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白首乌为萝藦科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属（Cynanchum）植物泰山白首乌（戟叶牛皮消）C. bungei Decne.、隔山消（隔山牛皮消）C. wilfordii（Maxim.）Hemsl.及滨海白首乌（耳叶牛皮消）C. auriculatum Royle ex Wight.的块根[1-2]，其主要生物活性成分为苯乙酮和C21-甾体皂苷类，具有抗肿瘤、抗炎、舒张心血管，保肝、降糖和神经保护等作用[3-13]。泰山白首乌块根作为正品传统中药白首乌曾收录于1977年版《中国药典》，为泰山四大名药之首，是山东道地药材[14]。2002年版《中国中药志》记载，白首乌还包含滨海白首乌C. auriculatum和隔山消C. wilfordii。滨海白首乌在2015年被国家卫计委批准为普通食品，隔山消于2008年被《韩国药典》收载[1-2]。
随着对白首乌生物活性研究的不断深入，其药用价值不断体现，市场需求也逐年攀升，但是白首乌药材市场存在以下问题：白首乌正品（泰山白首乌）为野生型、两年生，产量低，人工栽培极其困难，市场供应不足，因此有人将滨海白首乌和隔山消都作为白首乌正品销售，存在白首乌品种混淆的现象[15]。泰山白首乌与其近缘种滨海白首乌和隔山消的品质是否有差异，两种近缘种当作白首乌药材应用是否合理，针对这些问题，本研究收集25批白首乌类药材，建立不同产地白首乌的HPLC指纹图谱，运用HPLC指纹图谱进行质量评价。同时对不同批次的白首乌中4种苯乙酮类成分进行含量测定，结构式见图1，从而为不同品种白首乌药材的品质评价提供理论依据。
图 1 白首乌中4种苯乙酮类成分结构式
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LC-20AD高效液相色谱仪（岛津，四元梯度系统）；色谱柱Diamonsil C18柱(4.6 mm× 250 mm, 5 μm)；AG285型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。
4-羟基苯乙酮（CAS：99-93-4，纯度≥98%）、2',4'-二羟基苯乙酮（CAS：89-84-9，纯度≥98%）、2',5'-二羟基苯乙酮（CAS490-78-8，纯度≥98%）均为国药集团提供，白首乌二苯酮为实验室自制（纯度≥98%）。
白首乌药材样品均于2018年采集或购买自国内不同地区（表1），并经山东中医药大学药学院中药鉴定教研室徐凌川教授分别鉴定为泰山白首乌C. bungei Decne.、耳叶牛皮消C. auriculatum Royle ex Wight.和隔山消C. wilfordii (Maxim.) Hemsl.，密封存放于4 ℃冰箱。
表 1 25批白首乌样品来源
样品 产地 物种 类型 S1 山东济南 泰山白首乌 栽培（两年） S2 山东临沂 泰山白首乌 栽培（两年） S3 山东泰安 泰山白首乌 栽培（一年） S4 山东临沂 隔山消 栽培（两年） S5 四川巴蜀 滨海白首乌 饮片 S6 湖南湘西 滨海白首乌 野生 S7 四川成都 滨海白首乌 饮片 S8 湖南张家界 滨海白首乌 饮片 S9 广东广州 滨海白首乌 饮片 S10 山东济南 隔山消 栽培（两年） S11 安徽阜阳 滨海白首乌 饮片 S12 四川遂宁 滨海白首乌 饮片 S13 安徽亳州 滨海白首乌 饮片 S14 江苏南京 滨海白首乌 饮片 S15 广西玉林 滨海白首乌 饮片 S16 江苏徐州 滨海白首乌 饮片 S17 贵州毕节 滨海白首乌 饮片 S18 江西南昌 滨海白首乌 饮片 S19 江苏滨海 滨海白首乌 饮片 S20 云南昆明 滨海白首乌 饮片 S21 云南大理 滨海白首乌 饮片 S22 安徽大别山 隔山消 野生 S23 四川广安 隔山消 野生 S24 陕西汉中 隔山消 野生 S25 河北安国 滨海白首乌 饮片 -
岛津LC-20AD高效液相色谱仪，Diamonsil C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱（0～7 min，15%甲醇; 7～18 min，15%～24%甲醇；18～27 min，24%甲醇；27～32 min，24%～30%甲醇；32～40 min，30%甲醇；40～45 min，30%～15%甲醇），流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长为260 nm（4-羟基苯乙酮、白首乌二苯酮、2',4'-二羟基苯乙酮）和280 nm（2',5'-二羟基苯乙酮），进样量为10 μl。
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精确称取标准品4-羟基苯乙酮156.12 mg、2',5'-二羟基苯乙酮162.08 mg、白首乌二苯酮98.02 mg和2',4'-二羟基苯乙酮133.45 mg，置于1 000 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀，制得混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液适量，用甲醇稀释10倍，得到4-羟基苯乙酮、2',5-'二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮质量浓度分别为0.015 61、0.016 21、0.009 802、0.013 34 mg/ml的混合对照品溶液，过0.45 μm微孔滤膜作对照品溶液，置于4 ℃冰箱中备用。
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称取白首乌样品粉末（过五号筛）约2.0 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20.0 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足超声过程中损失的重量，摇匀，滤过，再取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。
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取25批白首乌样品，分别按实验方法制备供试品溶液，按“1.2”项色谱条件进行测定，得到25个样品的HPLC指纹叠加图谱及10个共有峰，并对指纹图谱中的4种苯乙酮类成分进行归属确认。其中，对4-羟基苯乙酮(保留时间19.531 min)、2',5'-二羟基苯乙酮(保留时间24.773 min)、白首乌二苯酮(保留时间26.455 min)和2',4'-二羟基苯乙酮(保留时间30.768 min)进行了指认，白首乌指纹图谱、对照图谱及混合对照品图谱如图2所示。
图 2 白首乌HPLC色谱图
本研究采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 A版）对25批白首乌样品的HPLC指纹图谱进行数据分析处理，运用多点校正法对其指纹图谱进行相似度评价，选取S16作为参照图谱，设置“时间窗宽度”为0.6 min，以平均数的方法生成白首乌共有模式的指纹对照图谱。在相似度评价中，25批白首乌样品除了S1（产地山东济南）、S2（产地山东临沂）、S3（产地山东泰安）之外，其余相似度均在0.823～0.980之间。故可以通过相似度分析初步将S1、S2、S3这3个批次的白首乌样品归为一类，从色谱图上可以看出其某些成分含量较低，与其他产地的白首乌差距明显，结果显示均为泰山白首乌。研究结果表明，可以明显将以上3个批次的泰山白首乌与其他2个种白首乌（滨海白首乌和隔山消）区分为2大类，说明泰山白首乌与其它白首乌品种（滨海白首乌和隔山消）的化学成分差距显著。
相似度分析可以根据化学特征峰差异明显地区分泰山白首乌，但是滨海白首乌和隔山消不易区分。因此，将其他22批次白首乌样品的10个特征峰面积组成数据矩阵，导入SPSS 20.0统计软件，采用组间联接法以及欧氏距离对指纹图谱进行聚类分析，结果如图3。结果表明，化学距离为2.5，可以将22个样品分为2类，第Ⅰ类的6组均为隔山消，第Ⅱ类的16组均为滨海白首乌。聚类分析结果表明，隔山消和滨海白首乌化学成分含量差异明显。
图 3 22批白首乌样品的化学聚类分析
为了评价22批次样品所有成分的样品分辨能力，运用SIMCA 14.1 分析软件对其进行主成分分析，结果见图4。由PCA图可以看出，S9、S13～S21、S25聚为一类，S5、S7、S8、S12聚为一类，S10、S22、S23、S24聚为一类，与聚类分析的结果基本一致，样品之间的离散程度较大，表明样品差异性较大。
图 4 22批白首乌PCA图
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精密吸取混合对照品溶液1、2、4、8、16、32 μl，分别注入高效液相色谱仪，在“1.2”项实验色谱条件下，重复进样3次，测定4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮的峰面积，对结果进行线性回归分析，以各对照品浓度（X, μg）对峰面积（Y）绘制各标准曲线。线性关系考察结果见表2。
表 2 线性关系考察结果
成分 回归方程 R2 线性范围(μg) 4-羟基苯乙酮 Y=47 109X-22 868 0.999 9 0.015 61-0.499 6 2',5'二羟基苯乙酮 Y =23 028X-12 341 0.999 8 0.016 21-0.518 7 白首乌二苯酮 Y=15 075X-7 940.1 0.999 8 0.009 802-0.313 7 2',4'二羟基苯乙酮 Y=28 725X-12 816 0.999 9 0.013 34-0.427 0 -
按“1.2”项色谱条件对混合对照品溶液，重复进样6次，测定并计算4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮峰面积的RSD分别为1.35%、1.15%、1.27%和1.37%。
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取混合对照品溶液，室温放置，按“1.2”项色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h进样，测定并计算得到RSD分别为0.99%、0.82%、0.92%和0.88%，RSD值均小于3%，结果表明供试品溶液在24 h稳定性良好。
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取同一批白首乌（S16）样品粉末6份，精密称定，按“1.3.2”项方法制备供试品溶液，按“1.2”项色谱条件测定，4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮峰面积的RSD分别为1.48%、1.84%、1.13%和2.01%，RSD值均小于3%，表明方法重复性良好。
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精密称取同一批次白首乌（S16）样品粉末6份，每份1.0 g，按1:1质量比分别加入适量的4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮对照品，按照样品溶液的配制方法制备供试品溶液，在“1.2”项色谱条件下，测定并计算得到平均加样回收率（n=6）分别为97.77%、99.15%、98.81%和96.77%，RSD分别为2.07%、1.57%、1.20%和1.19%，加样回收率结果见表3。
表 3 加样回收率实验结果
成分 加样量(m/g) 样品含量(m/mg) 加对照品量(m/mg) 测得量(m/mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 4-羟基苯乙酮 1.000 0 0.102 1 0.100 0 0.198 2 98.07 97.77 2.07 1.000 3 0.102 1 0.100 0 0.193 4 95.70 1.000 6 0.102 2 0.100 0 0.204 8 101.29 1.000 2 0.102 1 0.100 0 0.193 6 95.79 1.000 8 0.102 2 0.100 0 0.196 7 97.27 1.000 9 0.102 2 0.100 0 0.199 3 98.57 2',5'-二羟基苯乙酮 1.000 0 0.087 3 0.090 0 0.179 3 101.11 99.15 1.57 1.000 3 0.087 3 0.090 0 0.178 9 100.90 1.000 6 0.087 4 0.090 0 0.172 5 97.24 1.000 2 0.087 3 0.090 0 0.174 9 98.64 1.000 8 0.087 4 0.090 0 0.175 8 99.10 1.000 9 0.087 4 0.090 0 0.173 7 97.91 白首乌二苯酮 1.000 0 0.742 1 0.750 0 1.487 2 99.67 98.81 1.20 1.000 3 0.742 3 0.750 0 1.459 1 97.77 1.000 6 0.742 5 0.750 0 1.498 5 100.40 1.000 2 0.742 2 0.750 0 1.483 4 99.41 1.000 8 0.742 7 0.750 0 1.452 9 97.33 1.000 9 0.742 8 0.750 0 1.467 0 98.27 2',4'-二羟基苯乙酮 1.000 0 0.119 8 0.120 0 0.229 7 95.79 96.77 1.19 1.000 3 0.119 8 0.120 0 0.232 2 96.83 1.000 6 0.119 9 0.120 0 0.236 2 98.46 1.000 2 0.119 8 0.120 0 0.228 3 95.20 1.000 8 0.119 9 0.120 0 0.231 9 96.67 1.000 9 0.119 9 0.120 0 0.234 3 97.67 -
取25个批次的白首乌各2.0 g，按照样品溶液的配制方法制备白首乌供试品溶液，进样后记录各色谱峰的峰面积，将所得数据代入各标准曲线回归方程计算其含量，结果如表4。不同批次白首乌中各化合物成分存在显著差异，总苯乙酮类成分的含量也不同。
表 4 25批白首乌中苯乙酮类化学成分含量测定结果(n=3，mg/g)
编号 4-羟基
苯乙酮2',5'-二羟
基苯乙酮白首乌
二苯酮2',4'-二羟
基苯乙酮总苯乙酮
类成分S1 0.274 8 − 0.071 8 0.137 6 0.529 8 S2 0.470 9 0.045 4 0.344 7 0.384 0 1.432 3 S3 0.069 5 − 0.015 4 0.077 6 0.196 7 S4 0.497 5 0.311 1 2.808 6 0.683 7 4.373 9 S5 0.380 5 0.044 2 0.696 7 0.218 3 1.397 9 S6 0.679 3 0.065 3 1.781 4 0.360 8 2.955 1 S7 0.277 1 0.064 5 0.890 9 0.338 9 1.598 0 S8 0.290 4 0.020 4 0.650 6 0.240 4 1.247 7 S9 0.070 8 0.059 6 0.595 7 0.086 9 0.858 2 S10 0.364 5 0.155 5 2.171 7 0.402 2 3.115 2 S11 0.202 0 0.132 1 1.697 6 0.264 5 2.328 4 S12 0.210 4 0.034 2 1.192 0 0.211 9 1.676 6 S13 0.114 5 0.084 2 1.011 4 0.127 6 1.372 0 S14 0.095 0 0.070 6 0.703 3 0.110 3 1.028 3 S15 0.061 5 0.041 7 0.482 9 0.067 4 0.701 4 S16 0.102 1 0.087 3 0.742 1 0.119 8 1.066 0 S17 0.067 6 0.026 8 0.522 4 0.121 5 0.804 0 S18 0.088 8 0.067 5 0.867 2 0.105 9 1.160 1 S19 0.084 3 0.048 8 0.705 2 0.112 0 0.966 7 S20 0.064 2 0.052 6 0.742 4 0.083 5 0.955 2 S21 0.072 6 0.048 3 0.424 0 0.068 0 0.648 6 S22 0.209 0 0.113 2 2.710 9 0.401 7 3.469 3 S23 0.212 9 0.118 3 2.683 9 0.410 0 3.456 4 S24 0.392 7 0.099 8 2.466 8 0.383 3 3.359 6 S25 0.110 5 0.092 3 1.023 1 0.161 4 1.400 3 注：“−”表示含量很低，超出线性范围。 泰山白首乌历来被认为是白首乌的正品，而隔山消和滨海白首乌尽管也用作白首乌，但仍被认为是泰山白首乌的近缘品种。本研究发现，隔山消中总苯乙酮类成分的含量最高，滨海白首乌次之，泰山白首乌最低，总苯乙酮含量仅为隔山消的20%（图5）。栽培的隔山消中总苯乙酮含量与野生的相差不大，说明隔山消野生变家养驯化成功。
图 5 不同物种白首乌中苯乙酮类化学成分含量
滨海白首乌是目前流通的主流品种，江苏滨海、湖南、安徽、四川等地均有栽培，含量差异不大，然而野生的滨海白首乌总苯乙酮含量显著高于栽培品，说明该品种的种植存在着改良的空间，可以从种植环境、栽培技术等方面予以改进。
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本研究通过建立白首乌指纹图谱来评价白首乌药材的品质，对25批次不同白首乌的4种苯乙酮类指标性成分进行含量测定分析，并对其方法学进行考察。HPLC指纹图谱中相似度和聚类分析研究表明，泰山白首乌、滨海白首乌及隔山消的化学成分差异显著。HPLC含量测定分析发现，隔山消中总苯乙酮类的含量明显高于滨海白首乌和泰山白首乌。后续可以对3种白首乌的植物基源、化学成分、药理及毒理作用进行综合对比研究，为滨海白首乌和隔山消是否可以替代泰山白首乌作为白首乌正品药材应用，提供理论依据。
Species differences of Baishouwu based on characteristic chromatogram and content determination of acetophenones
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摘要:
目的 建立不同产地白首乌药材的指纹图谱，并测定苯乙酮类成分含量，为不同品种白首乌药材的质量控制提供科学依据。 方法 采用HPLC-DAD法建立白首乌药材HPLC指纹图谱，同时对4种苯乙酮类成分进行含量测定。其中，色谱柱为Diamonsil C18（4.6 mm× 250 mm, 5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸梯度洗脱，流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长为260 nm（4-羟基苯乙酮、白首乌二苯酮、2',4'-二羟基苯乙酮）和280 nm（2',5'-二羟基苯乙酮）。 结果 泰山白首乌、滨海白首乌及隔山消中化学成分差异显著，隔山消中总苯乙酮类成分含量明显高于滨海白首乌和泰山白首乌。 结论 以苯乙酮类成分为评价指标，隔山消的总苯乙酮含量较高，可作为白首乌药材的优质资源。 Abstract:Objectives To provide scientific basis for the quality control of different species of Baishouwu by establishing the HPLC fingerprint of domestic of Baishouwu and determining the main active components of acetophenones. Methods HPLC-DAD method was used to determine the HPLC fingerprints of domestic of Baishouwu. Then, the content of 4 kinds of acetophenones in Baishouwu was determined. The column was Diamonsil C18（250mm×4.6mm, 5μm）with the mobile phase of methanol and 0.1% phosphoric acid at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength of p-Hydroxyl acetophenone, baishouwu benzophenone, 2',4'-Dihydroxy acetophenone was set at 260 nm and 2',5'-Dihydroxy acetophenone at 280 nm respectively. Results The similarity and cluster analysis in HPLC fingerprint showed that the constituents were significantly different among C. bungei, C. auriculatum and C. wilfordii. The content of total acetophenones in C. wilfordii was significantly higher than that in other localities of C. auriculatum and C. bungei. Conclusions Acetophenone could be used as the evaluation index to evaluate the quality of Baishouwu in different origins. The content of total acetophenone in C. wilfordii is the highest, which could be used as the best quality resource of Baishouwu. -
Key words:
- Baishouwu /
- acetophenone /
- HPLC /
- characteristic chromatogram /
- contents determination
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骨质疏松性椎体压缩骨折（OVCF）属于脊柱骨折，多发于中老年人，为临床最为常见的骨质疏松性骨折之一，严重影响患者脊柱功能、日常活动能力等，且发病率、致残、致死率均较高。现阶段，临床多以经皮椎体成形术（PVP）对OVCF患者进行治疗，临床疗效确切，可迅速缓解骨折引起的疼痛，促进椎体形态和功能恢复，但其对患者骨质疏松程度及骨质疏松引起的疼痛改善效果欠佳，故临床倡导PVP术后予以适当的干预以改善手术效果[1]。西医临床常用药物为碳酸钙D3，但有研究[2]指出其对部分患者的干预效果较差，临床多与中医药物干预、锻炼等相结合对PVP术后OVCF患者进行治疗。中医学认为，OVCF属“骨痿”范畴，主要病机为肾精不足、气滞血瘀所致骨质枯槁，肝肾阴虚证为其主要证型之一，应治以滋补肝肾，填精壮骨[3]。中药膏方含阿胶、枸杞子、鸡血藤、党参等，根据临床中药机制可见其有补肾填精、益气健脾、通络止痛等功效，但其对PVP术后OVCF患者的疗效及机制尚未完全明确[4]。故设立本研究，以120例于我院行PVP治疗的OVCF患者为研究对象进行前瞻性随机对照研究，旨在进一步观察中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF患者的疗效，为其临床应用提供参考。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
前瞻性选取120例2016年1月至2017年9月于我院行PVP治疗的OVCF患者为研究对象，患者均知情同意，按随机数字表法将其分为观察组（60例），对照组（60例）。本研究经我院医学研究伦理研究委员会审核通过。观察组：男35例，女25例；年龄50~80岁，平均（66.27±2.15）岁；体质量指数（BMI）19~25 kg/m2，平均（22.35±0.41）kg/m2；骨质疏松病程1~5年，平均（2.51±0.22）年；骨折病程1~3周，平均（1.55±0.12）周；骨压缩程度[5]：轻度16例，中度30例，重度14例。对照组：男33例，女27例；年龄51~78岁，平均（66.18±2.20）岁；BMI 19~25 kg/m2，平均（22.41±0.42）kg/m2；骨质疏松病程1~5年，平均（2.48±0.20）年；骨折病程1~3周，平均（1.52±0.13）周；骨压缩程度：轻度15例，中度29例，重度16例。两组性别、年龄、BMI、骨质疏松病程、骨折病程、压缩程度等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 纳入标准
①中医诊断符合《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识（2015）》[6]中肝肾阴虚证相关辩证标准，西医诊断符合《骨质疏松性骨折诊疗指南》[7]中OVCF相关诊断标准，并经临床检查确诊者；②均为胸腰椎骨折，且是首次因OVCF就诊者；③无PVP相关禁忌，手术成功，且术后生命体征平稳者；④近3个月内未行特殊的抗骨质疏松治疗，同期未接受其他治疗者；⑤无脊髓损伤或神经根症状者等。
1.3 排除标准
①椎体爆裂性骨折、陈旧性胸腰椎压缩性骨折或肿瘤、感染等所致病理骨折者；②脊柱结核、骨肿瘤者；③继发性骨质疏松者；④精神障碍、认知能力或沟通能力障碍者；⑤伴严重器官障碍、急性腰扭伤、骨瘤骨转移、强直型脊柱炎、四肢新鲜骨折、软组织损伤者等。
1.4 方法
对照组予以碳酸钙D3咀嚼片[重庆海默尼制药有限公司，国药准字H20205039，碳酸钙1.25 g（相当于钙0.50 g）、维生素D3 200 IU]口服，每次1片，每日2次。同时指导患者每天摄入适量豆类、瘦肉、牛奶、鱼类等优质蛋白（1.20~1.40 g/kg），进行适当的日光浴及行走锻炼（30 min以上）。
观察组在对照组基础上予以中药膏方（将阿胶、枸杞子、鸡血藤、党参各200 g，鹿角胶、茯苓、桑寄生、熟地黄、牛膝、丹参、威灵仙各150 g，龟板胶、白术、骨碎补、神曲各100 g，炙甘草60 g制成膏剂后即得）口服，开水调服，每次10 g，每日2次。同时指导患者进行八段锦锻炼，所用方法为改良八段锦第八式：躯体直立，两足平行分开（与肩同宽），两手臂自然下垂，手指稍并拢，掌指向前，两膝关节屈曲135°~170°；两眼平视前方，微张口，平稳呼吸，全身放松2 min，紧接着保持原来体位尽可能屈膝下蹲，然后在双上臂伸直情况下慢慢上举到水平，慢慢随之站起（保持躯体直立下），至身体直立时顺势将两脚跟向上提起（期间慢慢匀速吸气到最满并憋气），停顿10~15 s；两脚跟下落着地，双手臂随之顺势下落，回到膝关节屈曲位（期间慢慢匀速呼气）；每次7个循环，每日3次。两组均治疗6个月，并随访3年。
1.5 观察指标
1.5.1 疗效
根据《中药新药临床研究指导原则》[8]可将两组治疗6个月后的疗效分为临床治愈（腰部功能完全恢复，临床症状、体征完全消失，X射线可见压缩椎体恢复正常状态），显效（腰部功能没有完全恢复，临床症状、体征基本消失，X射线可见压缩椎体恢复正常状态），有效（腰部功能没有完全恢复，临床症状、体征减轻，X射线可见大量骨痂形成，但未完全愈合），无效（腰部功能有改善，临床症状、体征有减轻，但X射线可见几乎无骨痂形成）。临床治愈率=临床治愈例数/总例数；显效率=显效例数/总例数；有效率=有效例数/总例数；无效率=无效例数/总例数。总有效率=（临床治愈+显效+有效）例数/总例数。
1.5.2 不同时点腰背疼痛情况
以疼痛视觉模拟评分法（VAS，0~10分）[9]评估两组治疗1、3、6个月的腰背疼痛情况，得分越高提示患者腰背疼痛程度越严重。
1.5.3 骨密度（BMD）、椎体后凸角度（Cobb角）及椎体前壁高度（AVBH）变化情况
以BMD测定仪（QDR 4500C，美国Hologic公司）检测两组治疗前、治疗6个月后的腰椎、股骨颈BMD；以X射线检查两组治疗前、治疗6个月后的Cobb角、AVBH。
1.5.4 骨代谢指标
抽取两组治疗前、治疗6个月后的晨起空腹静脉血3 ml，离心机3 000 r/min离心15 min，分离血清，以全自动电化学发光分析仪（罗氏Cobas e601，北京东方迈润医疗器械有限公司）检测血清I型原胶原降解产物（β-Cross I）、N端中段骨钙素（N-MID Ost）、甲状旁腺素（PTH）水平。
1.5.5 PVP术后推体再骨折发生率
记录两组随访时间及随访1年内、1~3年内PVP术后推体再骨折发生率，同1例患者发生多次再骨折仅算1例。
1.6 统计学方法
数据采用SPSS 21.0（IBM公司，美国）统计学软件进行分析，计量资料采用（
$\bar x $ ±s）表示，组内比较使用配对t检验，治疗前、治疗6个月后的比较使用独立样本t检验，多组间比较采用F检验；计数资料采用[n(%)]表示，使用χ2检验进行比较。2. 结果
2.1 两组患者临床疗效比较
治疗6个月后，观察组临床治愈率为73.33%，高于对照组的53.33%（P<0.05）；而两组显效率、有效率、无效率、总有效率比较差异无统计学意义（P>0.05，表1）。
表 1 两组患者临床疗效比较[n(%)]组别 例数 临床治愈率 显效率 有效率 无效率 总有效率 观察组 60 44(73.33) 13(21.67) 3(5.00) 0(0.00) 60(100.00) 对照组 60 32(53.33) 20(33.33) 8(13.33) 0(0.00) 60(100.00) χ2 5.167 2.048 2.502 P <0.05 >0.05 >0.05 2.2 两组患者不同时点腰背疼痛情况比较
治疗前，两组患者VAS评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗3、6个月后两组VAS评分均降低，且观察组低于对照组（P<0.05）；与治疗3个月后比较，治疗6个月后，两组VAS评分均降低（P<0.05，表2）。
表 2 两组患者不同时点腰背疼痛情况比较（$\bar x $ ±s，分）组别 例数 治疗前 治疗3个月后 治疗6个月后 观察组 60 7.55±0.37 2.47±0.33* 1.14±0.23** 对照组 60 7.52±0.35 3.51±0.51* 2.36±0.42** t 0.456 13.262 19.735 P >0.05 <0.05 <0.05 *P<0.05，与治疗前比较；**P<0.05，与治疗3个月后比较 2.3 两组患者BMD、Cobb角及AVBH变化情况比较
治疗前，两组患者BMD、Cobb角及AVBH比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗6个月后两组腰椎、股骨颈BMD及AVBH均升高，且观察组高于对照组（P<0.05）；而两组Cobb角均降低，且观察组低于对照组（P<0.05，表3）。
表 3 两组患者BMD、Cobb角及AVBH变化情况比较（$\bar x $ ±s）时间 组别 例数 腰椎BMD(g/cm3) 股骨颈BMD(g/cm3) Cobb角(°) AVBH(%) 治疗前 观察组 60 0.70±0.07 0.68±0.06 23.09±2.51 53.93±7.26 对照组 60 0.69±0.08 0.67±0.07 23.11±2.49 54.04±7.44 t 0.729 0.840 0.044 0.082 治疗6个月后 观察组 60 0.93±0.08* 0.93±0.07* 6.47±1.98* 96.56±9.41* 对照组 60 0.84±0.11* 0.85±0.08* 8.91±2.26* 85.73±8.04* t 5.125 5.829 6.290 6.778 *P<0.05，与治疗前比较 2.4 两组患者骨代谢指标比较
治疗前，两组患者血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗6个月后，两组血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平均降低，且观察组低于对照组（P<0.05，表4）。
表 4 两组患者骨代谢指标比较（$\bar x $ ±s）时间 组别 例数 β-Cross I(ng/ml) N-MID Ost(ng/ml) PTH(pg/ml) 治疗前 观察组 60 0.79±0.13 42.10±9.53 62.28±9.42 对照组 60 0.78±0.14 41.98±9.52 62.25±9.39 t 0.405 0.069 0.017 治疗6个月后 观察组 60 0.67±0.10* 36.15±5.46* 52.47±4.02* 对照组 60 0.73±0.12* 38.93±6.14* 57.45±5.72* t 2.975 2.621 5.518 *P<0.05，与治疗前比较 2.5 两组患者PVP术后推体再骨折发生率比较
两组患者随访时间、随访1年内、1~3年内PVP术后推体再骨折发生率比较，均无统计学意义（P>0.05）；随访3年内，观察组PVP术后推体再骨折发生率为3.33%，低于对照组的20.00%（P<0.05，表5）。
表 5 两组患者PVP术后推体再骨折发生率比较组别 例数 随访1年内发生率
[n(%)]随访1~3年内 合计
[n(%)]随访时间
($\bar x $±s, 年)发生率
[n(%)]观察组 60 2(3.33) 1.94±0.43 0(0.00) 2(3.33) 对照组 60 7(11.67) 1.86±0.72 5(8.33) 12(20.00) t/χ2 3.003 0.739 3.339 8.086 P >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 3. 讨论
骨质疏松为临床常见的慢性骨代谢异常疾病，可见骨钙含量减少、骨量下降，极易出现骨折，OVCF为其临床常见类型。OVCF发病后可致患者出现椎体高度下降、疼痛、功能障碍等，未得到及时有效的治疗，可致残、致死，且其再发骨折风险高[10]。现阶段，微创PVP治疗为大多保守治疗无效的OVCF患者的主要选择，可恢复椎体力学强度、稳定骨折，但骨转换率及骨量流失未能纠正，且手术造成的内外骨膜血管损伤及制动可能会加重骨质疏松而影响患者预后[11]。故PVP术后予以适当的干预治疗至关重要，临床常用药物为碳酸钙D3，其可促进骨质形成而缓解骨质疏松程度，但其多偏重于抑制骨吸收，减轻骨质流失。近年来，越来越多的研究[12-13]发现，中医药治疗PVP术后OVCF有一定成效，其既能抑制流失，又能促进成骨形成，在抗骨质疏松、促进骨折愈合、防治再骨折发生等方面优势明显，现已备受临床医生青睐，但关于何种药物更佳尚无统一定论。
中医认为OVCF属“骨枯”、“骨萎”、“痹证”等范畴，肾中精气是骨生长发育的根本，脾胃为后天之本，气血生化之源，故其发病机制主要为肾精亏虚、脾精不足所致骨骼失养；外伤导致筋脉损伤、气血运行不畅，加之患者湿热寒邪侵袭、肾脾虚亏，容易加重气滞血瘀症状，使得骨骼和筋骨失去濡养，导致骨关节萎缩、活动不利等而诱发OVCF，故治疗应补肾壮骨、活血行气、舒经通络、消肿止痛[14]。中药膏方中的阿胶、枸杞子、鹿角胶、龟板胶可补血益气、填精益髓，其中，龟鹿二仙胶中鹿角胶、龟板胶为主方，与党参、枸杞子配伍可增强益气养阴、补肾填精益髓之功；鸡血藤可活血补血、舒筋活络、疏风止痛；党参可补中益气、生血行血；茯苓可利水消肿、益气健脾；桑寄生、熟地黄、骨碎补、牛膝可补肾壮骨；丹参、威灵仙、神曲可健脾和胃、消食调中，进而减轻膏方的厚腻；炙甘草可补脾和胃，益气复脉，同时调和诸药；全方可发挥补肾填精、益气健脾、通络止痛之功效[15-16]。同时八段锦作为一种由八节不同动作组成的一套医疗、康复体操，其通过人体垂直方向的应力刺激成骨、下蹲平衡锻炼、膀胱经的经气疏通等可对OVCF患者产生舒筋活络的良好功效，进而有助于促进患者腰部功能恢复，提高患者临床疗效。本研究显示，治疗6个月后，观察组临床治愈率高于对照组，且治疗3、6个月后VAS评分低于对照组，进一步说明中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可有效缓解患者腰背疼痛，疗效显著。
OVCF的发生发展与骨代谢及转换密切相关，其中，β-Cross I为骨吸收的重要指标，N-MID Ost为骨形成、骨转换的重要指标，可直接反映成骨细胞的活性与数量变化，PTH则可加速骨代谢活跃，促进骨吸收，血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平升高提示患者骨转换成程度严重，可促进病情进展，不利于PVP术后腰部功能的恢复[17]。本研究显示，治疗6个月后，观察组腰椎、股骨颈BMD及AVBH高于对照组，Cobb角、血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH低于对照组，且随访3年内PVP术后推体再骨折发生率低于对照组，提示中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可调节患者机体骨代谢，提高腰椎、股骨颈BMD及AVBH，降低Cobb角，促进腰部功能的恢复，降低PVP术后推体再骨折发生率。PVP术后OVCF患者骨折愈合的本质为骨重建，该过程涉及局部微环境的构建、成骨细胞的活化、大量血管的生成等，而现代药理学研究[18-20]指出，中药膏方中的骨碎补含双氢黄酮苷、黄酮等成分，可提高BMD，刺激成骨细胞增殖分化，防止骨吸收、促进骨形成，发挥抗骨质疏松、促进骨折愈合等作用，进而促进腰部功能的恢复；牛膝含牛膝竹节参皂苷，可发挥较好的抗炎、止痛、改善微循环作用，有助于促进局部微环境的构建而促进患者骨折愈合，进而降低再骨折发生率。同时联合八段锦进行治疗，可有效疏通OVCF患者经络，促进机体气血运行通畅，进而可增强中药膏方促进患者腰部功能恢复的作用，降低患者PVP术后推体再骨折发生率。而对照组由于仅进行常规对症治疗，而未对患者采取中药膏方联合八段锦等治疗，故患者复发的风险明显增加。
综上，中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可降低其血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平，调节机体骨代谢，有助于提高腰椎、股骨颈BMD及AVBH，降低Cobb角，促进腰部功能的恢复，进而缓解患者腰背疼痛，降低PVP术后推体再骨折发生率，疗效显著。
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图 2 白首乌HPLC色谱图
A.白首乌指纹图谱；B.对照品；C.混合标准品；7. 4-羟基苯乙酮；8. 2',5'-二羟基苯乙酮；9. 白首乌二苯酮；10. 2',4'-二羟基苯乙酮
表 1 25批白首乌样品来源
样品 产地 物种 类型 S1 山东济南 泰山白首乌 栽培（两年） S2 山东临沂 泰山白首乌 栽培（两年） S3 山东泰安 泰山白首乌 栽培（一年） S4 山东临沂 隔山消 栽培（两年） S5 四川巴蜀 滨海白首乌 饮片 S6 湖南湘西 滨海白首乌 野生 S7 四川成都 滨海白首乌 饮片 S8 湖南张家界 滨海白首乌 饮片 S9 广东广州 滨海白首乌 饮片 S10 山东济南 隔山消 栽培（两年） S11 安徽阜阳 滨海白首乌 饮片 S12 四川遂宁 滨海白首乌 饮片 S13 安徽亳州 滨海白首乌 饮片 S14 江苏南京 滨海白首乌 饮片 S15 广西玉林 滨海白首乌 饮片 S16 江苏徐州 滨海白首乌 饮片 S17 贵州毕节 滨海白首乌 饮片 S18 江西南昌 滨海白首乌 饮片 S19 江苏滨海 滨海白首乌 饮片 S20 云南昆明 滨海白首乌 饮片 S21 云南大理 滨海白首乌 饮片 S22 安徽大别山 隔山消 野生 S23 四川广安 隔山消 野生 S24 陕西汉中 隔山消 野生 S25 河北安国 滨海白首乌 饮片 
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表 2 线性关系考察结果
成分 回归方程 R2 线性范围(μg) 4-羟基苯乙酮 Y=47 109X-22 868 0.999 9 0.015 61-0.499 6 2',5'二羟基苯乙酮 Y =23 028X-12 341 0.999 8 0.016 21-0.518 7 白首乌二苯酮 Y=15 075X-7 940.1 0.999 8 0.009 802-0.313 7 2',4'二羟基苯乙酮 Y=28 725X-12 816 0.999 9 0.013 34-0.427 0
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表 3 加样回收率实验结果
成分 加样量(m/g) 样品含量(m/mg) 加对照品量(m/mg) 测得量(m/mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 4-羟基苯乙酮 1.000 0 0.102 1 0.100 0 0.198 2 98.07 97.77 2.07 1.000 3 0.102 1 0.100 0 0.193 4 95.70 1.000 6 0.102 2 0.100 0 0.204 8 101.29 1.000 2 0.102 1 0.100 0 0.193 6 95.79 1.000 8 0.102 2 0.100 0 0.196 7 97.27 1.000 9 0.102 2 0.100 0 0.199 3 98.57 2',5'-二羟基苯乙酮 1.000 0 0.087 3 0.090 0 0.179 3 101.11 99.15 1.57 1.000 3 0.087 3 0.090 0 0.178 9 100.90 1.000 6 0.087 4 0.090 0 0.172 5 97.24 1.000 2 0.087 3 0.090 0 0.174 9 98.64 1.000 8 0.087 4 0.090 0 0.175 8 99.10 1.000 9 0.087 4 0.090 0 0.173 7 97.91 白首乌二苯酮 1.000 0 0.742 1 0.750 0 1.487 2 99.67 98.81 1.20 1.000 3 0.742 3 0.750 0 1.459 1 97.77 1.000 6 0.742 5 0.750 0 1.498 5 100.40 1.000 2 0.742 2 0.750 0 1.483 4 99.41 1.000 8 0.742 7 0.750 0 1.452 9 97.33 1.000 9 0.742 8 0.750 0 1.467 0 98.27 2',4'-二羟基苯乙酮 1.000 0 0.119 8 0.120 0 0.229 7 95.79 96.77 1.19 1.000 3 0.119 8 0.120 0 0.232 2 96.83 1.000 6 0.119 9 0.120 0 0.236 2 98.46 1.000 2 0.119 8 0.120 0 0.228 3 95.20 1.000 8 0.119 9 0.120 0 0.231 9 96.67 1.000 9 0.119 9 0.120 0 0.234 3 97.67
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表 4 25批白首乌中苯乙酮类化学成分含量测定结果(n=3，mg/g)
编号 4-羟基
苯乙酮2',5'-二羟
基苯乙酮白首乌
二苯酮2',4'-二羟
基苯乙酮总苯乙酮
类成分S1 0.274 8 − 0.071 8 0.137 6 0.529 8 S2 0.470 9 0.045 4 0.344 7 0.384 0 1.432 3 S3 0.069 5 − 0.015 4 0.077 6 0.196 7 S4 0.497 5 0.311 1 2.808 6 0.683 7 4.373 9 S5 0.380 5 0.044 2 0.696 7 0.218 3 1.397 9 S6 0.679 3 0.065 3 1.781 4 0.360 8 2.955 1 S7 0.277 1 0.064 5 0.890 9 0.338 9 1.598 0 S8 0.290 4 0.020 4 0.650 6 0.240 4 1.247 7 S9 0.070 8 0.059 6 0.595 7 0.086 9 0.858 2 S10 0.364 5 0.155 5 2.171 7 0.402 2 3.115 2 S11 0.202 0 0.132 1 1.697 6 0.264 5 2.328 4 S12 0.210 4 0.034 2 1.192 0 0.211 9 1.676 6 S13 0.114 5 0.084 2 1.011 4 0.127 6 1.372 0 S14 0.095 0 0.070 6 0.703 3 0.110 3 1.028 3 S15 0.061 5 0.041 7 0.482 9 0.067 4 0.701 4 S16 0.102 1 0.087 3 0.742 1 0.119 8 1.066 0 S17 0.067 6 0.026 8 0.522 4 0.121 5 0.804 0 S18 0.088 8 0.067 5 0.867 2 0.105 9 1.160 1 S19 0.084 3 0.048 8 0.705 2 0.112 0 0.966 7 S20 0.064 2 0.052 6 0.742 4 0.083 5 0.955 2 S21 0.072 6 0.048 3 0.424 0 0.068 0 0.648 6 S22 0.209 0 0.113 2 2.710 9 0.401 7 3.469 3 S23 0.212 9 0.118 3 2.683 9 0.410 0 3.456 4 S24 0.392 7 0.099 8 2.466 8 0.383 3 3.359 6 S25 0.110 5 0.092 3 1.023 1 0.161 4 1.400 3 注：“−”表示含量很低，超出线性范围。
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