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清肠栓是由上海市名中医马贵同教授创制的医院制剂。该方基于溃疡性结肠炎“湿热瘀互结肠道”的关键病机，以清热化湿、活血止血立法，在锡类散、青黛散治疗黏膜溃疡的基础上优化筛选而来[1-2]。主要由三七和青黛全粉入药，五倍子和马齿苋经提取后浸膏粉入药，再加入冰片、羊毛脂，以半合成脂肪酸酯为基质制备而成的中药栓剂。
冰片为一种传统中药，清香宣散，具有开窍醒神，清热败毒的功效。现代药理学研究表明，冰片具有镇静安神、醒脑、促透、抗菌、抗炎等作用[3]。冰片常被用于肛肠外科，可避免药物的首过效应，提高药物有效性。冰片能开放并透过血脑屏障，有助于其他药物通过血脑屏障，促进疗效[4]。
冰片具有挥发性，龙脑常被作为其主要的质量控制指标，含量测定方法主要包括气相色谱法、衍生化高效液相色谱法、薄层色谱法等[5]。2020年版《中国药典》中，采用气相色谱法测定，冰片含龙脑成分不得少于55.0%，樟脑不得超过0.50%[6]。 目前，已有文献对清肠栓中三七皂苷、人参皂苷、没食子酸、靛蓝和靛玉红进行含量测定[7-8]，故本实验采用气相色谱法对清肠栓中冰片含量进行测定，并计算龙脑、异龙脑的相对含量，为进一步提高清肠栓的质量控制提供有效依据。
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7820A型气相色谱仪、氢火焰离子化检测（FID）（美Agilent 公司）；225D-1CN型电子分析天平、BSA124S型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，精度：十万分之一）；S450H型超声波清洗器（德国Elma）。
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清肠栓为院内制剂室提供（批号：210420-210425、211018、211020、211022、211025、190107、190114、190121、190304、190311、190318、190408、190415、190422、190506、190513和200302）；樟脑对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：2814，纯度：95.0%）；龙脑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110881-201709，纯度：99.6%）；异龙脑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111512-201904，纯度：98.4%）；水为超纯水（实验室自制）；乙酸乙酯（上海凌峰化学试剂有限公司，分析纯）。
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采用Agilent7890A型气相色谱仪FID检测器；DIKMA DM-Wax聚乙二醇20000（PEG-20M）毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；进样口温度为250 ℃；检测器（FID）温度为250 ℃；柱温140 ℃；空气流速为450 ml/min，氢气燃气流速为50 ml/min；尾吹气为25 ml/min；分流比为20:1，进样量为1 µl。理论板数按龙脑峰计算应不低于2 000。
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称取樟脑对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯溶解，制成每1 ml含樟脑0.1 mg的对照品溶液。另取龙脑、异龙脑对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯溶解，制成每1 ml含龙脑0.3 mg、异龙脑0.2 mg的混合对照品溶液。
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取清肠栓（批号：200302）样品10粒，研细，取约60 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加乙酸乙酯8 ml，超声（频率37 kHz，功率800 w）处理30 min，放冷，加乙酸乙酯至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
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按清肠栓制剂处方比例，配制缺冰片的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备，即得。
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精密吸取樟脑对照品溶液、龙脑和异龙脑对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各1 µl，按“2.1”项色谱条件下方法分别进样测定，结果樟脑、异龙脑和龙脑对照品的理论板数分别为88 684、107 331、108 387，远大于规定的2 000。供试品溶液色谱图中，未检出与樟脑对照品溶液保留时间相同的色谱峰，阴性对照溶液色谱图中在与龙脑、异龙脑相同保留时间处无干扰峰，表明该方法专属性良好。色谱图见图1。
图 1 樟脑对照品（A）、龙脑和异龙脑对照品（B）、阴性对照（C）和供试品溶液（D）
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分别精密称取龙脑对照品14.92 mg、异龙脑对照品10.25 mg、樟脑对照品4.83 mg，置同一10 ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml含龙脑1.492 mg、异龙脑1.025 mg、樟脑0.483 mg的混合对照品溶液，作为贮备液。
精密吸取5份贮备液各1 ml，加乙酸乙酯分别稀释50倍、20倍、5倍、2倍、1倍；分别精密吸取5个不同浓度的龙脑、异龙脑、樟脑混合对照品溶液，分别进样1 µl，按按“2.1 色谱条件”项下的方法测定，以进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程分别为：Y1=283.4X1+1.320（r=1.000，n=5）；Y2=283.5X2+0.8597（r=1.000，n=5）；Y3=276.9X3+0.5444（r=1.000，n=5）。线性范围分别为 0.0299~1.497µg、 0.0205~1.025µg、 0.0097~0.4830µg。
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精密吸取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1 ”项的方法测定，重复进样6次，测定峰面积。结果龙脑、异龙脑、樟脑峰面积RSD分别为0.3%、0.4%、0.6%（n=6），表明仪器精密度良好。
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精密吸取同一供试品溶液（批号：200302），室温下分别放置0、4、8、12、16、20、24 h，按“2.1 色谱条件”项下的方法测定，记录峰面积。结果樟脑未检出，龙脑与异龙脑峰面积的RSD分别为1.6%和1.5%，表明供试品溶液在室温下放置24h稳定。
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精密称取清肠栓样品粉末60 mg（批号：200302），精密称定，平行称取6份，按“2.3供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，按“2.1”项方法测定，结果均未检出樟脑，龙脑和异龙脑平均含量的RSD分别为0.8%和1.1%（n=6），表明该方法的重复性良好。
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称取清肠栓样品粉末30 mg（批号：200302），精密称定，平行称取6份，分别精密加入龙脑、异龙脑、樟脑对照品溶液，按“2.3” 项方法制备供试品溶液，按“2.1”项方法测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。
表 1 龙脑回收率试验（n=6）
成分 原有量（mg） 加入量
（mg）测得量
（mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）龙脑 0.47 0.50 0.97 100.8 101.0 0.51 0.48 0.50 0.98 101.6 0.47 0.50 0.97 101.2 0.47 0.50 0.97 100.8 0.47 0.50 0.97 100.2 0.47 0.50 0.97 101.4 异龙脑 0.28 0.29 0.58 102.8 102.5 1.66 0.28 0.29 0.59 104.5 0.28 0.29 0.58 104.2 0.28 0.29 0.57 100.4 0.28 0.29 0.58 102.1 0.28 0.29 0.57 100.8 樟脑 0.00 0.13 0.12 97.06 99.69 3.77 0.00 0.13 0.12 93.91 0.00 0.13 0.13 102.6 0.00 0.13 0.13 99.43 0.00 0.13 0.13 104.2 0.00 0.13 0.13 101.0 -
取清肠栓制剂2019、2021年共20个批次的样品，按“2.3”项方法制备供试品溶液，再按“2.1”项方法测定，20个批次均未检出樟脑。样品中龙脑和异龙脑含量见表2（表中1~10为2019年样品，11~20为2021年样品）。
表 2 清肠栓样品含量实验
样品序号 龙脑（mg/g） 异龙脑（mg/g） 冰片（mg/g） 1 14.23 8.509 22.74 2 14.19 8.564 22.76 3 14.38 8.665 23.05 4 14.26 8.569 22.83 5 14.28 8.511 22.79 6 14.21 8.571 22.78 7 14.24 8.446 22.68 8 14.41 8.632 23.04 9 14.13 8.329 22.46 10 13.89 8.401 22.29 11 18.76 11.35 30.11 12 18.60 11.20 29.80 13 18.93 11.39 30.32 14 19.03 11.37 30.40 15 18.65 11.26 29.91 16 18.82 11.38 30.19 17 18.89 11.35 30.24 18 18.74 11.28 30.02 19 18.94 11.35 30.29 20 18.88 11.39 30.27 -
乙酸乙酯对冰片具有较好的溶解性，并且样品中其他干扰成分的溶出较少，故选择其作为提取溶剂。本实验考察了不同提取时间（15 min、30 min、45 min）对样品提取效果的影响，观察比较不同条件处理后供试品溶液色谱情况，根据含量结果选择提取时间为30 min。最终以乙酸乙酯为提取溶剂，超声处理30 min作为供试品制备时的提取方式。
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柱温的选择：由于2020年版《中国药典》中冰片含量测定选择的注温为140 ℃，而查阅文献，部分实验者选择的柱温为160 ℃[9]，因此，我们分别选择140 ℃和160 ℃进行试验，根据出峰时间及峰形比较，最终选择140 ℃作为实验条件。色谱柱的选择：实验研究使用的两种色谱柱分别为DIKMA DM-Wax（PEG-20M）毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；Agilent HP-INNOWAX（PEG-20M）毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm），比较两种色谱柱的塔板数，实验显示色谱峰分离度良好，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小，此方法具有普遍性，故最终选择本实验室常用的DIKMA DM-Wax色谱柱。樟脑检出限和定量限确定：检测限及定量限采用信噪比法确认，当信噪比（S/N）为3∶1时，樟脑检出限为1.4 μg/g；当信噪比（S/N）为10∶1时，其定量限为4.6 μg/g。
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2020年版《中国药典》中，冰片的描述为冰片（合成龙脑），其中对樟脑的检测要求为不得超过0.50%。本次实验，通过查阅文献，参考其它含冰片制剂中对樟脑残留的检测方法[10]，对清肠栓样品进行樟脑含量测定，发现成品栓剂中均未检测到樟脑，证明我院制剂室所用冰片符合药典的相关规定。
2020年版《中国药典》是以龙脑作为冰片的含量测定指标，但通过查阅文献可知，近年对冰片的含量测定中，多以龙脑与异龙脑总量来计算冰片的含量，[11-14]。考虑到本次实验是完善清肠栓的内控标准，提高制剂的稳定性，故本实验以龙脑和异龙脑的总量来计算冰片的含量。
综上所述，本方法为冰片中龙脑、异龙脑的含量测定和樟脑限度检查制定提供参考，操作简单、重复性良好、结果准确，可用于清肠栓中冰片的质量控制。
Determination of camphor residue and borneol content in Qingchang Suppository by GC
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摘要:
目的 建立清肠栓中樟脑残留物和冰片含量的气相测定方法。 方法 采用气相色谱法，色谱柱为Agilent毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm），柱温为140 ℃，进样口温度250 ℃，检测器（FID）温度为250 ℃。 结果 樟脑、龙脑和异龙脑在0.0299~1.497µg（r=1.000）、0.0205~1.025µg（r=1.000）、0.0097~0.4830 µg（r=1.000）范围内呈现良好的线性关系。精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2%，平均加样回收率分别为99.7%、101.0%、102.5%。 结论 该方法准确、可靠、简便快速，可用于清肠栓中龙脑含量的测定。 Abstract:Objective To establish a gas chromatography for simultaneous determination of camphor residue and borneolum content in Qingchang Suppository. Methods Gas chromatograph method was used. The chromatographic column was Agilent capillary column(30 m×0.25 mm×0.25 µm). The column temperature was 140 ℃. The sample injection temperature was 250 ℃. The FID detector temperature was 250 ℃. Results Camphor, borneol and isoborneol content showed good linear in the extent of 0.0299~1.497(r=1.000), 0.0205~1.025(r=1.000), 0.0097~0.4830 µg (r=1.000). RSDs of precision, stability and repeatability test results were less than 2%. The recovery was 99.7%, 101.0%, 102.5%. Conclusion This method is simple and quick with accurate result, which could be used for the content determination of Borneol in Qingchang Suppository. -
Key words:
- GC /
- Qingchang Suppository /
- Camphor /
- Borneol /
- Isoborneol /
- Content determination
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细菌感染是一类高发病率和高致死率疾病，而细菌耐药给抗细菌感染治疗带来了严峻挑战，预计到2050年,耐药细菌感染将导致全球上千万人死亡[1]。抗生素作为首选药物直接杀灭细菌对细菌带来“选择性压力”，即耐药现象，它将伴随着抗生素在临床的使用而广泛发生[2]。因此，亟需设计和研发新型的给药策略以改善细菌乃至耐药菌感染的预防和治疗效果。
创伤弧菌（Vibrio Vulnificus），是一种嗜盐性G−菌，广泛存在于亚热带和热带海域，在我国浙江、福建和广东沿海海域均有分布。伤口感染后表现为皮肤坏死、筋膜炎和坏疽，严重感染者需大面积清创甚至截肢。更加严重的会引起原发性败血症，严重败血症患者的病死率超过了50%[3]。全球范围内创伤弧菌对多种抗菌药物存在不同程度的耐药性，如在中国海域创伤弧菌对链霉素、庆大霉素和头孢唑啉的耐药性分别达45.45%、93.94%和100%[4]。研发防治创伤弧菌感染新型疗法对于控制感染具有重要意义。创伤弧菌溶血毒素A（VvhA）是创伤弧菌向胞外释放的唯一外毒素，也是成孔毒素CDC家族中的一员，为胆固醇依赖型成孔毒素，是引发细胞、组织损伤的重要毒力因子。成孔毒素在细菌感染的发病机制中发挥了重要作用，VvhA通过在细胞膜上低聚形成有效直径约为1 nm的小孔，导致胶体渗透使细胞溶解[5]。目前，毒力因子靶向疗法已成为抗生素耐药感染的替代疗法。阻断毒素不仅能避免其对机体产生的严重损害并能阻碍细菌在体内的存活。这种抗毒力因子的方式并非直接杀灭细菌，且不易发生耐药现象[6]。体外研究已经阐明了VvhA对上皮细胞、脐静脉内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等均具有一定的细胞毒性[7]。Qin等发现VvhA可以触发巨噬细胞RAW264.7的炎症反应[8]。2013年，Zhang等提出“纳米海绵”的载体系统，能有效吸附金黄色葡萄球菌的成孔毒素从而起到解毒作用[9]。本研究将巨噬细胞膜和人工脂质体杂合，以VvhA为成孔毒素模型，制备了巨噬细胞脂质体杂合载体并进行表征，考察巨噬细胞膜杂合脂质体的体内外解毒能力，为进一步创伤弧菌感染的抗毒素治疗提供实验依据。
1. 材料和方法
1.1 实验仪器和材料
胎牛血清（澳洲EallBio公司）；RPMI1640培养基（美国Gibco公司）；DMEM培养基（美国Hyclone公司）；卵磷脂（艾伟拓医药科技有限公司）；DSPE-mPEG2000（Laysan Bio公司）；CCK-8试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；脂质体挤出器（美国Avanti Polar Lipids公司）；Synergy 2酶标仪（美国Bio-Tek公司）；马尔文粒度电位仪（英国Malvern）；R206D旋转蒸发仪（上海申生公司）；H2050R-1台式高速冷冻离心机（湖南湘仪公司）。VvhA毒素蛋白由本实验室合成。小鼠巨噬细胞Raw 264.7；人结肠上皮细胞（NCM460）（中科院上海细胞库）；BALB/c小鼠（雌性，6~8周龄，体重18~20 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司），动物实验经过海军军医大学实验委员会的批准，并按照动物伦理学进行。
1.2 巨噬细胞膜杂合脂质体的制备
1.2.1 Raw 264.7巨噬细胞培养及细胞膜提取
用DMEM高糖培养基，10% FBS，5% CO2，温度37 ℃正常培养Raw 264.7巨噬细胞。参考文献方法提取巨噬细胞膜[10]：细胞刮刀获取细胞，4 ℃预冷的TM缓冲液洗涤细胞2次并重悬细胞，使浓度约为2.5×107细胞/ml。将细胞悬液置于−80 ℃，反复冻融3轮，探头超声破碎细胞（5 min，功率44 W）得到细胞匀浆，加入1 mol/L的蔗糖溶液，4 ℃ 2 000 g离心10 min去除细胞核和未裂解细胞，上清4 ℃ 3 000 g离心30 min以收集细胞膜。细胞膜用含有0.25 mol/L蔗糖的TM-buffer重悬液，4 ℃ 3 000 g离心1 h洗涤，离心收集PBS重悬液，−80 ℃保存。
1.2.2 巨噬细胞膜杂合脂质体制备
采用薄膜水化-挤出法制备巨噬细胞膜杂合脂质体（MM-PLs）[11]。将蛋黄卵磷脂（EPC）、胆固醇（CHO）和DSPE-mPEG2000以4∶4∶1的摩尔比用二氯甲烷溶解完全，加入100 ml茄形瓶中，室温水浴进行旋转蒸发去除二氯甲烷，使脂质材料在茄形瓶壁中成膜，完全去除二氯甲烷后加入适量巨噬细胞膜和纯水水化，水化后冰浴超声5 min，脂质体挤出器分别连续挤出通过400、200、100 nm聚碳酸酯膜各20次以制备MM-PLs。
对照组巨噬细胞膜囊泡（MMVs）和脂质体（PLs）的制备同巨噬细胞膜杂合脂质体。将适量巨噬细胞膜悬液室温水化1 h，水浴超声和挤出后得到MMVs。脂质体的制备为薄膜水化法，材料方法同上。
1.3 巨噬细胞膜杂合脂质体的表征
马尔文粒径仪测定MM-PLs、MMVs、PLs的粒径和Zeta电位。将一定浓度的MM-PLs滴加到碳支持膜（铜网）上，待晾干后再滴加醋酸铀水溶液(1%,W/V)进行负染，透射电镜（TEM）观察形态。
1.4 巨噬细胞膜杂合脂质体体外中和毒素能力评价
1.4.1 体外溶血实验评价巨噬细胞膜杂合脂质体中和VvhA能力
BALB/c小鼠（雌性16~18 g，6~8周龄），用3%异氟烷麻醉2~3 min后下颌下静脉抗凝取血，低温离心5 min（300 g），弃上清液后加入PBS重悬，得到小鼠红细胞，PBS稀释成2.5%红细胞悬液（V/V），4 ℃保存备用。
分别取VvhA（2 mg/ml）5、10、20、40 μg，各加入相应量的PBS定容，再加入1 ml 2.5%红细胞悬液混匀，置于37 ℃孵育1 h，室温离心5 min（2 000 g）后取上清液，1×PBS 1∶1稀释后用酶标仪测定其在540 nm处的A值（n = 3）。取40 μg VvhA，分别加入不同MM-PLs的量（38、190、380、760 μg），重复上述溶血实验（n=3），PLs和MMVs作为对照组，考察MM-PLs对毒素吸附的量效关系。TritonX-100组作为阳性对照（100%溶血），PBS组作为阴性对照（0%溶血）。根据以下公式对各个样品的溶血程度计算溶血率：
$$ \begin{array}{c} \text{溶血率}(\%)= [(A_{\text{样品}}-A_{\text{阴性对照}})/\\(A_{\text{阳性对照}}-A_{\text{阴性对照}})] \times 100\% \end{array} $$ 1.4.2 细胞毒性实验评价载体的毒素中和效率
文献表明VvhA对上皮细胞有一定的细胞毒性[7]。本实验采用结肠上皮细胞（NCM460）为细胞模型，CCK-8法测定细胞活力，以研究MM-PLs的细胞水平解毒能力。NCM460按5 000个/孔接种于96孔板，37 °C、5% CO2培养过夜。将50 μl MM-PLs、PLs、MMVs和生理盐水分别与不同浓度的VvhA（10、50、100、200和400 μg/ml）室温孵育3 h。而后加入96孔板中，与NCM460在37 ℃下共孵育12 h。孵育完毕后每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续37 ℃下孵育1 h，酶标仪测量450 nm处OD值，计算细胞存活率。
1.5 巨噬细胞膜杂合脂质体动物模型解毒能力评价
1.5.1 皮肤解毒能力
取BALB/c小鼠（雌性，18~20 g，6~8周龄）30只，随机分为5组（生理盐水组、VvhA组、PLs组、MMVs组和MM-PLs组）。小鼠后肢脱毛处理，生理盐水组为阴性对照，实验组将80 μg VvhA毒素皮下注射至后肢，再分别将生理盐水、PLs、MMVs和MM-PLs在同一部位皮下注射，观察皮肤组织的溃烂愈合情况。72 h后处死小鼠，取注射部位的皮肤和肌肉，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片后进行H&E染色。
1.5.2 小鼠生存率评价
取BALB/c小鼠（雌性，18~20 g，6~8周龄）40只，随机分为4组（VvhA组、PLs组、MMVs组和MM-PLs组）。小鼠腹腔注射致死剂量的VvhA（10 mg/kg），5 min后分别腹腔注射一定剂量的生理盐水、PLs、MMVs和MM-PLs。观察各组小鼠精神状态及进食情况，并记录小鼠生存率。
1.6 统计学方法
采用GraphPad Prism 8.2统计学软件进行统计分析。统计方法采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 巨噬细胞膜杂合脂质体的表征
MMVs平均粒径为120.6 nm，PLs的平均粒径为93.9 nm，MM-PLs的平均粒径为101.1 nm（图1A），MMVs、PLs和MM-PLs的分布均较窄（图1B）。在杂合巨噬细胞膜后，MM-PLs Zeta电位值（−22.9 mV）介于MMVs（−10.4 mV）与PLs（−37.7 mV）之间（图1C）。TEM结果显示，MM-PLs呈规则类球形，大小均一，粒径约100 nm（图1D），与PLs的形态、大小类似，说明巨噬细胞膜的加入对脂质体的纳米微粒性质无显著影响。
图 1 MM-PLs的理化性质表征(n=3，$\bar x $ ±s).A. MMVs、PLs和MM-PLs的粒径；B. MMVs、PLs和MM-PLs的分散系数；C. MMVs、PLs和MM-PLs的电位；D. MM-PLs的透射电镜图像。2.2 巨噬细胞膜杂合脂质体体外中和毒素能力评价
2.2.1 溶血实验评价毒素的中和能力
结果显示，40 μg的VvhA可以使1 ml 2.5%红细胞悬液完全溶血；380 μg的MM-PLs几乎可以完全中和40 μg的VvhA毒素蛋白，抗溶血率达到97.03%，而PLs和MMVs组均产生溶血现象，无中和毒素能力（图2）。
图 2 体外溶血实验（n = 3）A、 B：VvhA的溶血量效关系；C、D：MM-PLs吸附VvhA毒素蛋白的量效关系；E、F：MMVs、PLs和MM-PLs与VvhA孵育后对红细胞的溶血百分比；***P<0.001，与MMVs、PLs组比较。2.2.2 体外细胞毒性研究
结果显示，细胞活力与VvhA呈剂量依赖性，与对照组相比MM-PLs组显著提高细胞活力，具有一定的毒性抑制作用，而PLs组和MMVs组也具有一定的毒素吸附能力，但随着毒素浓度的增加，这种毒素中和能力显著降低（图3）。
图 3 NCM460细胞毒性测定结果（n = 3）Saline：生理盐水；MMVs：巨噬细胞膜囊泡；PLs：脂质体；MM-PLs：巨噬细胞膜杂合脂质体。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与MMVs、PLs、Saline组比较。2.3 巨噬细胞膜杂合脂质体评价体内解毒能力
2.3.1 皮肤解毒实验
结果显示（图4），阴性对照生理盐水组注射部位皮肤光滑完整，阳性对照组VvhA组注射部位有明显的皮肤组织溃烂， MMVs组和PLs组与阳性对照组情况类似，有面积相近的皮肤溃烂；MM-PLs组皮肤无明显损伤。H&E染色结果表明，VvhA组，VvhA+MMVs组和VvhA+PLs组的皮肤和相邻肌肉组织结构有明显炎症细胞浸润及组织细胞坏死凋亡现象，而VvhA+MM-PLs组组织结构完整，无炎症浸润及凋亡发生。
2.4 VvhA沾染小鼠生存率评价
生理盐水组、MMVs组和PLs组小鼠在给予VvhA 6 h后陆续出现精神萎靡、被毛竖立、食欲减退、呼吸困难等症状，在注射毒素后 72 h内陆续死亡，而MM-PLs组小鼠在给予毒素后 24 h内死亡1只，48 h内共死亡2只，其余全部存活，存活率为80%（图5）。巨噬细胞膜杂合脂质体有较好的中和毒素效果，对模型动物产生保护作用。
3. 讨论与小结
细菌感染过程中，释放的毒力因子（如成孔毒素）对机体有较大的毒性作用[12]。因此，中和细菌毒素能够抑制细菌的存活与繁殖，同时减少其对组织的损伤[13]。抗毒素治疗针对细菌分泌的毒力因子，不直接对细菌产生杀伤作用，因而不易产生耐药现象[14]。不同的成孔毒素结构不一，但有相似的细胞膜作用机制，通过与细胞膜表面的特异性受体结合，聚集形成孔道，从而改变细胞的通透性并引发毒性[15]。本文将巨噬细胞膜与脂质体结合，既充分利用巨噬细胞作为VvhA毒素蛋白的天然靶点，其细胞膜具有特有的毒素捕获能结合能力，又发挥了人工脂质体扩大毒素聚集于载体膜的空间优势。PEG修饰实现纳米载体表面“隐形”修饰，避免RES系统的捕获，增加循环的稳定性。所制备的杂合载体能够中和VvhA，抵抗毒素的溶血作用和细胞毒性作用，我们也发现未经杂合的巨噬细胞膜囊泡和脂质体也有一定的抑制细胞毒性作用（一定的抗溶血性），推测巨噬细胞膜可吸附部分毒素，但无脂质有效扩大毒素的吸附空间，而有研究表明，磷脂双分子层具有蛋白质可插入特性[16]，因此脂质体也可吸附少量毒素，但是将细胞膜与脂质体杂合能有效地提高毒素的结合。文献表明， VvhA对上皮细胞、肝脏细胞、内皮细胞均具有一定的毒性[17]，细胞毒实验结果表明所构建的杂合载体能够有效吸附并中和毒素的毒性，减少细胞毒性。而小鼠皮肤解毒、小鼠注射毒素后的生存曲线结果均表明经过杂合载体毒素的吸附结合，在体内能够很好的中和VvhA毒性，对动物具有抵抗类毒素的保护作用。
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表 1 龙脑回收率试验（n=6）
成分 原有量（mg） 加入量
（mg）测得量
（mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）龙脑 0.47 0.50 0.97 100.8 101.0 0.51 0.48 0.50 0.98 101.6 0.47 0.50 0.97 101.2 0.47 0.50 0.97 100.8 0.47 0.50 0.97 100.2 0.47 0.50 0.97 101.4 异龙脑 0.28 0.29 0.58 102.8 102.5 1.66 0.28 0.29 0.59 104.5 0.28 0.29 0.58 104.2 0.28 0.29 0.57 100.4 0.28 0.29 0.58 102.1 0.28 0.29 0.57 100.8 樟脑 0.00 0.13 0.12 97.06 99.69 3.77 0.00 0.13 0.12 93.91 0.00 0.13 0.13 102.6 0.00 0.13 0.13 99.43 0.00 0.13 0.13 104.2 0.00 0.13 0.13 101.0 
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表 2 清肠栓样品含量实验
样品序号 龙脑（mg/g） 异龙脑（mg/g） 冰片（mg/g） 1 14.23 8.509 22.74 2 14.19 8.564 22.76 3 14.38 8.665 23.05 4 14.26 8.569 22.83 5 14.28 8.511 22.79 6 14.21 8.571 22.78 7 14.24 8.446 22.68 8 14.41 8.632 23.04 9 14.13 8.329 22.46 10 13.89 8.401 22.29 11 18.76 11.35 30.11 12 18.60 11.20 29.80 13 18.93 11.39 30.32 14 19.03 11.37 30.40 15 18.65 11.26 29.91 16 18.82 11.38 30.19 17 18.89 11.35 30.24 18 18.74 11.28 30.02 19 18.94 11.35 30.29 20 18.88 11.39 30.27
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