、瘦素、脂联素等，作用于相应的靶器官、靶组织、靶细胞，如卵巢、肾上腺等，刺激机体产生较多的雄激素，而雄激素又可通过抑制肾上腺素受体等导致体内脂肪分解减少，脂肪大量堆积在体内，导致体内高雄激素水平与肥胖之间形成恶性循环，严重影响PCOS患者的健康状况[3]。与普通女性相比，PCOS患者具有更高的肥胖倾向，且更容易出现腹部脂肪堆积[8]；而这种由于腹部脂肪堆积造成的中心性肥胖反过来又可加重PCOS患者的临床或生化表现，导致胰岛素抵抗、高雄激素血症、生殖功能异常等[9]。临床试验结果显示，若患者体质量减轻初始体质量的5%，其体内激素水平、血糖水平得以改善，同时，月经周期和排卵情况趋于正常化，这表明体质量减轻可增加患者排卵和妊娠的可能性[10]。
青蒿素（artemisinin，ART）是一种天然倍半萜内酯化合物，最初由2015年诺贝尔生理学或医学奖获得者屠呦呦从青蒿植物中提取出来并广泛用于抗疟疾治疗[11]；青蒿素还用于抗癌、抗炎药物等[12]。近年研究发现，青蒿素及其衍生物还具有预防肥胖的功效：在啮齿动物模型中，青蒿素及其衍生物通过调节p38MAPK/ATF2轴和Akt/mTOR途径等在脂肪生成过程中诱导脂肪细胞褐变，从而预防肥胖并改善肥胖相关的代谢紊乱[13]。Lee等[14]和Jang[15]体外实验数据表明，青蒿素及其衍生物可通过PPARγ途径抑制脂肪生成和脂肪因子的表达。本研究通过网络药理学方法和分子对接方法分析预测青蒿素可用于治疗PCOS的潜在靶点，旨在为深入研究其治疗的作用机制提供参考。
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通过Pubchem数据库[16]（
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）获得天然产物青蒿素的SMILES号，并将其输入Swiss TargetPrediction数据库[17]（http://www.swisstargetprediction.ch/ ）进行靶点预测，导出分析结果并保存；结合PharmMapper数据库[18]（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ ）预测的靶点，二者共同作为青蒿素的药物靶点，并将靶点导入Uniprot数据库[19]（https://www.uniprot.org/）进行靶点蛋白与基因名称转换。以“polycystic ovary syndrome”作为关键词检索，通过DisGeNET数据库[20]（https://www.disgenet.org/ ）、GeneCard数据库[21]（https://www.genecards.org/ ）进行疾病靶点预测。将搜集的青蒿素靶点和PCOS靶点分别导入Venny在线作图软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ ）绘制韦恩图，从而得到二者的共同靶点。 -
将共同靶点导入STRING数据库[22]（
https://cn.string-db.org/ ），物种选择“homo sapiens”，最低相互作用分数设置为“0.9”，隐藏游离点，其他保持默认设置，得到蛋白相互作用网络图（protein-protein interaction，PPI），将PPI网络图导入Cytoscape 3.9.1软件[23]，进行核心靶点筛选。 -
将共同靶点导入DAVID数据库[24]（
https://david.ncifcrf.gov/ ），分别进行基因本体（gene ontology，GO）功能、京都基因与基因组百科全书（kyotoencyclopodia of genes and genomes，KEGG）通路分析，其中GO功能富集内容从分子功能（molecular function，MF）、生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)三部分进行逐一分析，并利用微生信在线作图软件（http://www.bioinformatics.com.cn/ ）将分析结果进行可视化。 -
将所获得的青蒿素、PCOS作用靶点及信号通路分别导入Cytoscape软件构建药物-疾病-靶点-通路网络图。
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从Pubchem数据库中下载青蒿素的2D结构，在RCSB PDB数据库[25]（
https://www.rcsb.org/ ）中下载核心靶蛋白结构。利用Chem3D软件对青蒿素的2D结构进行转化，用Pymol软件对核心靶蛋白结构进行初步处理，再用Auto Dock Tools软件做进一步加氢等处理，并将处理的核心靶蛋白保存为“pdbqt”格式进行分子对接，最后利用Pymol软件对分子对接结果进行可视化处理[26-27]。 -
通过数据库检索共得到青蒿素潜在作用靶点229个，PCOS疾病靶点1292个。利用在线作图软件将青蒿素作用靶点与PCOS疾病靶点进行韦恩图分析，得到二者的交集靶点90个，如图1所示。
图 1 青蒿素与PCOS靶点韦恩图
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将交集靶点导入String数据库，绘制PPI网络关系图，如图2所示，其中包括网络节点90个，边235条。将共同靶点导入Cytoscape 软件进行核心靶蛋白筛选。如图3所示。综合节点度值及本研究相关度排名靠前的分别为AKT1、ESR1、MMP9、PPARγ、MMP2（见表1）。
图 2 蛋白互作网络图
图 3 核心靶点筛选
表 1 青蒿素作用于PCOS的核心靶点
基因名称 节点度值 排名 ALB 66 1 AKT1 60 2 CASP3 53 3 SRC 51 4 EGFR 50 5 HSP90AA1 49 6 MMP9 48 7 ESR1 48 8 HRAS 47 9 PPARγ 43 10 ERBB2 41 11 MMP2 37 12 -
将得到的90个交集靶点导入DAVID数据库进行GO富集分析，富集结果分别根据基因富集程度进行排序，其中BP前10个条目主要涉及细胞增殖调控、蛋白质磷酸化和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物学过程，MF前10个条目主要与蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白结合和酶结合等分子功能有关，CC前10个条目主要在细胞膜、胞质和胞核等部位富集，如图4所示。KEGG富集分析共筛选到162条信号通路，根据基因富集程度排序，前20个条目主要涉及PI3K/Akt、MAPK、Ras、内分泌抵抗等信号通路，如图5所示。
图 4 GO富集分析
图 5 KEGG信号通路富集分析
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将相关靶点及通路文件导入Cytoscape 3.9.1软件，得到药物、疾病、靶点和通路之间的关系图（见图6）。
图 6 青蒿素-PCOS-靶点-通路网络图
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分子对接结果显示，青蒿素与核心靶蛋白AKT1、MMP9、ESR1、PPARγ、MMP2之间均存在结合位点。青蒿素与核心靶蛋白的最低结合能分数见表2，结合能越低表示结合活性越高，化合物越容易与该靶点结合。其中青蒿素与核心靶蛋白之间的氢键连接可视化情况如图7所示。
表 2 青蒿素与核心靶点分子对接结果
化合物 核心靶点 最低结合能（kJ/mol） 结合位点 青蒿素 MMP9 −8.2 ARG-143 AKT1 −7.9 HIS-152 ESR1 −7.9 THR-460 PPARγ −7.7 PRO-426、GLN-430、
LEU-431、PHE-432MMP2 −6.4 HIS-190 
图 7 青蒿素与核心靶点分子对接可视化（结合能≤8.2 kJ/mol）
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PCOS主要通过卵巢病变、机体内分泌紊乱等方式影响女性的生育能力[28]。目前关于PCOS的发病机制和病因尚未具体阐明，多认为是遗传和环境因素相互作用的结果；由于病因机制不明，临床治疗尚无统一方案，多采用对症治疗，如基础生活方式调整，通过控制饮食、增加体育运动以降低体质量和缩小腰围，增加机体胰岛素敏感性，降低胰岛素及雄激素水平，同时辅以相应的药物治疗，以减轻症状。
本研究基于临床发现，PCOS患者多伴有肥胖表现，遂以肥胖与PCOS之间的潜在联系为出发点，同时基于课题组现有天然活性物质进行药物筛选，经文献调研发现青蒿素有抗肥胖效果，继而通过网络药理学方法分析预测青蒿素可能用于治疗PCOS的潜在作用靶点，并探讨其可能用于临床治疗PCOS的可行性。
本研究根据PPI网络拓扑属性分析筛选出核心靶点AKT1、MMP9、ESR1、PPARγ、MMP2等，推测这些可能是青蒿素用于治疗PCOS的潜在作用靶点。有研究表明[29]，AKT1在颗粒细胞增殖中起关键作用，而其表达量的高低主要与机体雄激素水平异常有关，这会导致PCOS患者卵巢颗粒细胞正常功能受损。此外，AKT1还具有组织特异性，Song等[30]通过小鼠实验发现脂肪组织中AKT1的选择性抑制可以刺激白色脂肪组织发生褐变，从而可增加机体能量消耗发挥抗肥胖的效果。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一种锌依赖性酶，可由卵巢产生，在卵泡发育和PCOS的发病机制中起重要作用[31]；研究发现PCOS女性患者MMPs活性增加，其血液、卵泡液和颗粒细胞中MMP9、MMP2水平升高，高水平的MMPs会通过改变细胞外基质重塑，引起异常卵泡闭锁和卵巢基质组织增加，从而对患者的排卵和生育能力产生不良影响[32]。Barbara等[33]在对正常女性和肥胖女性血清样本中的MMP浓度对比发现，体质量增加可影响女性血清中的MMP浓度。ESR是维持卵巢颗粒细胞分化、卵泡和卵母细胞生长发育以及排卵功能的关键受体[34]；ESR1是一种核激素受体，作为转录因子的激活剂发挥作用[35]；Schomberg等[36]在ESR基因敲除的小鼠模型中发现ESR基因缺失会导致卵泡发育受阻，以致卵泡闭锁及无排卵现象发生。Artimani等[37]在评估PCOS患者颗粒细胞中ESR基因表达时发现，ESR mRNA的表达显著低于排卵功能正常女性，认为ESR基因的显著减少可作为颗粒细胞成熟缺陷或卵泡发育停滞的指标。ESR1也是一种与线粒体功能相关的基因，研究发现其在肥胖女性脂肪组织中有减少，Zhou等[38]在人类和啮齿动物实验中证实，脂肪组织中ESR1的表达与脂肪量呈负相关，同时ESR-α作用的降低还会损害线粒体功能，促进肥胖增加，破坏机体代谢稳态。PPARγ是一种调节脂肪细胞发育和葡萄糖稳态的核受体，主要在脂肪组织中表达[39]；此外在发育阶段的卵巢颗粒细胞中表达，并可受黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平的影响来调节机体雌激素分泌和卵巢功能[40]。此外，Lee等[41]在PCOS患者颗粒细胞中发现PPARγ mRNA表达水平下调。胡卫红等[42]研究发现PPARγ 在PCOS患者的卵巢颗粒细胞的表达异常可能与PCOS的高雄激素血症有关。
GO生物学过程富集分析表明，青蒿素治疗PCOS的生物学功能可能与细胞增殖调控、蛋白质磷酸化和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物过程有关。KEGG通路富集分析表明，青蒿素可能通过作用于PI3K/Akt、MAPK、Ras、癌症等信号通路发挥治疗作用。有研究表明，PI3K/Akt信号通路参与调节细胞增殖分化和迁移，在卵泡发育过程中对卵巢颗粒细胞的生长和凋亡起着关键作用[43]，在PCOS患者颗粒细胞中与氧化应激相关的凋亡多伴随PI3K/Akt信号下调[44]。此外，研究表明PI3K/Akt信号通路还可以调节脂肪细胞的脂解与分化，从而参与机体脂质代谢[45]。MAPK信号通路参与调节多种细胞过程，如增殖、分化、转录调控等，且该通路与卵巢颗粒细胞类固醇激素的合成有关[46]。研究发现，在PCOS女性中，异常的MAPK信号传导可导致代谢信号缺陷和卵巢雄激素分泌异常增多[47]。
为进一步探索青蒿素在PCOS治疗中的潜在分子机制，本研究将天然产物青蒿素和5个与PCOS密切相关的核心靶蛋白进行分子对接验证，寻找二者之间存在的最佳结合位点以及评估它们之间的结合能力。验证结果显示，青蒿素与核心靶蛋白之间能够较好结合。
综上所述，本研究采用网络药理学方法分析天然物青蒿素用于治疗PCOS的潜在作用靶点，其机制可能主要涉及PI3K/Akt、MAPK、内分泌抵抗等信号通路。这些信息为后续青蒿素用于治疗PCOS的实验验证提供了重要理论依据。
Exploration on the potential therapeutic mechanism of artemisinin in polycystic ovary syndrome based on network pharmacology and molecular docking technology
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摘要:
目的 应用网络药理学和分子对接技术探索青蒿素对多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）的潜在作用机制。 方法 通过Pubchem、Swiss Target Prediction、PharmMapper数据库预测青蒿素作用靶点,利用GeneCard、DisGeNET数据库获取与PCOS有关靶点；应用韦恩图分析青蒿素与PCOS的交集靶点；利用String软件对交集靶点进行PPI蛋白网络互作分析，并利用Cytoscape软件进行核心靶点筛选；应用DAVID数据库进行基因本体（gene ontology，GO）功能、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，并借助在线软件对分析结果进行可视化；通过Chemdraw、PyMol、Auto Dock Tools软件及RCSB PDB数据库对青蒿素及核心靶蛋白进行分子对接。 结果 得到青蒿素靶点229个，PCOS靶点1292个，韦恩图分析交集靶点90个，潜在核心靶点5个，分别为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，AKT1）、雌激素受体（estrogen receptor 1，ESR1）、基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein 9，MMP9）、过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein 2，MMP2），主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、Ras、内分泌抵抗等信号通路。分子对接结果显示青蒿素与对应核心靶蛋白之间存在分子结合位点。 结论 初步预测分析青蒿素可能通过多靶点、多机制对PCOS发挥治疗作用。 Abstract:Objective To explore the potential mechanism of artemisinin in the treatment of polycystic ovary syndrome (PCOS) by network pharmacology and molecular docking technology. Methods The corresponding targets of natural product artemisinin were obtained from PubChem, Swiss Target Prediction and PharmMapper databases, targets related to PCOS were obtained through GeneCards and DisGeNET databases; the intersection target genes of Artemisinin and PCOS were screened by Draw Venn diagram. Then the protein-protein interaction network (PPI) was constructed according to the intersection target genes through the STRING Database, and the core targets were screened by Cytoscape. Besides, gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis was performed by DAVID Database, and finally the data were analyzed visually by the online platform. Molecular docking of artemisinin and core targets were performed by Chemdraw, Pymol, Auto Dock Tools and RCSB PDB database. Results A total of 229 targets of artemisinin and 1292 targets of PCOS were screened out, 90 overlapping targets were obtained by Draw Venn diagram, and 5 potential core targets, AKT1, ESR1, MMP9, PPARG, MMP2, were mainly act on PI3K Akt, MAPK, RAS, endocrine resistance and other signal pathways. Molecular docking results showed that there were molecular binding sites between artemisinin and core targets. Conclusion It is preliminarily analyzed that artemisinin may play a therapeutic role in PCOS through multiple targets and mechanisms. -
Key words:
- artemisinin /
- polycystic ovary syndrome /
- network pharmacology /
- molecular docking
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曲安奈德属于肾上腺糖皮质激素类药物，具有抗炎、抗毒素、抗休克等作用[1]。目前临床上主要有注射液和乳膏两种剂型，其中曲安奈德注射液用于治疗关节及结缔组织方面的炎症，曲安奈德乳膏用于治疗皮肤炎症，二者效果均显著，但副作用大，不可长期和大面积使用[2]。曲安奈德喷雾溶液作为一种新剂型，由于其活性成分浓度低，副作用小，如果再具有适度的透皮性能，则可进一步降低其在治疗皮肤病时的副作用，实现可长期和大面积使用的优势。因此，改善曲安奈德喷雾溶液的透皮功能对该药物的临床广泛应用具有重要价值。目前，药物中添加氮酮类化合物、多元醇类、表面活性剂等渗透促进剂是改善药物透皮功能的主要方法[3]。试验选取对皮肤温和的多元醇类中的乙醇和丙二醇两个渗透促进剂，考察单用与联用时对曲安奈德喷雾溶液透皮性能的影响，为曲安奈德喷雾溶液的透皮研究提供有用信息。
1. 材料
1.1 仪器
1260 Infinity II型高效液相色谱仪（安捷伦）；智能透皮扩散仪（上海黄海药检仪器有限公司，规格：供给池容积4.8 ml、接收池容积8 ml、内径1.7 cm，外径2.7 cm）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PB303-M型梅特勒-托利多电子天平。
1.2 试药与动物
曲安奈德0.015%喷雾溶液（自制）；曲安奈德对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100055-201804）；8%硫化钠溶液；纯化水（屈臣氏）；0.9%氯化钠溶液；色谱级甲醇；色谱级乙腈。雄性健康新西兰白兔[体质量2.0~2.5 kg，动物生产许可证号：SCXK （鲁） 2020004，购自于济南西岭角养殖繁育中心]。
2. 方法和结果
2.1 曲安奈德喷雾溶液的制备
称取不同量的乙醇溶解曲安奈德，添加不同含量的丙二醇，以水定容，即得曲安奈德喷雾溶液。
2.2 兔腹部皮肤的制备及处理
将健康的体质量为2 kg雄性新西兰白兔处死后立即取腹部皮肤，用配制好的8%硫化钠溶液进行浸泡，至兔毛透明时立即用棉签褪去兔毛，用配制好的0.9%氯化钠溶液清洗褪毛后的兔皮，待硫化钠气味消失后开始剥离兔皮的皮下黏膜组织和脂肪，随后用蒸馏水反复冲洗，待无白色浑浊时用0.9%氯化钠溶液再次清洗，最后将清洗好的兔皮浸泡至0.9%氯化钠溶液中，放置4 ℃冰箱冷藏保存，并在1周内使用。
2.3 体外透皮试验
采用的透皮试验条件分别为有效渗透面积：2.27 cm2；温度：（32 ± 1） ℃；供给液体积：4.6 ml；接收液体积：8 ml。体外透皮试验方法为将处理好的兔皮固定于Franz透皮扩散池的两池之间，角质层朝上，注入超声排尽气泡后的曲安奈德喷雾溶液，用封口膜将供给池顶部密封，分别于2、6、10、16、18、20、22和24 h时吸取接收液2 ml，每次取样后在接收池中补加相同温度和相同体积的含10%乙醇的生理盐水。在接收池中所取2 ml样品，用0.45 μm的聚醚砜微孔滤膜进行过滤，取续滤液即为供试品溶液。
2.4 曲安奈德对照品溶液的制备
精密称取曲安奈德对照品15.00 mg，置于100 ml的量瓶内，先用60 ml的甲醇将曲安奈德对照品溶解，再用纯化水定容至刻度线，得曲安奈德对照品储备液。精密量取2 ml曲安奈德对照品储备液，置于10 ml量瓶内，加60%甲醇至刻度线进行稀释，即得曲安奈德对照品溶液（30 μg/ml）。
2.5 曲安奈德含量测定
2.5.1 色谱条件
色谱柱Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（60：40）；流速：1.0 ml/min；检测波长：240 nm；进样量：20 μl。
2.5.2 专属性试验
分别精密吸取20 μl空白接收液、曲安奈德对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪进行检测，所得的色谱图如图1所示，由图1可知曲安奈德供试品溶液主峰与对照品溶液的出峰时间相同，且空白接收液无干扰，说明所用的方法专属性良好。
2.5.3 精密度试验
精密量取45 μg/ml的曲安奈德对照品溶液适量，按照“2.5.1”项下方法连续检测6次，所得曲安奈德峰面积的RSD为0.9%，说明所用液相色谱仪的精密度良好，适用于曲安奈德的含量检测。
2.5.4 线性和范围
将曲安奈德对照品储备液用含10%乙醇的生理盐水逐级稀释，配制成45、35、18、9、6、0.9和0.06 μg/ml系列浓度的线性溶液，摇匀后经0.45 µm滤膜过滤，精密吸取20 μl续滤液，注入液相色谱仪进行检测，以上系列浓度溶液分别进行2次检测，检测结果以主峰浓度（C）为横坐标，以主峰峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，结果显示在0.06~45 μg/ml的范围内线性关系良好，所得回归方程为A=44.003C+0.1663 (r=1.0000)。
2.5.5 重复性试验
按照“2.3”项方法分别制备同一浓度的供试液6份，按照“2.5.1”项下方法进行检测，所得曲安奈德含量的RSD为1.80%，说明所用含量测定方法的重复性良好。
2.5.6 回收率试验
在含10%乙醇的生理盐水中添加适量曲安奈德对照品储备液，配制成高、中、低浓度即18、9、0.9 μg/ml的曲安奈德供试品溶液，各浓度平行制备3份并进行测定，所得的平均回收率为102.02%，RSD为3.07%，说明该方法的准确度良好。
2.5.7 稳定性试验
精密量取曲安奈德喷雾溶液剂自制样品适量，用含10%乙醇的生理盐水分别配制成高、中、低（18 μg/ml、9 μg/ml和0.9 μg/ml）浓度的供试品溶液，摇匀，在室温下放置，于0、3、6、9、12、15、18、21和24 h时精密量取20 μl，注入液相色谱仪进行检测，所得放置24 h后的高中低浓度供试品溶液的峰面积RSD分别为0.61%、0.61%和0.29%，符合规定（RSD≤2%），说明高中低浓度的供试品溶液常温放置24 h后，样品稳定。
2.6 透皮吸收促进剂考察试验
各时间点所取的接收液按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，供试品溶液按照“2.5.1”项下方法进行检测，并计算单位面积累计透皮吸收量（Q）。
$$ Q = m_{n} /S = v C^{i}_{n} /S =(VC_{n}+V \Sigma C_{n-1}) /S $$ 式中mn为接收池中曲安奈德的质量，S为扩散池的有效渗透面积，Cin为第n次样品的校正质量浓度，v为接收池中接收液的体积，Cn为第n次样品的实测质量浓度，V为各时间点的取样量。
以时间为横坐标，以累计透皮吸收量为纵坐标，进行线性回归，线性回归方程的斜率即为透皮吸收速率（Js）。
2.6.1 乙醇用量对透皮吸收的影响
为改善曲安奈德喷雾溶液的透皮性能，又不会对皮肤造成刺激性，选取乙醇用量5%、10%和15%进行体外透皮吸收试验，计算透皮吸收速率（Js），结果见表1，表明当乙醇用量超过10%时，Js增加不显著，故当乙醇和丙二醇合用时，乙醇用量选择10%和15%。
表 1 乙醇、丙二醇单用和联用时对曲安奈德喷雾溶液体外透皮性能的影响 ($\bar x $ ±s , n=12 )渗透促透剂 质量分数（%） 回归方程 r Js (μg/cm2·h) 乙醇 5 Y=1.7509 X−6.5211 0.9990 1.7509 10 Y=3.010 9 X−8.521 0 0.9993 3.0109 15 Y=3.021 3 X−7.562 0 0.9991 3.0213 丙二醇 15 Y=3.838 9 X−3.415 0 0.9992 1.8389 20 Y=3.753 9 X−5.412 0 0.9996 3.7539 25 Y=3.751 1 X−6.232 3 0.9992 3.7511 乙醇＋丙二醇 10+20 Y=5.709 0 X−7.424 0 0.9990 5.7090* 10+25 Y=5.886 4 X−9.948 1 0.9974 5.8864* 15+20 Y=5.652 0 X−11.610 0 0.9970 5.6520* 15+25 Y=5.689 1 X−6.190 2 0.9992 5.6991* *P<0.05，乙醇和丙二醇联用时与单用时比较 2.6.2 丙二醇用量对透皮吸收的影响
基于丙二醇需要添加超过10%的浓度才能发挥促透作用的理论基础，同时结合曲安奈德喷雾溶液的特点，即需要保证药物渗透至皮肤但不过多的进入体循环，分别配制含丙二醇15%、20%和25%的曲安奈德喷雾溶液进行体外透皮试验，结果见表1，表明当丙二醇用量超过20%时，Js增加不显著，故当乙醇和丙二醇合用时，丙二醇用量选择20%和25%。
2.6.3 乙醇和丙二醇联用对透皮吸收的影响
分别配制含乙醇10%和15%联合20%和25%丙二醇的曲安奈德喷雾溶液，进行体外透皮吸收试验，结果见表1。用SPSS 21中的单因素方差分析法对各组间的透皮吸收速率进行对比分析，结果显示，乙醇和丙二醇联用时的透皮吸收速率显著高于单用时的透皮吸收速率（P<0.05）。
3. 讨论
体外透皮试验是经皮给药制剂处方筛选的重要手段，而接受介质的选择是体外透皮试验条件中的重点，其不仅需要结合药物的理化性质和处方因素，还需要在满足漏槽条件的同时不改变皮肤性质[4]。对于水溶性药物而言，生理盐水和磷酸盐缓冲液是常用的接受介质，而对于水溶性不好或脂溶性药物而言，生理盐水和磷酸盐缓冲液不能满足药物的漏槽条件，需要在其中加入乙醇、非离子表面活性剂等[5-6]。试验中曲安奈德极微溶于水，试验前期发现生理盐水作为接受介质无法满足漏槽条件，而在生理盐水中添加10%乙醇作为接收介质，既满足漏槽条件，同时不影响皮肤渗透功能，故选择含10%乙醇的生理盐水作为曲安奈德喷雾溶液体外透皮试验的接收介质。
曲安奈德喷雾溶液属于经皮给药制剂，可避免发生药物的肝肠首过效应及全身毒副作用，但由于皮肤角质层对经皮给药制剂渗透进入皮肤造成一定的阻碍，影响药物发挥治疗效果，因此，需要在经皮给药制剂中添加合适的渗透促进剂[7]。经皮给药制剂中常用的渗透促进剂种类多样，例如氮酮、萜烯类物质及多元醇，其中乙醇主要通过促进药物溶解和改变皮肤性能发挥促渗作用，丙二醇通过增加皮肤角质层中药物的溶解度发挥促渗作用[8-10]。Kiramat 等[11]发现丙二醇可显著改善口腔速溶膜剂的透皮功能。以上研究表明，药物制剂中加入乙醇或丙二醇，可增加药物的透皮功能。但众多研究发现，单用透皮吸收促进剂时的效果不如联用时，联用会产生促渗协同效果，使得药物的透皮功能达到最佳化[12-13]。基于此，本实验选择多元醇类中的乙醇和丙二醇作为渗透促进剂，并考察了乙醇和丙二醇单用和联用时对曲安奈德喷雾溶液透皮功能的影响，以获得乙醇和丙二醇单用或联用时的最佳配比，使得药物的透皮功能达到最佳化。结果显示，乙醇和丙二醇联用时的透皮吸收速率显著高于单用时的透皮吸收速率（P<0.05），且乙醇和丙二醇联用时对曲安奈德喷雾溶液的促透作用顺序为10%乙醇+25%丙二醇>10%乙醇+20%丙二醇>15%乙醇+25%丙二醇>15%乙醇+20%丙二醇，该结果可能是因为丙二醇使得乙醇更易于进入皮肤发挥作用，二者产生了协同促渗作用[14]。本研究为如何增加曲安奈德喷雾溶液及该类药物制剂的透皮功能提供了重要信息，后续还需要在此基础上继续深入研究其透皮效果和透皮机制。
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图 2 蛋白互作网络图
注：图中节点代表蛋白质，其中红色节点表示查询蛋白质，其他颜色节点表示与查询蛋白只有相互作用的其他蛋白质，空白节点表示未知3D结构的蛋白质，填充节点表示已知3D结构，连线代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系
表 1 青蒿素作用于PCOS的核心靶点
基因名称 节点度值 排名 ALB 66 1 AKT1 60 2 CASP3 53 3 SRC 51 4 EGFR 50 5 HSP90AA1 49 6 MMP9 48 7 ESR1 48 8 HRAS 47 9 PPARγ 43 10 ERBB2 41 11 MMP2 37 12 
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表 2 青蒿素与核心靶点分子对接结果
化合物 核心靶点 最低结合能（kJ/mol） 结合位点 青蒿素 MMP9 −8.2 ARG-143 AKT1 −7.9 HIS-152 ESR1 −7.9 THR-460 PPARγ −7.7 PRO-426、GLN-430、
LEU-431、PHE-432MMP2 −6.4 HIS-190
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