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河豚毒素（TTX）是一种海洋生物毒素。TTX首次在河豚中提取得到，而后在多个海洋动植物和陆地部分动物中发现。TTX是一种电压门控钠通道（VGSCs）的阻滞剂，能够选择性地与VGSCs外前庭上的α-亚基结合，阻止钠离子进入通道，从而产生药理活性。TTX具有镇痛、戒毒、抗心律失常等作用，此外，还有降低心血管药物不良反应的作用。目前已经有许多TTX在研制剂，研究者也正在针对TTX的剂型进行研究。本文就TTX的来源、结构性质、作用机制、药理活性、在研剂型进行综述，旨在为下一步TTX的药用开发提供参考。
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1894年，日本学者田原良纯在日本药物学会的月度会议上介绍了从河豚卵巢水提取物中分离出的毒素，这是TTX的首次面世。1909年他提出河豚只含有1种有毒物质，并将其命名为河豚毒素[1]。1950－1957年间，横尾晃、津田藤介等人首先从红鳍东方鲀、紫色东方鲀卵巢中分离得到结晶态的TTX [2-4]。目前河豚毒素的实验室合成已经实现[5]，但尚未实现产业化。
起初，人们认为TTX只存在于河豚科的河豚中，但自不同纲属的两栖动物中发现TTX，打破了以往认为它仅存在于鲀科鱼类中的学说[6]。此后，在多个种类的海洋动植物和陆地动植物中都发现了TTX的存在，如甲藻、红色石灰质藻类、节肢动物、棘皮动物、软体动物、蝾螈和青蛙等。在海洋和淡水环境的沉积物中也发现了TTX[7]，进而产生了生物体内发现的TTX到底是内源性的（由河豚自身产生）还是外源性的（从外部获取并积累）争议。
对于TTX的来源，目前有两种理论：外因说和内因说。日本的清水、松居是最早提出“外因说”的学者。他们用含有TTX的饲料来喂养人工养殖的无毒河鲀，结果河鲀由无毒转变为有毒，由此推论河豚体内的TTX可能是外源性的[8]。2005年，Cheng和Wu 等[9-10]提出TTX是由外界细菌产生的，他们从河豚体内提取出36种细菌，包括弧菌、芽孢杆菌、假单胞菌等。Simidu等[11]通过实验发现溶藻弧菌和互生单胞菌属产TTX较多，但细菌能否产生TTX取决于菌株。Noguchi等[12]的研究表明河豚内的TTX可能来源于其体内的共生细菌，产生TTX的是这些共生细菌而非河豚本身。
内因说认为河豚鱼体内的TTX来源于河豚体内的微生物或是某些生理过程的产物。1998年，Matsumura等[13]以星点东方鲀成熟的卵细胞进行人工授精及胚胎培育，发现胚胎中TTX含量在孵化过程中有所增加，由此认为TTX是河豚胚胎发育的产物。有报道认为河豚体内的TTX可能不是直接来自细菌，也有可能是河鲀鱼与共生细菌共同的产物，并随生长发育逐渐积累[14]。目前大多数研究者认为河豚体内的TTX是由食物链累积和体内微生物产生这两种方式共同形成的。
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河豚毒素（TTX）的分子式为C11H17O8N3，分子量为319.27，为氨基全氢化喹唑啉型化合物，呈独特的笼形结构（见图1），杂环含2个氮母核，含有1个碳环、1个胍基、6个羟基，在C-5和C-10位有1个与半醛糖内酯连接的分开的环[15]。热性质稳定，在碱性溶液中易降解，微溶于水、无水乙醇、乙醚，几乎不溶于其他有机溶剂，易溶于有机酸和无机酸水溶液，log Kow=−6.21（est），25 ℃时的比旋度为−8.64°（在8.55%稀醋酸中），其pKa在水中为8.76，在50%乙醇中为9.4[16]。
图 1 河豚毒素（TTX）的结构
TTX毒性很强，经腹腔注射对小鼠的LD50为8 μg/kg，目前没有特效解毒剂。常温下，提取获得的TTX为无色晶状固体，固体状态很稳定，但其水溶液易水解，温度越高分解速度越快；当助溶剂为pH 4.05醋酸溶液时，放置30 天的常规TTX注射液含量由99.20％下降到93.88%（25 ℃）或65.57%（40 ℃）[17]。
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TTX是一种电压门控钠通道（VGSCs）的阻滞剂，它能够选择性地结合到VGSCs外前庭上的α-亚基，阻止钠离子进入通道，从而产生抑制兴奋的作用[18]。从结构上看，TTX的胍基与钠离子通道内受体蛋白的羰基相互作用，阻滞离子进入通道，继而产生神经、肌肉的麻痹。TTX与钠离子通道是1∶1的结合，即1分子毒素结合1个钠通道，其结合是可逆的，并且与K+、Mg2+、Ca2+等带正电荷的离子竞争受体。根据对河豚毒素的敏感性，VGSCs可分为 TTX 敏感型（TTX-s）和 TTX 耐受型（TTX-r）[19]，分别介导激活电压较低、失活较快的快钠电流和激活电压高、失活较慢的慢钠电流。
研究表明，TTX对钠离子通道的影响可能是其镇痛的机制。在 VGSC家族中有6个 TTX-s 钠离子通道成员（Nav 1.1 ~1.4，1.6，1.7）可以被 TTX阻断，而其他的钠离子通道亚型是 TTX-r 钠离子通道，不能被TTX阻断[20]。TTX可以选择性抑制膜电压，使通道难以打开，从而抑制神经冲动的发生和传导，造成神经肌肉丧失传递兴奋的能力。有基因研究表明，在河豚体内有非芳香族氨基酸（Asn）和Cys残基存在于河豚Nav1.4通道的域I，这与河豚的TTX抗性相关，将这2个残基引入到对TTXs敏感的大鼠Nav1.4通道后，大鼠也具有了抗性[21]。
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镇痛是目前TTX在临床应用上研究最多的方向。作为典型的钠离子通道阻滞剂，TTX可以与吗啡等多种镇痛药联用，以发挥出比单一镇痛药更好的效果。陈学军等[22]进行了TTX和吗啡单独或联用对腹腔注射醋酸小鼠的扭体实验，考察其镇痛效果。结果显示当TTX剂量范围在0.0312~4 μg/kg时能剂量依赖性地抑制醋酸扭体小鼠的疼痛；固定TTX用量在0.125 μg/kg，联合使用剂量范围在1.95~31.2 μg/kg的吗啡，各剂量组与TTX和吗啡单一使用比较，扭体抑制率差异均有统计学意义（P<0.01）。这说明两者联用使得低剂量吗啡镇痛效应增强，降低了其不良反应，比单一使用具有更好的镇痛效果。TTX与因得克（indoxacarb）联用证明了TTX能够抑制甲醛引起的炎症性疼痛和水肿[23]。TTX在临床上使用也效果显著，以它为主药用于癌症晚期患者镇痛的注射剂曾于加拿大进行了24例志愿者实验，通过单盲实验确定TTX与阿片类药物相比具有良好的镇痛作用，且在停止注射后有长效镇痛的作用。这个附加的镇痛作用在第10天左右达到峰值，随后开始减小[24]。后来他们进行了Ⅱ期临床试验，通过对更大样本量的志愿者群体进行更详细的实验，对不同分组给予不同给药方案，结果表明肌内注射TTX的一般耐受性良好，在每日30 mg、分2次给药时，4 天内是安全的[25]。
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将TTX应用于戒毒和药物成瘾性戒断的治疗中，在临床上也有良好的表现。中等成瘾程度的戒毒者每日1次注射10 μgTTX，5~7天为1个疗程就能很好地控制毒瘾，并大大减轻了常规戒毒方法中常出现的戒毒综合征[26]。随后还出现了喷雾剂型的TTX戒毒制剂，改善了毒瘾患者用药时的便携度和及时性[27]。
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相比较于常用的抗心律失常药，TTX能够选择性地阻断Na+通道而不影响其他离子通道，减少了引起不良反应的概率，降低了用药风险。朱成华等[28]通过建立小鼠BaCl2心律失常模型和大鼠乌头碱心律失常模型，将微量TTX与心得安、利多卡因等抗心律失常药合用，TTX可增强抗心律失常药的疗效而不产生毒性影响。现国内已有以TTX为主药制成的抗心律失常药[29]。
对于心血管疾病，由于TTX的毒性反应中存在低血压反应，实验显示5×10−4 μg/g剂量就有明显的降压反应[30]。有研究者对多种动物进行了在体或离体实验，静脉注射一定剂量TTX后发现它对各种动物均有不同程度的降压作用。TTX没有直接扩张血管的作用，但可抑制心脏，其降压作用与抑制心脏有关[31]。
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①预防肾功能衰竭。Bergman等[32]建立了单侧大鼠肾切除模型，对大鼠进行60 min缺血处理后再灌注，肌内注射不同剂量TTX。结果显示，2~4 μg/kg的TTX对急性缺血性肾衰具有保护作用，分组实验则证明肾衰前后注射TTX都具有同样作用，但作用机制尚不明确。②用作皮肤瘙痒症状的止痒剂，能止痒并促进恢复。③治疗前列腺病症。TTX对多种细菌都有抑制作用，能够有效缓解细菌感染引起的前列腺炎症[33]。④对肺癌具有一定治疗作用。将河豚肝脏加水煎煮2~2.5 h，收集上层河豚肝油，将TTX溶于河豚肝油并加入香叶油、白术油和鸦胆子油等辅料制备成药，通过构建免疫缺陷型模型鼠来验证其对肿瘤生长的影响，结果与对照组相比该药物抑制肿瘤细胞生长效果明显，但起作用的具体成分难以判断[34]。
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根据TTX不同药理作用，可将它制备成多种剂型以发挥或提高其有效性，目前已报道的包括口服制剂、喷雾剂、气雾剂、注射剂、可植入式渗透微泵或栓剂等。
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口服制剂是最常见的给药剂型之一，但对TTX而言，液态口服制剂需要达到注射剂数十倍的剂量才能起到相同的效果。研究证实TTX在小肠液中稳定，故可将其制成胶囊剂或片剂，根据情况填充液体或半固体，成药辅料以乳糖、硬脂酸盐、微晶纤维素、交联羧甲纤维素等为优选[35]。口服制剂不仅增加了患者服用便捷性，而且患者无需住院就可安全使用，也更利于药物的储藏和运输[36]。有研究者制备了载河豚毒素的微囊[37]，使用挤出滚圆（Ex-Sp）和流化床处理制得，样品在2～12 h持续释放，累计释放率达80%，在40 μg/kg剂量取得最优镇痛效果。研究者测得河豚毒素注射液6 μg/kg静脉注射的t1/2为0.92 h，载药微囊150 µg/kg灌胃给药，测得cmax为0.88 ng/ml，t1/2约14.5 h，tmax约为5 h。
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呼吸道给药途径包括鼻腔、口腔和舌下黏膜等部位，其吸收率也不低于肌内或静脉注射，现有气雾剂、喷雾剂和粉末吸入剂等形式。通过混合稀释剂、抛射剂、稳定剂、皮肤助渗剂等多种药用辅料使TTX在喷射装置内保持稳定，制成喷雾剂形式的戒毒、镇痛用TTX制剂，使用十分方便[27]。
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国外早以TTX注射剂作为局麻剂和戒毒剂，如TTX与吗啡联用作为手术所需局麻剂。加拿大WEX制药公司研制了TTX注射剂，其申请的专利中虽未公开特定溶剂，但最有可能为极性溶剂，如氢氧化物和醇化物。该TTX注射剂用于缓解化疗和晚期癌症患者的剧烈疼痛，临床试验效果良好，在每日不超过30 μg的剂量条件下表现出非常好的镇痛效果。在30 μg给药剂量时，其cmax为0.58 ng/ml，tmax约为1.5 h，t1/2约为4.5 h[38]，现已进入Ⅲ期临床试验[39]。该公司在国内申请的专利中也列出了其对于TTX可能的剂型制备方法，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、贴剂、乳膏剂等多种剂型，同时TTX与多种药物联合使用有协同治疗作用，如抗癌药顺铂、卡铂、奥沙利铂和长春新碱等[40]。
TTX水溶液对温度敏感，可将其制成冻干制剂，以获得稳定的可注射制剂，但其用于临床的剂量均为微克级。微量的TTX冻干脱水后无法形成所需要的固态残留物，因此需要添加必需的赋形剂，作为TTX附着的支架以形成固态物。已有的解决办法有采用等渗调节剂氯化钠，以甘露醇为成型骨架辅料，以海藻糖作稳定剂并在冷冻干燥前调节pH值至3.5~4.5，可获得质量稳定性好、安全性高的冻干粉针制剂[41]。
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TTX极具开发潜力，尤其在医药领域。它作为典型的钠离子通道阻断剂在很多方面都表现出药用功效，但可能仍有许多作用未被发现。在已知的一些功效中尚未明确其作用机制，作用于人体的给药途径也仍需探索以获得更好的给药形式和治疗效果，需要多个领域的合作研究才能进一步挖掘TTX对人类的有益作用。
Advances in medicinal research on tetrodotoxin
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摘要: 河豚毒素（TTX）是在河豚鱼和其他海洋动物中发现的一种神经毒素。它是一种电压门控钠通道（VGSCs）阻滞剂，能够选择性地与VGSCs外前庭上的α-亚基结合，阻止钠离子进入通道，从而产生药理活性。作为典型的钠离子通道阻滞剂，TTX具有显著的镇痛作用。TTX能够选择性地阻断Na+通道而不影响其他离子通道，减少了常用抗心律失常药物引起不良反应的概率，降低了用药风险。此外，TTX在戒毒等方面亦有显著作用。因此，TTX具有很大的成药潜力。本文对河豚毒素的结构与性质、作用机制、药理活性和在研制剂进行综述，为其成药性评价研究和在药学领域的应用提供概要性支撑。Abstract: Tetrodotoxin (TTX) is a neurotoxin found in puffer fish and other marine organisms. It has been used as an inhibitor of voltage-gated sodium channels (VGSCs), which could selectively bind to the α-subunit on the outer vestibule of VGSCs, preventing sodium ions from entering the channel, resulting in pharmacological activities. As a typical sodium channel blocker, TTX shows a significant analgesic effect. TTX could selectively block Na+ channels without affecting other ion channels, therefore it could reduce the probability of adverse reactions caused by commonly used antiarrhythmic drugs. In addition, TTX has a significant role in detoxification and prevention of renal failure, so TTX has great potential as a medicine. The structure and physicochemical properties, mechanism of action, pharmacological activities and preparations of tetrodotoxin have been reviewed in this paper, so as to provide a general support for the evaluation of its druggability and application in the field of pharmacy.
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Key words:
- tetrodotoxin /
- neurotoxin /
- analgesic effect /
- pharmacological activity /
- preparation
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慢性脑缺血(CCI)是指各种原因引发的长期大脑血灌流量不足，在血管性痴呆和阿尔茨海默病等神经系统疾病的发展过程发挥重要作用[1-2]。长期慢性脑缺血会导致慢性神经炎症、海马自噬异常、脑部神经元凋亡[3-4]，为此，CCI已经严重威胁人类的健康。肠道被称为人类的“第二大脑”，肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠互动（即脑-肠轴）与机体的神经系统密切相关[5]。研究证明中枢系统疾病会导致肠道菌群失调[6]，患者发生脑卒中后，不仅会出现胃肠道并发症，还会发生肠道菌群失调，例如肠道菌群中的阿克曼菌属（Akkermansia）会发生变化[7]。同时，肠道菌群失调也推动了脑卒中等疾病的发展，文献报道厚壁菌门增加与认知功能损伤有一定的关联[8-9]。因此，肠道菌群参与了脑部神经系统疾病的进展。中药复方虎杖清脉饮是上海市著名中医脉管病专家奚九一教授数十年临床诊治经验的总结，临床上对辩证属“热郁毒聚，脉滞络痹”的脑小血管损伤疗效显著。有报道虎杖清脉饮通过调节p38和NF-κB信号通路，抑制高糖诱导的人视网膜毛细血管内皮细胞的损伤[10]，提示虎杖清脉饮具有抗炎和抗凋亡作用。然而，虎杖清脉饮对慢性脑缺血的治疗作用缺乏临床前研究，作用机制尚不清楚。因此，本实验研究虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠认知功能的影响，并基于肠道菌群角度初步探讨其作用机制，为防治慢性脑缺血提供新的思路。
1. 材料
1.1 动物
24只C57BL/6J雄性小鼠(20±5) g，购自常州卡文斯实验动物有限公司（动物合格证号：202112546）。饲养于海军军医大学药学系动物房，饲养条件为温度（24 ± 2） ℃，相对湿度70 %，每天光照时间为08:00至20:00，自由进食饮水。所有操作均符合海军军医大学实验动物伦理要求。
1.2 药物及试剂
虎杖清脉饮由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供。由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎七味常用中药制备[10]。所有药品粉碎成粗粉，蒸馏水浸泡，煮沸2次，每次40 min，合并滤液，浓缩至0.675 g/ml。银杏叶提取物由上海阿拉丁生物化学技术有限公司提供。
1.3 仪器与设备
Morris 水迷宫（上海奥尔科特生物科技有限公司）；组织脱水机、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；倒置生物显微镜（日本尼康）；病理切片机（上海俫卡仪器有限公司）；DYY-6C 型核酸电泳仪、ND2000 型光度计、9700 型PCR 仪、Quantus™型高灵敏荧光计、Miseq PE300测序平台（美吉生物公司）。
2. 方法
2.1 双侧颈总动脉狭窄模型（BCAS）的建立及动物分组
24只小鼠适应性饲养7 d后，随机分为4组：假手术组、模型组、阳性药组（银杏叶提取物）、虎杖清脉饮组，每组6只。小鼠腹腔注射1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）麻醉，并暴露颈总动脉(CCAs)。在体视显微镜下，将微型弹簧圈(钢丝直径0.08 mm，线圈内径0.18 mm，螺距0.5 mm，总长度2.5 mm)螺旋旋转固定在双侧颈总动脉上致颈总动脉狭窄使脑慢性灌注不足，建立BCAS模型。然后缝合手术部位，并对术后小鼠进行护理，直到它们意识清醒。造模6 w后，各组开始进行灌胃给药12 w。阳性药组给予银杏叶提取物（GBE）30 mg/kg，虎杖清脉饮组（HZQMY）给予虎杖清脉饮13.5 mg/kg，假手术组（Sham）和模型组（BCAS）给予等量生理盐水处理。
2.2 水迷宫实验
Morris水迷宫实验分为前5 d的定位航行实验和第6 d的空间探索实验。定位航行实验：主要用于测试小鼠的空间学习能力。实验历时5 d，每天每只小鼠训练3次。训练时随机选择一个象限开始，按顺时针方向训练3次。每次将该象限的池壁中点作为入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入水中，尽量保持每次入水方式的一致，减少人为影响。小鼠每次分别从不同象限入水寻找逃逸平台，若小鼠找到登上平台，并停留5 s以上，则计时结束，水迷宫装置自动记录小鼠从入水到寻台成功的时间，即为逃避潜伏期。如果在60 s后仍未登上平台，计时也将停止，将小鼠人为引上平台休息1 min，且当次的逃避潜伏期记录为60 s。
空间探索实验：主要用于测试小鼠的空间记忆能力。在定位航行实验结束的第2d，撤除平台，选择与第四象限最远的第二象限池壁中点为小鼠入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入池中，使小鼠自由游泳60 s并记录这60 s内小鼠在原平台的停留时间、穿过原平台所在位置的次数作为判断小鼠空间记忆能力差异的指标。
2.3 LFB染色
治疗结束后，每组各取6只小鼠，用1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）腹腔注射麻醉，4 %多聚甲醛灌注后，取脑石蜡包埋，切片，厚度5 μm，用于LFB(Luxol Fast Blue stain)染色。将石蜡切片常规脱蜡至水，加入LFB染色液于60 ℃烤箱染色3 h。95 %乙醇洗去多余染色液，蒸馏水冲洗。Luxol分化液分化15 s，70 %乙醇分色。重复分化步骤，直至胼胝体和皮质之间形成鲜明对比。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下采集图片。
2.4 肠道菌群测序分析
末次给药后禁食12 h，脱颈椎处死小鼠，处死方法符合动物福利伦理要求，无菌条件下取盲肠内容物，置于液氮中速冻保存。送至美吉生物技术股份有限公司进行DNA提取，合格样品进一步进行高通量测序。
2.5 数据处理与分析
运用美吉生物信息云（https://cloud.majorbio.com/）进行数据的处理，利用美吉生信云UParse软件（v7.0.1090）进行OTU（operational taxonomic units）分析、Alpha多样性分析、稀释曲线分析；利用美吉生信云tax_summary_a文件夹中的数据表和R语言（version 3.3.1）工具统计和作图进行物种组成分析；利用Qiime计算Beta多样性距离矩阵；利用美吉生信云进行线性判别分析（LEfSe），计算多级物种之间的差异。
2.6 统计分析
采用统计软件SPSS 19.0、GraphPad 9.0进行分析。符合正态分布的计量数据以（
$\bar{x}$ ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA)。以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有极显著性差异。3. 结果
3.1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响
如图1A所示，假手术组小鼠从水迷宫实验第1 d开始到第5 d，逃避潜伏期在不断减少。而模型组小鼠随天数的增加，找到平台的时长并没有明显缩短，并且与假手术组相比，第4天和第5天逃避潜伏期有显著性差异（P<0.05），各给药组小鼠逃避潜伏期在逐渐减少，第5天阳性药组、虎杖清脉饮组与模型组之间的逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)。如图1B所示，模型组小鼠的跨越平台次数显著少于假手术组（P<0.01）。而虎杖清脉饮组的跨越平台次数显著大于模型组（P<0.01）。如图1C所示，模型组小鼠的目标象限百分比显著少于假手术组（P<0.05），阳性药组和虎杖清脉饮组的目标象限百分比均显著大于模型组（P<0.05），提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的学习记忆能力。如图1D所示，假手术组中，小鼠胼胝体的LFB染色，髓鞘排列整齐，无水肿、碎裂及空泡的形成。模型组，LFB着色浅，髓鞘崩解，部分髓鞘空泡化。经银杏叶提取物和虎杖清脉饮治疗，髓鞘病变减轻，染色加深，提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的白质损伤。
图 1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响（n=6，$ \bar{x} $ ±s）Sham-假手术组；BCAS-模型组；GBE-阳性药组；HZQMY-虎杖清脉饮组（下同）A.小鼠的逃避潜伏期；B.平台穿越次数；C.目标象限百分比；D. 小鼠脑组织 LFB染色；* P <0.05，** P <0.01，与假手术比较；# P <0.05，## P <0.01，与模型组比较3.2 小鼠肠道菌群物种注释与评估
各组小鼠肠道菌群优化后序列数目为964830，碱基数目为398083175，平均长度为412 bp，序列长度分布在400~440 bp内。图2A为3组小鼠肠道微生物等级丰度曲线，从丰度曲线可以看到各组在缓慢平稳下降，说明各组小鼠肠道菌群物种丰富度高并且分布均匀。图2B、2C所示，总物种曲线可分析样本包含的物种总和，共享物种曲线可分析样本共享物种数目，本研究各组总数目和共享项目增加或减少趋势均逐步减缓并趋于平坦，表明各组样本量满足评估物种丰富度和核心物种数的要求。
3.3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析
如图3A、3B、3C所示，丰富度实际观测值指数、物种丰富度ACE指数和物种丰富度Chao1指数可解释生物群落丰富度。相较于假手术组，模型组小鼠肠道菌群丰富度显著下降（P<0.05）；相较于模型组，虎杖清脉饮组肠道菌群丰富度显著升高（P<0.05），说明虎杖清脉饮可以提升模型组小鼠肠道菌群的丰富度。如图3D所示，3组小鼠肠道菌群的Shannon均匀度测量指数无明显差异。综上，模型组慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度明显下降，虎杖清脉饮可提升慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度。
图 3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析（n=6，$ \bar{{x}} $ ±s）A .丰富度实际观测值指数；B. 物种丰富度ACE指数；C. 物种丰富度Chao1指数；D. Shannon均匀度测量指数；* P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.4 小鼠肠道菌群Beta多样性分析
通过主成分分析（PCA）各组小鼠样本菌群群落组成差异，运用反差分解，在图中通过距离反映不同组之间的组成差异，如样本物种组成越相似，反映在主成分分析图中的距离越近。假手术组和模型组聚集在一起，说明模型组对肠道菌群的影响较小。而虎杖清脉饮组与模型组距离较远，说明慢性脑缺血小鼠肠道菌群改变较小，虎杖清脉饮具有调控模型组小鼠肠道菌群组成的作用（图4）。
3.5 小鼠肠道菌群物种组成及差异分析
3.5.1 基于门水平差异性分析
门水平上，3组小鼠肠道中占主导地位的微生物主要有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、放线菌门（Actinobacteriota），其中后壁菌门和拟杆菌门为优势门类（图5A）。由图5B所示，各组小鼠肠道菌群中髌骨细菌门
和弯曲菌门丰度有显著性差异（P<0.05）。如图5C所示，相较于假手术组，模型组疣微菌门丰度显著升高（P<0.05）。如图5D所示，相较于模型组，虎杖清脉饮组小鼠的疣微菌门丰度显著降低（P<0.05），髌骨细菌门丰度显著增加（P<0.05）。门水平差异性分析显示，慢性脑缺血小鼠疣微菌门丰富度增加；虎杖清脉饮降低慢性脑缺血小鼠疣微菌门和增加髌骨细菌门的群落丰度。 
图 5 各组小鼠肠道菌群门水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度； B.各组样本门水平群落丰度差异；C. Sham组与BCAS组菌门群落丰度差异；D. BCAS组与HZQMY组菌门群落丰度差异；* P<0.05，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.5.2 基于属水平差异性分析
属水平上，3组小鼠肠道中优势菌为毛螺菌科_NK4A136_group、norank_f_Muribaculaceae和乳杆菌属(Lactobacillus)等（图6A）。如图6B所示，3组小鼠的肠道菌群中，阿克曼菌属（Akkermansia）、绿脓杆菌（Turicibacter）、嗜木聚糖真杆菌属（Eubacterium_xylanoPhilum_group）、异杆菌属（Allobaculum）、丹毒荚膜菌属（Erysipelatoclostridium）、回肠杆菌（Ileibacterium）、乳酸球菌属（Lactococcus）群落丰度具有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。如图6C所示，与假手术组相比，模型组阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著上升（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著下降（P<0.05，P<0.01）。如图6D所示，与模型组相比，虎杖清脉饮组的阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著下降（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著上升（P<0.05，P<0.01）。
图 6 各组小鼠肠道菌群属水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度；B.各组样本属水平群落丰度差异；C.假手术组与模型组菌属群落丰度差异；D.模型组与虎杖清脉饮组菌属群落丰度差异；* P<0.05，**P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，## P<0.01，与模型组比较3.6 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析
如表1所示，LEfSe可以检测各组之间存在显著丰度差异特征。相较于假手术组，模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、疣微菌目（o_Verrucomicrobiales）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）等相对丰度显著上调；嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）、罗氏菌属（g_Roseburia）、回肠杆菌属（g_Ileibacterium）等相对丰度显著下调，表明慢性脑缺血小鼠上述肠道菌群丰度发生显著性变化。
表 1 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析菌群 模型组vs
假手术组虎杖清脉饮组vs
模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota） ↑ ↓ 疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae） ↑ ↓ 疣微菌目（o_Verrucomicrobiales） ↑ ↓ 克里斯滕菌目（o_Christensenellales） ↑ 阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae） ↑ ↓ 克里斯滕菌科（f_Christensenellaceae） ↑ 粪芽孢菌属（g_Coprobacillus） ↑ ↓ 阿克曼菌属（g_Akkermansia） ↑ ↓ 嗜胆菌属（g_Bilophila） ↑ 克里斯滕菌属
（g_Christensenellaceae_R-7_group）↑ 丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium） ↑ ↓ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↓ 罗氏菌属（g_Roseburia） ↓ 未分类克里斯滕森菌科（g_unclassified_f_Christensenellaceae） ↓ 异杆菌属（g_Allobaculum） ↓ ↑ 理研菌属（g_Rikenella） ↓ 绿脓杆菌属（g_Turicibacter） ↓ ↑ g_Tyzzerella ↓ 回肠杆菌属（g_Ileibacterium） ↓ 蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia） ↓ f_Tannerellaceae ↓ f_norank_o_Chloroplas ↓ g_norank_f_norank_o_Chloroplast ↓ 副杆菌属（g_Parabacteroides） ↓ o_PeptostrePtococcales-Tissierellales ↑ 髌骨细菌门（P_Patescibacteria） ↑ c_Saccharimonadia ↑ o_Saccharimonadales ↑ f_Saccharimonadaceae ↑ 丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae） ↑ 消化链球菌科（f_Peptostreptococcaceae） ↑ g_Candidatus_Saccharimonas ↑ g_UCG-005 ↑ g_Romboutsia ↑ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↑ g_norank_f_Atopobiaceae ↑ 安德克氏菌属（g_Adlercreutzia） ↑ 分节丝状菌属（g_Candidatus_Arthromitus） ↑ g_Lachnospiraceae_UCG-006 ↑ g_NK4A214_group ↑ 注：↑表示相对丰度增加，↓表示相对丰度降低。 相较于模型组，虎杖清脉饮组疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia）、疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）、阿克曼菌属（g_Akkermansia）、粪芽孢菌属（g_Coprobacillus）、丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium）、副杆菌属（g_Parabacteroides）等相对丰度显著下调；丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae）、消化链球菌科（f_PeptostrePtococcaceae）、绿脓杆菌属（g_Turicibacter）、异杆菌属（g_Allobaculum）、嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）等相对丰度显著上调。说明虎杖清脉饮通过调节嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、疣微菌、阿克曼菌和丹毒荚膜菌的丰度，达到治疗慢性脑缺血的治疗作用。
4. 讨论
慢性脑缺血会损害脑血管，导致患者身体残疾、认知障碍或抑郁样行为。慢性脑缺血(CCI)被认为是血管性痴呆的一个病理生理标志[1-2]，它是血管认知障碍(VCI)最严重的阶段和形式，与推理、学习和记忆方面的问题有关[11-12]。
近年来，大量的研究展示了肠道微生物对人体的生长发育有重要作用，当肠道微生物失调时，可能造成神经功能缺陷，进而出现神经退行性疾病[13-14]。肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠轴调节参与机体的免疫、代谢、神经、内分泌等系统，进而影响多种神经系统疾病的发生[15-16]。研究显示，神经类疾病如阿尔兹海默症、抑郁症、帕金森疾病等都存在宿主肠道菌群紊乱的现象，并且发现肠道菌群能通过神经内分泌和自主神经实现脑-肠信号转导，从而参与调节宿主的神经-内分泌-免疫网络，影响宿主的情绪、认知或行为改变[17]。
虎杖清脉饮由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎组成，虎杖为君药，《药性论》曰：“虎杖，压一切热毒”。虎杖性味苦，寒，在方中起清热解毒、凉血祛瘀的功效。虎杖对神经具有保护作用，如虎杖苷可通过调控lncRNA-MALAT1发挥脑微血管内皮细胞保护作用；虎杖苷可以激活SIRT1信号通路减轻大鼠创伤性脑损伤[18]。连翘[19]、垂盆草及豨莶草[20-21]共为臣药。连翘味苦，微寒，属于清热解毒药，《医学衷中参西录》：连翘具升浮宣散之力，可流通气血。垂盆草味甘、淡，性凉，豨莶草性味辛、苦，寒，二者具有清热解毒，祛风通络之功。三药联用助虎杖清热解毒，又能增强通络的作用。鸡血藤[22]、黄芪共为方中佐药。鸡血藤温而不烈，活血祛瘀兼有补血功效；黄芪甘温，具有益气扶正之功，治久病气虚。三者可治血瘀气虚兼症，并能制君药和臣药苦寒，保护脾胃。川芎[23]辛温，既能祛风，又能行气活血，引诸药上行巅顶，为佐而兼使之用。其中的川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等[24-25]化学成分有明显脑保护作用。诸药合用，共奏清热解毒、活血通络之功。本研究通过减少颈总动脉的血流量，成功建立慢性脑缺血小鼠的模型。
通过水迷宫实验和LFB染色表明虎杖清脉饮对小鼠慢性脑缺血具有保护作用，从肠道菌群的角度观察发现慢性脑缺血将会导致小鼠菌群的物种的丰富度有所下降，并且其中疣微菌门、阿克曼菌属和丹毒荚膜菌属相对丰度上升，而嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度下降；虎杖清脉饮具有增加小鼠肠道菌群物种丰富度的作用，以及回调因为慢性脑缺血而导致菌属变化的作用。阿克曼菌隶属于疣微菌门，是肠道微生物中唯一一个来自疣微菌门的细菌。阿克曼菌[26] 是一种以肠黏膜层中的黏蛋白为食，降解黏蛋白和黏液层。当艾克曼菌异常增加时，会导致肠道屏障的受损，进而诱发肠道炎症和LPS大量进入血液影响其他脏器。有相关文献报道[27] ，在中风患者的肠道艾克曼菌中异常增长。同时，丹毒荚膜菌[28]的丰度也随着帕金森患者胃肠功能障碍增加而增加，这与我们的实验结果相符。嗜木聚糖真杆菌和异杆菌[29-30] 属于短链脂肪酸产生菌，短链脂肪酸[31-32] 可以降低肠道的通透性以及加强肠道屏障的防御力，调节免疫细胞趋化性、活性氧（ROS）释放以及细胞因子释放而具有抗炎功能，短链脂肪酸也可以促进脑内海马神经的发生和延长。虎杖清脉饮减少阿克曼菌属的相对丰度；增加嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度，进而维持肠道屏障功能的完整性，降低机体内的炎症反应，保护血脑屏障[5]。综上所述，虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠的治疗作用与其对慢性脑缺血小鼠肠道菌群失调的改善作用具有相关性。
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[1] SUEHIRO M. Historical review on chemical and medical studies of globefish toxin before World War II[J]. Yakushigaku Zasshi,1994,29(3):428-434. [2] KALAITZIS J A, CHAU R, KOHLI G S, et al. Biosynthesis of toxic naturally-occurring seafood contaminants[J]. Toxicon,2010,56(2):244-258. doi: 10.1016/j.toxicon.2009.09.001 [3] SATO K, AKAI S, SHOJI H, et al. Stereoselective and efficient total synthesis of optically active tetrodotoxin from D-glucose[J]. J Org Chem,2008,73(4):1234-1242. doi: 10.1021/jo701655v [4] CHAU J, CIUFOLINI M A. The chemical synthesis of tetrodoxin: an ongoing quest[J]. Mar Drugs,2011,9(10):2046-2074. doi: 10.3390/md9102046 [5] MURAKAMI K, TOMA T, FUKUYAMA T, et al. Total synthesis of tetrodotoxin[J]. Angew Chem,2020,132(15):6312-6316. doi: 10.1002/ange.201916611 [6] MOSHER H S, FUHRMAN F A, BUCHWALD H D, et al. Tarichatoxin: tetrodotoxin: a potent neurotoxin[J]. Science,1964,144(3622):1100-1110. doi: 10.1126/science.144.3622.1100 [7] LEHMAN E M, BRODIE E D Jr, BRODIE E D 3rd. No evidence for an endosymbiotic bacterial origin of tetrodotoxin in the newt Taricha granulosa[J]. Toxicon,2004,44(3):243-249. doi: 10.1016/j.toxicon.2004.05.019 [8] NOGUCHI T, ARAKAWA O, TAKATANI T. TTX accumulation in pufferfish[J]. Comp Biochem Physiol D Genom Proteom,2006,1(1):145-152. [9] CHENG C A, HWANG D F, TSAI Y H, et al. Microflora and tetrodotoxin-producing bacteria in a gastropod, niotha clathrata[J]. Food Chem Toxicol,1995,33(11):929-934. doi: 10.1016/0278-6915(95)00061-6 [10] WU Z L, YANG Y, XIE L P, et al. Toxicity and distribution of tetrodotoxin-producing bacteria in puffer fish Fugu rubripes collected from the Bohai Sea of China[J]. Toxicon,2005,46(4):471-476. doi: 10.1016/j.toxicon.2005.06.002 [11] SIMIDU U, KITA-TSUKAMOTO K, YASUMOTO T, et al. Taxonomy of four marine bacterial strains that produce tetrodotoxin[J]. Int J Syst Bacteriol,1990,40(4):331-336. doi: 10.1099/00207713-40-4-331 [12] NOGUCHI T, ARAKAWA O. Tetrodotoxin: distribution and accumulation in aquatic organisms, and cases of human intoxication[J]. Mar Drugs,2008,6(2):220-242. doi: 10.3390/md6020220 [13] MATSUMURA K. Reexamination of tetrodotoxin production by bacteria[J]. Appl Environ Microbiol,1995,61(9):3468-3470. doi: 10.1128/aem.61.9.3468-3470.1995 [14] 黄军, 严美姣, 陈国宏. 河豚毒素的起源及其研究进展[J]. 生物技术通讯, 2006, 17(6):998-1000. doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2006.06.047 [15] CHAU R, KALAITZIS J A, NEILAN B A. On the origins and biosynthesis of tetrodotoxin[J]. Aquat Toxicol,2011,104(1-2):61-72. doi: 10.1016/j.aquatox.2011.04.001 [16] WILLIAMS M. The Merck index: an encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals[J]. Choice Reviews Online,2007,44(10). [17] ZHANG X, HUANG X Y, LIN W Y. Stable pharmaceutical composition of freeze-dried tetrodotoxin powder: US8124608[P]. 2012-02-28. [18] 杨春, 苏秀榕, 李太武, 等. 低毒河豚鱼毒素的提取和检测[J]. 天然产物研究与开发, 2003, 15(5):398-400. doi: 10.3969/j.issn.1001-6880.2003.05.006 [19] HERZOG R I, CUMMINS T R, WAXMAN S G. Persistent TTX-resistant Na+ current affects resting potential and response to depolarization in simulated spinal sensory neurons[J]. J Neurophysiol,2001,86(3):1351-1364. doi: 10.1152/jn.2001.86.3.1351 [20] 殷芹, 刘岩, 宫庆礼. 河豚毒素的理论及应用研究进展[J]. 海洋通报, 2008, 27(6):95-100. doi: 10.3969/j.issn.1001-6392.2008.06.014 [21] VENKATESH B, LU S Q, DANDONA N, et al. Genetic basis of tetrodotoxin resistance in pufferfishes[J]. Curr Biol,2005,15(22):2069-2072. doi: 10.1016/j.cub.2005.10.068 [22] 陈学军, 王陈, 石童, 等. TTX和吗啡对醋酸扭体小鼠联合镇痛效应的研究[C]//中国毒理学会. 中国毒理学会第九次全国毒理学大会论文集. 太原: 中国毒理学会, 2019: 13 [23] 张凤云, 库宝善, 姚海燕, 等. 河豚毒素单用及与indoxacarb联合应用的镇痛抗炎作用[J]. 中国临床康复, 2006, 10(34):115-118. [24] HAGEN N A, DU SOUICH P, LAPOINTE B, et al. Tetrodotoxin for moderate to severe cancer pain: a randomized, double blind, parallel design multicenter study[J]. J Pain Symptom Manag,2008,35(4):420-429. doi: 10.1016/j.jpainsymman.2007.05.011 [25] HAGEN N A, FISHER K M, LAPOINTE B, et al. An open-label, multi-dose efficacy and safety study of intramuscular tetrodotoxin in patients with severe cancer-related pain[J]. J Pain Symptom Manage,2007,34(2):171-182. doi: 10.1016/j.jpainsymman.2006.11.008 [26] 王开业. 一种用于戒毒、镇痛的河豚毒素制剂: CN101317846A[P]. 2010-11-10. [27] 潘心富, 刘助国, 黄致强. 用于戒毒, 镇痛的河豚毒素呼吸道给药制剂: CN1459286A[P]. 2003-12-03. [28] 朱成华, 王桂兰, 李蕴山, 等. 河鲀毒素(TTX)对抗心律失常药疗效和毒性的影响[J]. 河北渔业, 1985(2):46-48. [29] 洪碧红, 易瑞灶, 陈永强, 等. 具有抗心律失常作用的河豚毒素复方制剂及其制备方法: CN105030782A[P]. 2019-11-08. [30] BOWER D J, HART R J, MATTHEWS P A, et al. Nonprotein neurotoxins[J]. Clin Toxicol,1981,18(7):813-863. doi: 10.3109/15563658108990310 [31] 蔡志基, 李密, 王越, 等. 国产河豚毒素的药理研究(摘要)[J]. 河北水产科技, 1983(1):1-3. [32] LI W J, BERGMAN S M, HOLMES R P, et al. Tetrodotoxin protects against acute ischemic renal failure in the rat[J]. J Urol,1992,147(2):519-522. doi: 10.1016/S0022-5347(17)37292-0 [33] 刘皓, 刘延东. 河豚毒素在制备治疗前列腺病症药物组合物中的应用、药物组合物及制备方法: CN107308166A[P].2017-11-03. [34] 徐跑, 赵继红, 蒋火金, 等. 河豚毒素在制备抑制肺癌细胞或肿瘤增长的药物中的应用: CN108524521A[P]. 2018-09-14 [35] W·林, 克劳德·卡迪纳尔, F·H·沈. 河豚毒素的固体口服制剂: CN1972689A[P]. 2007-05-30. [36] KAVOOSI M, O'REILLY T E, KAVOOSI M, et al. Safety, tolerability, pharmacokinetics, and concentration-QTc analysis of tetrodotoxin: a randomized, dose escalation study in healthy adults[J]. Toxins (Basel),2020,12(8):E511. doi: 10.3390/toxins12080511 [37] 赵继红, 汤波澜. 一种河豚毒素口服液态制剂及其制备方法: CN102784102A[P]. 2015-01-21. [38] HAGEN N A, CANTIN L, CONSTANT J, et al. Tetrodotoxin for moderate to severe cancer-related pain: a multicentre, randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel-design trial[J]. Pain Res Manag,2017,2017:7212713. [39] HONG B, HE J, SUN J, et al. Analgesia effect of enteric sustained-release tetrodotoxin pellets in the rat[J]. Pharmaceutics,2020,12(1):E32. doi: 10.3390/pharmaceutics12010032 [40] H·H·布希曼, J·M·维拉·赫尔南德斯, J·M·贝扬斯. 钠通道阻滞剂治疗由于化疗而产生的神经病理性疼痛的用途: CN 101563079 A[P]. 2013-09-04. [41] 易瑞灶, 陈晖, 洪碧红, 等. 河豚毒素冻干粉针制剂及其制备方法: CN101352422A[P]. 2009-01-28. -
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