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白首乌为萝藦科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属（Cynanchum）植物泰山白首乌（戟叶牛皮消）C. bungei Decne.、隔山消（隔山牛皮消）C. wilfordii（Maxim.）Hemsl.及滨海白首乌（耳叶牛皮消）C. auriculatum Royle ex Wight.的块根[1-2]，其主要生物活性成分为苯乙酮和C21-甾体皂苷类，具有抗肿瘤、抗炎、舒张心血管，保肝、降糖和神经保护等作用[3-13]。泰山白首乌块根作为正品传统中药白首乌曾收录于1977年版《中国药典》，为泰山四大名药之首，是山东道地药材[14]。2002年版《中国中药志》记载，白首乌还包含滨海白首乌C. auriculatum和隔山消C. wilfordii。滨海白首乌在2015年被国家卫计委批准为普通食品，隔山消于2008年被《韩国药典》收载[1-2]。
随着对白首乌生物活性研究的不断深入，其药用价值不断体现，市场需求也逐年攀升，但是白首乌药材市场存在以下问题：白首乌正品（泰山白首乌）为野生型、两年生，产量低，人工栽培极其困难，市场供应不足，因此有人将滨海白首乌和隔山消都作为白首乌正品销售，存在白首乌品种混淆的现象[15]。泰山白首乌与其近缘种滨海白首乌和隔山消的品质是否有差异，两种近缘种当作白首乌药材应用是否合理，针对这些问题，本研究收集25批白首乌类药材，建立不同产地白首乌的HPLC指纹图谱，运用HPLC指纹图谱进行质量评价。同时对不同批次的白首乌中4种苯乙酮类成分进行含量测定，结构式见图1，从而为不同品种白首乌药材的品质评价提供理论依据。
图 1 白首乌中4种苯乙酮类成分结构式
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LC-20AD高效液相色谱仪（岛津，四元梯度系统）；色谱柱Diamonsil C18柱(4.6 mm× 250 mm, 5 μm)；AG285型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。
4-羟基苯乙酮（CAS：99-93-4，纯度≥98%）、2',4'-二羟基苯乙酮（CAS：89-84-9，纯度≥98%）、2',5'-二羟基苯乙酮（CAS490-78-8，纯度≥98%）均为国药集团提供，白首乌二苯酮为实验室自制（纯度≥98%）。
白首乌药材样品均于2018年采集或购买自国内不同地区（表1），并经山东中医药大学药学院中药鉴定教研室徐凌川教授分别鉴定为泰山白首乌C. bungei Decne.、耳叶牛皮消C. auriculatum Royle ex Wight.和隔山消C. wilfordii (Maxim.) Hemsl.，密封存放于4 ℃冰箱。
表 1 25批白首乌样品来源
样品 产地 物种 类型 S1 山东济南 泰山白首乌 栽培（两年） S2 山东临沂 泰山白首乌 栽培（两年） S3 山东泰安 泰山白首乌 栽培（一年） S4 山东临沂 隔山消 栽培（两年） S5 四川巴蜀 滨海白首乌 饮片 S6 湖南湘西 滨海白首乌 野生 S7 四川成都 滨海白首乌 饮片 S8 湖南张家界 滨海白首乌 饮片 S9 广东广州 滨海白首乌 饮片 S10 山东济南 隔山消 栽培（两年） S11 安徽阜阳 滨海白首乌 饮片 S12 四川遂宁 滨海白首乌 饮片 S13 安徽亳州 滨海白首乌 饮片 S14 江苏南京 滨海白首乌 饮片 S15 广西玉林 滨海白首乌 饮片 S16 江苏徐州 滨海白首乌 饮片 S17 贵州毕节 滨海白首乌 饮片 S18 江西南昌 滨海白首乌 饮片 S19 江苏滨海 滨海白首乌 饮片 S20 云南昆明 滨海白首乌 饮片 S21 云南大理 滨海白首乌 饮片 S22 安徽大别山 隔山消 野生 S23 四川广安 隔山消 野生 S24 陕西汉中 隔山消 野生 S25 河北安国 滨海白首乌 饮片 -
岛津LC-20AD高效液相色谱仪，Diamonsil C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱（0～7 min，15%甲醇; 7～18 min，15%～24%甲醇；18～27 min，24%甲醇；27～32 min，24%～30%甲醇；32～40 min，30%甲醇；40～45 min，30%～15%甲醇），流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长为260 nm（4-羟基苯乙酮、白首乌二苯酮、2',4'-二羟基苯乙酮）和280 nm（2',5'-二羟基苯乙酮），进样量为10 μl。
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精确称取标准品4-羟基苯乙酮156.12 mg、2',5'-二羟基苯乙酮162.08 mg、白首乌二苯酮98.02 mg和2',4'-二羟基苯乙酮133.45 mg，置于1 000 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀，制得混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液适量，用甲醇稀释10倍，得到4-羟基苯乙酮、2',5-'二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮质量浓度分别为0.015 61、0.016 21、0.009 802、0.013 34 mg/ml的混合对照品溶液，过0.45 μm微孔滤膜作对照品溶液，置于4 ℃冰箱中备用。
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称取白首乌样品粉末（过五号筛）约2.0 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20.0 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足超声过程中损失的重量，摇匀，滤过，再取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。
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取25批白首乌样品，分别按实验方法制备供试品溶液，按“1.2”项色谱条件进行测定，得到25个样品的HPLC指纹叠加图谱及10个共有峰，并对指纹图谱中的4种苯乙酮类成分进行归属确认。其中，对4-羟基苯乙酮(保留时间19.531 min)、2',5'-二羟基苯乙酮(保留时间24.773 min)、白首乌二苯酮(保留时间26.455 min)和2',4'-二羟基苯乙酮(保留时间30.768 min)进行了指认，白首乌指纹图谱、对照图谱及混合对照品图谱如图2所示。
图 2 白首乌HPLC色谱图
本研究采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 A版）对25批白首乌样品的HPLC指纹图谱进行数据分析处理，运用多点校正法对其指纹图谱进行相似度评价，选取S16作为参照图谱，设置“时间窗宽度”为0.6 min，以平均数的方法生成白首乌共有模式的指纹对照图谱。在相似度评价中，25批白首乌样品除了S1（产地山东济南）、S2（产地山东临沂）、S3（产地山东泰安）之外，其余相似度均在0.823～0.980之间。故可以通过相似度分析初步将S1、S2、S3这3个批次的白首乌样品归为一类，从色谱图上可以看出其某些成分含量较低，与其他产地的白首乌差距明显，结果显示均为泰山白首乌。研究结果表明，可以明显将以上3个批次的泰山白首乌与其他2个种白首乌（滨海白首乌和隔山消）区分为2大类，说明泰山白首乌与其它白首乌品种（滨海白首乌和隔山消）的化学成分差距显著。
相似度分析可以根据化学特征峰差异明显地区分泰山白首乌，但是滨海白首乌和隔山消不易区分。因此，将其他22批次白首乌样品的10个特征峰面积组成数据矩阵，导入SPSS 20.0统计软件，采用组间联接法以及欧氏距离对指纹图谱进行聚类分析，结果如图3。结果表明，化学距离为2.5，可以将22个样品分为2类，第Ⅰ类的6组均为隔山消，第Ⅱ类的16组均为滨海白首乌。聚类分析结果表明，隔山消和滨海白首乌化学成分含量差异明显。
图 3 22批白首乌样品的化学聚类分析
为了评价22批次样品所有成分的样品分辨能力，运用SIMCA 14.1 分析软件对其进行主成分分析，结果见图4。由PCA图可以看出，S9、S13～S21、S25聚为一类，S5、S7、S8、S12聚为一类，S10、S22、S23、S24聚为一类，与聚类分析的结果基本一致，样品之间的离散程度较大，表明样品差异性较大。
图 4 22批白首乌PCA图
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精密吸取混合对照品溶液1、2、4、8、16、32 μl，分别注入高效液相色谱仪，在“1.2”项实验色谱条件下，重复进样3次，测定4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮的峰面积，对结果进行线性回归分析，以各对照品浓度（X, μg）对峰面积（Y）绘制各标准曲线。线性关系考察结果见表2。
表 2 线性关系考察结果
成分 回归方程 R2 线性范围(μg) 4-羟基苯乙酮 Y=47 109X-22 868 0.999 9 0.015 61-0.499 6 2',5'二羟基苯乙酮 Y =23 028X-12 341 0.999 8 0.016 21-0.518 7 白首乌二苯酮 Y=15 075X-7 940.1 0.999 8 0.009 802-0.313 7 2',4'二羟基苯乙酮 Y=28 725X-12 816 0.999 9 0.013 34-0.427 0 -
按“1.2”项色谱条件对混合对照品溶液，重复进样6次，测定并计算4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮峰面积的RSD分别为1.35%、1.15%、1.27%和1.37%。
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取混合对照品溶液，室温放置，按“1.2”项色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h进样，测定并计算得到RSD分别为0.99%、0.82%、0.92%和0.88%，RSD值均小于3%，结果表明供试品溶液在24 h稳定性良好。
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取同一批白首乌（S16）样品粉末6份，精密称定，按“1.3.2”项方法制备供试品溶液，按“1.2”项色谱条件测定，4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮峰面积的RSD分别为1.48%、1.84%、1.13%和2.01%，RSD值均小于3%，表明方法重复性良好。
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精密称取同一批次白首乌（S16）样品粉末6份，每份1.0 g，按1:1质量比分别加入适量的4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮对照品，按照样品溶液的配制方法制备供试品溶液，在“1.2”项色谱条件下，测定并计算得到平均加样回收率（n=6）分别为97.77%、99.15%、98.81%和96.77%，RSD分别为2.07%、1.57%、1.20%和1.19%，加样回收率结果见表3。
表 3 加样回收率实验结果
成分 加样量(m/g) 样品含量(m/mg) 加对照品量(m/mg) 测得量(m/mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 4-羟基苯乙酮 1.000 0 0.102 1 0.100 0 0.198 2 98.07 97.77 2.07 1.000 3 0.102 1 0.100 0 0.193 4 95.70 1.000 6 0.102 2 0.100 0 0.204 8 101.29 1.000 2 0.102 1 0.100 0 0.193 6 95.79 1.000 8 0.102 2 0.100 0 0.196 7 97.27 1.000 9 0.102 2 0.100 0 0.199 3 98.57 2',5'-二羟基苯乙酮 1.000 0 0.087 3 0.090 0 0.179 3 101.11 99.15 1.57 1.000 3 0.087 3 0.090 0 0.178 9 100.90 1.000 6 0.087 4 0.090 0 0.172 5 97.24 1.000 2 0.087 3 0.090 0 0.174 9 98.64 1.000 8 0.087 4 0.090 0 0.175 8 99.10 1.000 9 0.087 4 0.090 0 0.173 7 97.91 白首乌二苯酮 1.000 0 0.742 1 0.750 0 1.487 2 99.67 98.81 1.20 1.000 3 0.742 3 0.750 0 1.459 1 97.77 1.000 6 0.742 5 0.750 0 1.498 5 100.40 1.000 2 0.742 2 0.750 0 1.483 4 99.41 1.000 8 0.742 7 0.750 0 1.452 9 97.33 1.000 9 0.742 8 0.750 0 1.467 0 98.27 2',4'-二羟基苯乙酮 1.000 0 0.119 8 0.120 0 0.229 7 95.79 96.77 1.19 1.000 3 0.119 8 0.120 0 0.232 2 96.83 1.000 6 0.119 9 0.120 0 0.236 2 98.46 1.000 2 0.119 8 0.120 0 0.228 3 95.20 1.000 8 0.119 9 0.120 0 0.231 9 96.67 1.000 9 0.119 9 0.120 0 0.234 3 97.67 -
取25个批次的白首乌各2.0 g，按照样品溶液的配制方法制备白首乌供试品溶液，进样后记录各色谱峰的峰面积，将所得数据代入各标准曲线回归方程计算其含量，结果如表4。不同批次白首乌中各化合物成分存在显著差异，总苯乙酮类成分的含量也不同。
表 4 25批白首乌中苯乙酮类化学成分含量测定结果(n=3，mg/g)
编号 4-羟基
苯乙酮2',5'-二羟
基苯乙酮白首乌
二苯酮2',4'-二羟
基苯乙酮总苯乙酮
类成分S1 0.274 8 − 0.071 8 0.137 6 0.529 8 S2 0.470 9 0.045 4 0.344 7 0.384 0 1.432 3 S3 0.069 5 − 0.015 4 0.077 6 0.196 7 S4 0.497 5 0.311 1 2.808 6 0.683 7 4.373 9 S5 0.380 5 0.044 2 0.696 7 0.218 3 1.397 9 S6 0.679 3 0.065 3 1.781 4 0.360 8 2.955 1 S7 0.277 1 0.064 5 0.890 9 0.338 9 1.598 0 S8 0.290 4 0.020 4 0.650 6 0.240 4 1.247 7 S9 0.070 8 0.059 6 0.595 7 0.086 9 0.858 2 S10 0.364 5 0.155 5 2.171 7 0.402 2 3.115 2 S11 0.202 0 0.132 1 1.697 6 0.264 5 2.328 4 S12 0.210 4 0.034 2 1.192 0 0.211 9 1.676 6 S13 0.114 5 0.084 2 1.011 4 0.127 6 1.372 0 S14 0.095 0 0.070 6 0.703 3 0.110 3 1.028 3 S15 0.061 5 0.041 7 0.482 9 0.067 4 0.701 4 S16 0.102 1 0.087 3 0.742 1 0.119 8 1.066 0 S17 0.067 6 0.026 8 0.522 4 0.121 5 0.804 0 S18 0.088 8 0.067 5 0.867 2 0.105 9 1.160 1 S19 0.084 3 0.048 8 0.705 2 0.112 0 0.966 7 S20 0.064 2 0.052 6 0.742 4 0.083 5 0.955 2 S21 0.072 6 0.048 3 0.424 0 0.068 0 0.648 6 S22 0.209 0 0.113 2 2.710 9 0.401 7 3.469 3 S23 0.212 9 0.118 3 2.683 9 0.410 0 3.456 4 S24 0.392 7 0.099 8 2.466 8 0.383 3 3.359 6 S25 0.110 5 0.092 3 1.023 1 0.161 4 1.400 3 注：“−”表示含量很低，超出线性范围。 泰山白首乌历来被认为是白首乌的正品，而隔山消和滨海白首乌尽管也用作白首乌，但仍被认为是泰山白首乌的近缘品种。本研究发现，隔山消中总苯乙酮类成分的含量最高，滨海白首乌次之，泰山白首乌最低，总苯乙酮含量仅为隔山消的20%（图5）。栽培的隔山消中总苯乙酮含量与野生的相差不大，说明隔山消野生变家养驯化成功。
图 5 不同物种白首乌中苯乙酮类化学成分含量
滨海白首乌是目前流通的主流品种，江苏滨海、湖南、安徽、四川等地均有栽培，含量差异不大，然而野生的滨海白首乌总苯乙酮含量显著高于栽培品，说明该品种的种植存在着改良的空间，可以从种植环境、栽培技术等方面予以改进。
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本研究通过建立白首乌指纹图谱来评价白首乌药材的品质，对25批次不同白首乌的4种苯乙酮类指标性成分进行含量测定分析，并对其方法学进行考察。HPLC指纹图谱中相似度和聚类分析研究表明，泰山白首乌、滨海白首乌及隔山消的化学成分差异显著。HPLC含量测定分析发现，隔山消中总苯乙酮类的含量明显高于滨海白首乌和泰山白首乌。后续可以对3种白首乌的植物基源、化学成分、药理及毒理作用进行综合对比研究，为滨海白首乌和隔山消是否可以替代泰山白首乌作为白首乌正品药材应用，提供理论依据。
Species differences of Baishouwu based on characteristic chromatogram and content determination of acetophenones
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摘要:
目的 建立不同产地白首乌药材的指纹图谱，并测定苯乙酮类成分含量，为不同品种白首乌药材的质量控制提供科学依据。 方法 采用HPLC-DAD法建立白首乌药材HPLC指纹图谱，同时对4种苯乙酮类成分进行含量测定。其中，色谱柱为Diamonsil C18（4.6 mm× 250 mm, 5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸梯度洗脱，流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长为260 nm（4-羟基苯乙酮、白首乌二苯酮、2',4'-二羟基苯乙酮）和280 nm（2',5'-二羟基苯乙酮）。 结果 泰山白首乌、滨海白首乌及隔山消中化学成分差异显著，隔山消中总苯乙酮类成分含量明显高于滨海白首乌和泰山白首乌。 结论 以苯乙酮类成分为评价指标，隔山消的总苯乙酮含量较高，可作为白首乌药材的优质资源。 Abstract:Objectives To provide scientific basis for the quality control of different species of Baishouwu by establishing the HPLC fingerprint of domestic of Baishouwu and determining the main active components of acetophenones. Methods HPLC-DAD method was used to determine the HPLC fingerprints of domestic of Baishouwu. Then, the content of 4 kinds of acetophenones in Baishouwu was determined. The column was Diamonsil C18（250mm×4.6mm, 5μm）with the mobile phase of methanol and 0.1% phosphoric acid at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength of p-Hydroxyl acetophenone, baishouwu benzophenone, 2',4'-Dihydroxy acetophenone was set at 260 nm and 2',5'-Dihydroxy acetophenone at 280 nm respectively. Results The similarity and cluster analysis in HPLC fingerprint showed that the constituents were significantly different among C. bungei, C. auriculatum and C. wilfordii. The content of total acetophenones in C. wilfordii was significantly higher than that in other localities of C. auriculatum and C. bungei. Conclusions Acetophenone could be used as the evaluation index to evaluate the quality of Baishouwu in different origins. The content of total acetophenone in C. wilfordii is the highest, which could be used as the best quality resource of Baishouwu. -
Key words:
- Baishouwu /
- acetophenone /
- HPLC /
- characteristic chromatogram /
- contents determination
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中药红花（Carthami Flos）是菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，传统本草学著作《本草纲目》记载，红花具有活血散瘀，通经止痛的功效[1]，其药材和制剂在临床上被广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。现代药理研究表明，其主要药效物质是以羟基红花黄色素A（hydroxysafflower yellow A，HSYA）为代表的查尔酮类化合物和以菸花苷为代表的黄酮醇类化合物，这些化合物均具有良好的心脑血管损伤保护活性[2-3]。红花药材的产量偏低，每平方千米产量仅为18.0～22.5 t[4]，其中特有的HSYA[5]、红花红色素等查尔酮类成分在不同品种间差异较大[6]。由于红花中的查尔酮类成分仅特异性地存在于花冠中[7]，加之体外组织培养再生率低[8]等原因，对其功能基因的研究工作一直进展缓慢。特别是对于HSYA等红花特有的有效成分，其生物合成相关的功能基因尚不完全清楚，合成通路也未被完全解析[9]。因此，用现代分子生物学技术手段以提高药效物质的含量，是提高红花品质，节约土地资源、降低制药成本的一条新途径。
短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductases，SDR）在植物次生代谢物的生物合成中广泛参与各类碳-氧双键，碳-碳双键以及烯酮键的氧化还原催化反应。根据SDRs基因序列的特征结构，SDRs超家族可以被分为5个亚家族[10-14]。最早发现并且进行鉴定的两类主要短链还原酶命名为classical和extend，classical类的SDRs基因拥有长度约为250个氨基酸残基，被称为Extended类的SDRs基因在碳基末端因其含有多余的约100个氨基酸残基而得名。另外3种类型SDRs基因分别被命名为intermediate、complex和divergent。这些类型的SDRs基因基于其结合辅酶类型和结合催化位点的不同进行命名分类。此外，SDRs存在与传统类型不同的含有“rossmann-fold”保守结构域的氧化还原酶结构[15-18]。
黄酮类化合物起源于莽草酸途径和苯丙素生物合成途径，1个香豆酰辅酶A（coumaroyl CoA）和3个丙二酰辅酶A（malonyl CoA）在查尔酮合酶的作用下生成二氢查尔酮，然后经查尔酮异构酶催化为二氢黄酮，进一步在各类还原酶，聚合酶和糖基转移酶的作用下，生成终端次生代谢产物组合[19-21]。红花中所含的主要有效成分HSYA具有查尔酮式结构，本课题组前期研究认为：HSYA从前体物质到合成，中间存在必不可少的氧化还原过程。短链脱氢还原酶家族广泛参与植物体内次生代谢，这一类还原酶都带有相似的折叠结构以及催化位点，已有研究表明，其对苯丙烷代谢途径起重要作用[22-23]，但有关红花中还原酶基因相关报道较少[24]。故笔者通过对红花转录组数据库、基因表达谱数据库以及代谢组数据库进行分析，筛选在HSYA生物合成途径的关键还原酶基因，并进行功能验证，以期揭示红花次生代谢成分生物合成途径，为定向调控红花的品质提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
云南巍山红花品系（ZHH0119），采自海军军医大学药学系温室，经海军军医大学郭美丽教授鉴定为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）。红花种植条件：温度恒定25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。采集相关花与组织后迅速存放于液氮或者−80 ℃冰箱中冷冻。
1.2 RNA提取及cDNA第一链合成
按照Trans ZOL Plant植物总RNA提取试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法提取红花花冠总RNA，按照Transtart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix逆转录试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法进行cDNA第一链的合成。cDNA于−20 ℃保存。
1.3 基因筛选
基于数据库中的基因注释以“黄酮还原酶”和“黄酮类化合物生物合成”作为关键词进行检索，筛选出其中可能与HSYA生物合成相关的还原酶基因，将筛选基因不同花期时间的表达量，将其与红花代谢组数据库中同花期的芦丁（rutin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、HSYA、柚皮素（naringenin）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（kaempferol-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-gluciside）、Carthamin、芹菜素（apigenin）、黄芩素（scutellarein）、木犀草素（luteolin）、苯丙氨酸（D-phenylalanine） 12个主要成分的含量[12,25]进行皮尔森相关性分析。
1.4 全长克隆及生物信息学分析
基于红花花冠EST转录组文库，结合第三代测序技术[26-29]红花花冠全长转录组数据库筛选得到目的基因序列。在其5'端、3'端分别设计特异性引物。按照2× Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）高保真酶（南京诺唯赞公司，中国）说明书进行PCR扩增，扩增片段经EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书操作回收后，连接于pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金公司，中国）载体上，转化至大肠杆菌T1感受态细胞（北京全式金公司，中国）后，涂布在LBA平板上，恒温培养37 ℃过夜，挑取阳性单克隆菌落[30-31]，送至上海生工生物有限公司进行菌液测序。
用ExPASyProtParam工具（http://web.expasy.org/compute/）对目的基因的理论等电点（pI），蛋白分子量（MW）和蛋白分子式进行预测。通过Simple Molecule Architecture Research Tool工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对目的基因编码的蛋白质结构功能域进行分析。使用ProtScale（http://us.Expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）以及TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质的亲/疏水性和跨膜区域做出预测。使用SignaIP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测目的蛋白是否含有信号肽。使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对筛选出的SDRs基因进行BLAST序列比对。通过Neighbor-Joining相邻节点法构建系统发育进化树，自展分析法进行1000次重复[32-34]。使用PBILYON-GRLAND数据库预测构建蛋白质二级结构模型。蛋白三级结构由Protein Homology/analogy Recognition Engine预测。用WOLFPSORT软件（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测。
1.5 目的基因表达模式分析
取盛花期新鲜红花根、茎、叶、花冠4个部位的新鲜组织和花期Ⅰ（开花前3 d）、花期Ⅱ（开花当天）、花期Ⅲ（开花后1 d）、花期Ⅳ（开花后3 d）4个花期的新鲜花冠，提取总RNA，合成cDNA第一链后，在靠近5'端处对各个基因设计引物，依据Transtart Top Green qPCR super Mix（北京全式金公司，中国）试剂盒推荐体系，以Ct60s（KJ634810）作为内参标记基因，进行qRT-PCR实验，结果使用2−ΔΔCt的方法进行计算分析[35]。
1.6 植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
根据CtSDR3的开放阅读框和植物真核表达载体pMT-39序列信息，设计无缝克隆引物。以红花cDNA做模板，使用高保真酶进行PCR反应。产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经NcoI酶切线性化的pMT-39载体进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性克隆菌株扩大培养后抽提质粒，提取的pMT39-CtSDR3质粒用冷冻法转至农杆菌GV3101中。LBK+Rif平板筛选阳性克隆后，取1ml OD600 = 0.8的菌液经6 000 r/min，离心3 min后用1 ml 5%蔗糖溶液重悬，加入Silwet-L 1μl，用注射器注射于红花花柱，套袋避光[35]。
在pMT-39的35 s启动子区域设计5'端特异性引物，在目的基因CtSDR3中设计3'端引物。取T2代新鲜叶cDNA第一链作为模板，2× Easy Taq PCR Mix（北京全式金，中国）推荐体系进行PCR反应，确定是否存在目的条带。采集CtSDR3阳性植株花冠以及pMT-39空载体对照植株的花冠，按照上述的qRT-PCR反应体系评价CtSDR3基因的过表达水平，使用UPLC-Q-TOF/MS 检测CtSDR3过表达组和空载体对照组的黄酮代谢物含量，选择以HSYA为代表性成分的8个黄酮类化合物作为检测对象。
1.7 原核表达载体构建及蛋白表达
根据CtSDR3的开放阅读框及蛋白表达载体pGEX-6p-1以及pET-28a序列信息，设计同源重组克隆引物[34]。以红花花冠cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR反应。PCR产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经XhoI、BamHI酶切线性化的载体pGEX-6p-1以及pET-28a进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性菌株克隆扩大培养后抽提质粒，提取的重组质粒用热激法转至大肠杆菌Rosseta（DE3）（上海唯地生物，中国）中。
在20 ml LBA液体培养基中培养至OD600为0.6左右，分2份10 ml菌液各加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG和生理盐水。恒温培养箱中16 ℃，100 r/min继续培养16 h[35-36]。菌液离心弃上清液，用1×PBS缓冲液洗涤两次后重悬。超声破碎仪中40 kW，工作时间5 s，循环间隔时间25 s，共15个循环进行破碎[16]，裂解完成后取上清与沉淀15 μl，上样检测。
2. 结果
2.1 基因筛选
通过分析，得到contig325、contig483、contig2863共3个与HSYA具有强相关性的基因（r>0.85），见图1。
2.2 全长克隆和生物信息学分析
3个目的基因序列信息经测序验证结果如下：contig325全长共1523 bp，开放阅读框1341bp，编码446个氨基酸；contig483全长1393 bp，开放阅读框792 bp，编码263个氨基酸；contig2863全长序列1527 bp，开放阅读框1023 bp，编码340个氨基酸。PCR产物电泳结果如图2所示。
contig325基因编码446个氨基酸，命名为CtSDR1（GenBank登录号：MW792035）；Contig483基因编码263个氨基酸，命名为CtSDR2（GenBank登录号：MW792036）；Contig2863基因编码339个氨基酸，命名为CtSDR3（GenBank登录号：MW792037）。系统进化树表明CtSDR1与蓟Cirsium japonicum (QQH14901.1)同源性最高；CtSDR2与小蓬草Erigeron canadensis (XP_043636506.1)同源性最高；CtSDR3与小豆蔻Cynara cardunculus var. scolymus (KVI09206.1)同源性最高。Prot-param分析CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C2230H3346N606O639S7，相对分子量为49.2×103，理论等电点pI=9.61；CtSDR2基因所编码的蛋白质分子式C1289H2072N360O379S13，相对分子量为29×103，理论等电点pI=8.63；CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C1691H2614N442O481S9，相对分子量为37.1×103，理论等电点pI=6.80。Prot Scale分析预测CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白为亲水性蛋白，无信号肽属非分泌蛋白。蛋白跨膜性分析显示CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3不含有跨膜区域，为非跨膜蛋白。对CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白二级结构的预测显示均属于不规则结构。对CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3蛋白质三维结构预测如图3所示。系统进化树如图4所示。亚细胞定位预测显示，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3均可能定位于细胞质。
2.3 目的基因表达模式分析
取红花花期的Ⅳ期的红花各个部位进行分析，发现红花花冠内的CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3基因表达量从高到低依次均为花冠>叶>茎>根。其中CtSDR1在花冠中的相对表达量约为根中的3倍、而CtSDR2、CtSDR3在花冠中的相对表达量约为根中的4倍。将4个花期的红花花冠进行qRT-PCR分析表明，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3花冠中表达量均随着花冠发育逐渐升高，特别是CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3的Ⅳ期花冠对比Ⅲ期花冠的表达量分别提高了7.2倍、2.7倍、2.3倍（图5）。
2.4 CtSDR3植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
构建真和表达载体并通过PCR鉴定后，我们从19株农杆菌浸染的子代植株中得到5株pMT39-CtSDR3阳性红花植株（图6）。通过qPCR对其CtSDR3基因转录水平进行测定，结果发现阳性红花植株中CtSDR3基因的转录水平得到显著增加，约为空白组株系的2～3倍，CtSDR3的在花冠部位的高表达也证明了研究成功获取CtSDR3过表达红花植株（图7）。通过UPLC-QTOF/MS技术测定阳性转基因红花株系组和空白对照组的目标化合物含量，包括7个红花花冠主要黄酮类化合物及苯丙烷类代谢途径上游关键物质苯丙氨酸（图8），分别为：野黄芩素（scutellarein）、Carthamin、HSYA、山柰酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucoside）、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（kaempferol-3-O-β-rutinoside）、芦丁（rutin）和苯丙氨酸（D-Phenylalanine）。由图8可知，与空白组相比，CtSDR3过表达株系相较于空白组野黄芩素提高了3.6%～9.8%，HSYA提高了7.1%～16.6%，以及苯丙氨酸含量提高了5.5%～15.7%，具有显著性升高。其他化合物含量则有无显著性变化趋势。通过对过表达株系与空白组的含量分析，我们认为CtSDR3基因过表达会引起红花中黄酮类物质的变化，尤其是HSYA含量升高显著。同时，苯丙氨酸代谢途径属于植物重要的次生代谢途径，过表达组引起苯丙氨酸含量的显著上升，上述指标性成分的变化也进一步说明CtSDR3对红花黄酮类化合物次生代谢途径具有一定的影响，但目前我们尚难以判断CtSDR3红花中影响次生代谢产物积累的明确途径。
图 6 真核表达载体构建及阳性鉴定电泳图注：1. CtSDR3基因开放阅读框（ORF）区扩增产物电泳图，a、b泳道均为CtSDR3基因ORF区克隆PCR产物；2. 真核表达载体pMT-39载体酶切产物电泳图，a、b泳道为CtSDR3 PCR产物，c泳道为pMT-39载体，d、e泳道为pMT-39线性化载体；3. pMT39-CtSDR3重组载体阳性转化子鉴定电泳图，a、b泳道为阳性转化子菌液PCR产物；4. pMT39-CtSDR3质粒转化农杆菌GV3101，a、c和e泳道为空白对照组，b、d和f泳道为阳性克隆菌液PCR产物；5. 红花pMT39-CtSDR3阳性转化植株鉴定PCR产物电泳图，1～19为待鉴定植株，p为pMT39-CtSDR3质粒，k为空白组，WT为野生型红花植株
图 8 阳性植株黄酮类化合物含量测定注：A.黄芩素；B.Carthamin；C.HSYA；D.山柰酚；E.山柰酚-3-O-葡萄糖苷；F.山柰酚-3-O-芸香糖苷；G.芦丁；H.苯丙氨酸；CK.空白组株系；OVX.阳性过表达株系2.5 原核表达载体构建及蛋白表达
目的片段成功扩增，将目的条带进行胶回收、纯化。CtSDR1、CtSDR1、CtSDR1构建的pGEX-6p-1、pET-28a原核表达载体均有在大肠杆菌内表达，但是CtSDR1-pGEX-6p-1、 CtSDR2-pGEX-6p-1、CtSDR3-pGEX-6p-1、CtSDR1-pET-28、CtSDR2-pET-28a、CtSDR3-pET-28a表达的目的蛋白均形成包涵体，存在于沉淀中。无法进行下一步大量纯化实验，唯有CtSDR2-pGEX-6p-1诱导表达了存在于上清液的目的蛋白，明显可以在上清液中观察到分子量约为50 000的蛋白条带（图9）。
图 9 目的片段PCR产物电泳及表达蛋白电泳分析注：A.目的片段PCR产物电泳：1～5为CtSDR1，6～10为CtSDR2，11～15为CtSDR3（其对应的PCR反应Tm值分别为67 ℃、65 ℃、63 ℃、59 ℃、57 ℃）；B.pGEX-6p-1蛋白表达电泳分析；C.pET-28a蛋白表达电泳分析3. 讨论
越来越多的红花药理学相关研究表明，红花的主要药效物质包括查尔酮类、黄酮醇类等多种黄酮类化合物，其中，查尔酮类HSYA对脑缺血具有保护作用，并且还能抗脑血栓形成以及抗氧化等。研究HSYA的生物合成分途径，对于HSYA的工业化生产具有重要意义。
本研究借助生物学分子技术、结合代谢组分析测定，筛选出3个参与HSYA生物合成途径的关键短链脱氢还原酶基因CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3，这3个基因序列具有高度保守性，在不同器官的表达模式均呈现出花冠>叶>茎>根的特点，而且在花冠中的表达量随花冠发育逐渐升高，表明其很有可能参与红花中HSYA等主要药用成分的积累。进一步研究发现，转CtSDR3过表达T2代阳性植株花冠中CtSDR3基因的转录水平增加了2~3倍，次生代谢物HSYA的含量提高了7.1%～16.6%（P<0.05），验证了我们对CtSDR3在红花体内参与黄酮类化合物生物合成功能的推测。本研究中，体外表达CtSDR3蛋白，得到目的蛋白条带，但由于包涵体等原因，蛋白表达和纯化条件仍需要进一步摸索。下一步，我们将对可能起黄酮类生物合成途径的关键SDRs进行深入的生物学特性特别是酶结合位点的研究，为更好地阐释SDRs的生物学功能、利用分子生物育种技术培育高HSYA含量的红花新品种奠定基础。
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图 2 白首乌HPLC色谱图
A.白首乌指纹图谱；B.对照品；C.混合标准品；7. 4-羟基苯乙酮；8. 2',5'-二羟基苯乙酮；9. 白首乌二苯酮；10. 2',4'-二羟基苯乙酮
表 1 25批白首乌样品来源
样品 产地 物种 类型 S1 山东济南 泰山白首乌 栽培（两年） S2 山东临沂 泰山白首乌 栽培（两年） S3 山东泰安 泰山白首乌 栽培（一年） S4 山东临沂 隔山消 栽培（两年） S5 四川巴蜀 滨海白首乌 饮片 S6 湖南湘西 滨海白首乌 野生 S7 四川成都 滨海白首乌 饮片 S8 湖南张家界 滨海白首乌 饮片 S9 广东广州 滨海白首乌 饮片 S10 山东济南 隔山消 栽培（两年） S11 安徽阜阳 滨海白首乌 饮片 S12 四川遂宁 滨海白首乌 饮片 S13 安徽亳州 滨海白首乌 饮片 S14 江苏南京 滨海白首乌 饮片 S15 广西玉林 滨海白首乌 饮片 S16 江苏徐州 滨海白首乌 饮片 S17 贵州毕节 滨海白首乌 饮片 S18 江西南昌 滨海白首乌 饮片 S19 江苏滨海 滨海白首乌 饮片 S20 云南昆明 滨海白首乌 饮片 S21 云南大理 滨海白首乌 饮片 S22 安徽大别山 隔山消 野生 S23 四川广安 隔山消 野生 S24 陕西汉中 隔山消 野生 S25 河北安国 滨海白首乌 饮片 
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表 2 线性关系考察结果
成分 回归方程 R2 线性范围(μg) 4-羟基苯乙酮 Y=47 109X-22 868 0.999 9 0.015 61-0.499 6 2',5'二羟基苯乙酮 Y =23 028X-12 341 0.999 8 0.016 21-0.518 7 白首乌二苯酮 Y=15 075X-7 940.1 0.999 8 0.009 802-0.313 7 2',4'二羟基苯乙酮 Y=28 725X-12 816 0.999 9 0.013 34-0.427 0
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表 3 加样回收率实验结果
成分 加样量(m/g) 样品含量(m/mg) 加对照品量(m/mg) 测得量(m/mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 4-羟基苯乙酮 1.000 0 0.102 1 0.100 0 0.198 2 98.07 97.77 2.07 1.000 3 0.102 1 0.100 0 0.193 4 95.70 1.000 6 0.102 2 0.100 0 0.204 8 101.29 1.000 2 0.102 1 0.100 0 0.193 6 95.79 1.000 8 0.102 2 0.100 0 0.196 7 97.27 1.000 9 0.102 2 0.100 0 0.199 3 98.57 2',5'-二羟基苯乙酮 1.000 0 0.087 3 0.090 0 0.179 3 101.11 99.15 1.57 1.000 3 0.087 3 0.090 0 0.178 9 100.90 1.000 6 0.087 4 0.090 0 0.172 5 97.24 1.000 2 0.087 3 0.090 0 0.174 9 98.64 1.000 8 0.087 4 0.090 0 0.175 8 99.10 1.000 9 0.087 4 0.090 0 0.173 7 97.91 白首乌二苯酮 1.000 0 0.742 1 0.750 0 1.487 2 99.67 98.81 1.20 1.000 3 0.742 3 0.750 0 1.459 1 97.77 1.000 6 0.742 5 0.750 0 1.498 5 100.40 1.000 2 0.742 2 0.750 0 1.483 4 99.41 1.000 8 0.742 7 0.750 0 1.452 9 97.33 1.000 9 0.742 8 0.750 0 1.467 0 98.27 2',4'-二羟基苯乙酮 1.000 0 0.119 8 0.120 0 0.229 7 95.79 96.77 1.19 1.000 3 0.119 8 0.120 0 0.232 2 96.83 1.000 6 0.119 9 0.120 0 0.236 2 98.46 1.000 2 0.119 8 0.120 0 0.228 3 95.20 1.000 8 0.119 9 0.120 0 0.231 9 96.67 1.000 9 0.119 9 0.120 0 0.234 3 97.67
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表 4 25批白首乌中苯乙酮类化学成分含量测定结果(n=3，mg/g)
编号 4-羟基
苯乙酮2',5'-二羟
基苯乙酮白首乌
二苯酮2',4'-二羟
基苯乙酮总苯乙酮
类成分S1 0.274 8 − 0.071 8 0.137 6 0.529 8 S2 0.470 9 0.045 4 0.344 7 0.384 0 1.432 3 S3 0.069 5 − 0.015 4 0.077 6 0.196 7 S4 0.497 5 0.311 1 2.808 6 0.683 7 4.373 9 S5 0.380 5 0.044 2 0.696 7 0.218 3 1.397 9 S6 0.679 3 0.065 3 1.781 4 0.360 8 2.955 1 S7 0.277 1 0.064 5 0.890 9 0.338 9 1.598 0 S8 0.290 4 0.020 4 0.650 6 0.240 4 1.247 7 S9 0.070 8 0.059 6 0.595 7 0.086 9 0.858 2 S10 0.364 5 0.155 5 2.171 7 0.402 2 3.115 2 S11 0.202 0 0.132 1 1.697 6 0.264 5 2.328 4 S12 0.210 4 0.034 2 1.192 0 0.211 9 1.676 6 S13 0.114 5 0.084 2 1.011 4 0.127 6 1.372 0 S14 0.095 0 0.070 6 0.703 3 0.110 3 1.028 3 S15 0.061 5 0.041 7 0.482 9 0.067 4 0.701 4 S16 0.102 1 0.087 3 0.742 1 0.119 8 1.066 0 S17 0.067 6 0.026 8 0.522 4 0.121 5 0.804 0 S18 0.088 8 0.067 5 0.867 2 0.105 9 1.160 1 S19 0.084 3 0.048 8 0.705 2 0.112 0 0.966 7 S20 0.064 2 0.052 6 0.742 4 0.083 5 0.955 2 S21 0.072 6 0.048 3 0.424 0 0.068 0 0.648 6 S22 0.209 0 0.113 2 2.710 9 0.401 7 3.469 3 S23 0.212 9 0.118 3 2.683 9 0.410 0 3.456 4 S24 0.392 7 0.099 8 2.466 8 0.383 3 3.359 6 S25 0.110 5 0.092 3 1.023 1 0.161 4 1.400 3 注：“−”表示含量很低，超出线性范围。
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