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陈香露白露片的处方由陈皮、甘草、川木香、大黄、石菖蒲五味中药和碳酸镁、氧化镁、次硝酸铋、碳酸氢钠4种化学药组成[1]。方中陈皮行脾胃之气[2,3]，为君药，主要活性成分为橙皮苷、川陈皮素、橘皮素，与甘草配伍，健脾祛湿[4]；甘草苷、甘草酸铵为甘草的主要活性成分；川木香具行气止痛之效[5]，广泛用于腹痛，食欲不振等，木香烃内酯、去氢木香内酯为其主要活性成分。加之碳酸氢钠等碱性药物中和胃酸[6]，共成健胃和中、理气止痛功效。
陈香露白露片目前执行的质量标准为《卫生部药品标准WS3-B-1553-93》，该标准仅设置了化学药成分的质量控制参数，难以全面反映产品质量，存在较大的安全风险。为实现陈香露白露片内在质量的有效控制，本实验构建了同步测定陈香露白露片中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、橘皮素、川陈皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯等7种特征活性成分含量的HPLC方法。该研究不仅为提高该制剂质量提供了有效、可靠的分析方法，同时对药品安全风险评估的有效实施也具有重要的研究意义。
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1260高效液相色谱仪（安捷伦公司），配置DAD检测器；XS105DU电子天平、ME 204E电子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE数控超声仪（昆山超声仪器有限公司）。
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对照品甘草苷（批号：111610-201908，含量95.0%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，含量96.2%）、橙皮苷（批号：110721-202019，含量95.3%）、川陈皮素（批号：112055-202001，含量99.6%）、橘皮素（批号：112054-202001，含量99.8%）、木香烃内酯（批号：111524-201911，含量99.9%）、去氢木香内酯（批号：111525-201912，含量99.5%）均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞公司）；其余试剂均为分析纯（购于国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为娃哈哈纯净水。16批陈香露白露片样品来自3个生产厂家：广西圣特药业有限公司（企业1），批号201207（S1）、190202（S2）、200506（S3）、210106（S4）、210107（S5）、210110（S6）、201102（S7）；贵州百灵企业集团制药有限责任公司（企业2），批号20191211（S8）、20210105（S9）、20210111（S10）、20201212（S11）、20201001（S12）；四川康福来药业集团（企业3），批号200902（S13）、200901（S14）、201202（S15）、200601（S16），以上样品规格均为每片重0.3 g。
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采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（0~8 min，15% A；8~35 min，15% A→50% A；35~50 min，50% A；50~65 min，50% A→80% A；65~66 min，80% A→15% A；66~75 min，15% A），流速1.0 ml/min，柱温35 ℃，进样量10 μl，检测波长237 nm（0~15 min，检测甘草苷）、283 nm（15~25 min，检测橙皮苷）、237 nm（25~34 min，检测甘草酸铵）、330 nm（34~45 min，检测川陈皮素、橘皮素）、237 nm（45~75 min，检测去氢木香内酯、木香烃内酯）。
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取甘草苷、橙皮苷、甘草酸铵、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量，精密称定，用50%甲醇配制成浓度分别为55.72、1108、307.2、56.25、18.75、26.01、58.95 μg/ml的混合对照溶液。
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取陈香露白露片样品，研细，精密称取约1 g，置于锥形瓶中，精密加入25 ml 50%甲醇，超声30 min（功率250 W，频率33 kHz），放冷，精密称定，用50%甲醇补充损失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
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分别按陈香露白露片处方中各药比例制备缺陈皮、甘草、川木香的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成缺陈皮、甘草、川木香的阴性供试品溶液。
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对照品溶液、供试品溶液及缺陈皮、甘草、川木香的阴性供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进行测定分析。结果如图1所示，甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯等7种成分与相邻峰分离良好，分离度均大于1.5；阴性样品中其他成分色谱峰均未对7种成分产生干扰，表明该分析方法专属性良好。
图 1 陈香露白露片HPLC色谱图
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精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 ml置于5 ml容量瓶中，用50%甲醇稀释，制备6个浓度的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行测定，并绘制标准曲线，其中横坐标为对照品的浓度（X，μg/ml），纵坐标为峰面积（Y）。7种成分线性范围、线性回归方程与相关系数见表1。结果显示，7种成分分别在各自浓度范围内线性关系良好。
表 1 7种成分的线性范围、线性回归方程与相关系数
成分 线性范围（μg/ml） 回归方程 r 甘草苷 1.110~55.72 Y=17125X+155.53 0.9992 橙皮苷 22.15~1108 Y =5784.3X+7.1165 0.9995 甘草酸铵 6.140~307.2 Y =15716X+375.13 0.9999 川陈皮素 1.130~56.25 Y =21135X+32.117 0.9997 橘皮素 0.3700~18.75 Y =20148X+72.316 0.9982 木香烃内酯 0.5200~26.01 Y=21432X+4.1189 0.9991 去氢木香内酯 1.180~58.95 Y=15235X-135.15 0.9999 -
取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复测定6次。结果显示甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积6次测定结果的RSD分别为0.37%、0.38%、0.39%、0.42%、0.48%、0.75%、0.67%，表明该仪器精密度良好。
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按“2.2.2”项下方法平行制备6份陈香露白露片（批号：20210105）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量依次分别为1.158、4.002、10.68、0.0633、0.1477、0.1323、0.2927 mg/g，其RSD分别为0.62%、0.65%、0.64%、1.05%、1.62%、0.87%、1.28%，表明该方法重复性良好。
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取同一供试品溶液（批号：20210105），放置 0、4、8、12、16、20、24 h后，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积的RSD依次分别为0.54%、0.68%、0.72%、1.02%、0.85%、1.60%、1.32%，表明该供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。
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取已知含量的陈香露白露片（批号：20210111）9份，每份约0.5 g，精密称定，基于样品中7种成分的含量分别按低、中、高3种浓度水平加入对照品溶液（每个浓度各3份），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示7种成分的回收率分别为98.71%、98.12%、98.44%、98.22%、99.17%、99.18%、97.93%，RSD分别为0.16%、0.67%、0.57%、0.62%、0.48%、0.56%、0.58%，表明该方法准确性高。
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取16批陈香露白露片样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并在“2.1”项下色谱条件测定样品。外标法计算16批次样品中7种成分的含量，结果见表2。结果显示16批样品中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量分别为0.1250~1.174、2.354~7.426、1.822~27.21、0.0370~1.399、0.0723~0.4433、0.0140~0.1990、0.2207~1.407 mg/g。
表 2 16 批样品中7种成分含量测定结果（mg/g，n=2）
批号 甘草苷 橙皮苷 甘草酸铵 川陈皮素 橘皮素 木香烃内酯 去氢木香内酯 201207 0.5967 1.822 2.354 0.0847 0.1840 0.1990 0.9440 190202 0.6090 3.513 3.413 1.399 0.2773 0.0487 1.407 200506 1.053 9.611 3.643 0.351 0.0723 0.0140 0.4123 210106 0.6203 3.634 2.682 0.0433 0.0930 0.0673 0.2647 210107 0.6433 3.855 2.761 0.0480 0.2883 0.0460 0.2207 210110 0.2047 3.034 2.689 0.3313 0.1237 0.0993 0.2907 201102 0.6677 5.209 2.613 0.1530 0.2897 0.0417 0.4200 20191211 1.107 6.832 3.724 0.4360 0.0843 0.0180 0.2243 20210105 1.158 10.68 4.002 0.0633 0.1477 0.1323 0.2927 20210111 1.174 9.624 3.971 0.0370 0.0830 0.1857 0.8773 20201212 1.085 9.204 3.860 0.0993 0.2333 0.1890 0.4257 20201001 1.055 10.333 3.682 0.8917 0.1937 0.1023 1.293 200902 0.747 8.085 2.947 0.9430 0.2137 0.0870 1.326 200901 0.8807 27.21 3.080 1.044 0.2270 0.1263 0.5503 201202 0.5473 5.573 2.584 1.144 0.2437 0.1280 0.3333 200601 0.1250 5.374 7.426 0.0883 0.4433 0.0650 0.3890 -
本实验色谱条件参考《中华人民共和国药典》（2020年版）一部，237 nm为甘草苷、甘草酸铵的检测波长[7]，225 nm为木香烃内酯、去氢木香内酯的检测波长[7]，对两个检测波长均进行了待测成分响应值及专属性的考察，结果显示各成分在237 nm波长处响应值均较高且与杂质峰分离良好，故最终选择237 nm作为甘草苷、甘草酸铵、木香烃内酯、去氢木香内酯等4种成分的检测波长。而橙皮苷、川陈皮素、橘皮素均参考药典上的检测波长[7]。陈香露白露片中所含成分复杂，等度洗脱很难将7个化学成分同时分离，故采用梯度洗脱。
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利用SPSS软件以16批陈香露白露片中7种有效成分含量作为变量进行聚类分析。结果如图2所示，16批样品以度量值11为阈值，聚分为2大 类，其中一大类主要为企业2和3的样品，另一大类主要为企业1的样品。结果表明由于企业缺少对该品种中重要指标成分的含量控制，导致产品在不同企业，以及相同企业不同批次之间质量差异较大。
图 2 16批样品测定结果聚类分析图
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由表2得知，16批陈香露白露片7种主要成分含量差异较大。其中，橙皮苷含量差异主要表现在不同生产企业之间，主要原因可能是各生产企业使用了不同产地、不同采收期、不同生长年限的原药材导致的差异。而去氢木香内酯含量差异主要表现在同一生产企业的不同批次之间，其原因可能是药材养护措施不当、生产工艺控制参数不合理导致挥发性成分去氢木香内酯损失产生的差异。基于上述研究，建议生产企业加强对陈皮、甘草、川木香等原药材中关键活性成分的质量控制，建立高于《中华人民共和国药典》的内控标准，严格按批准的处方和生产工艺进行投料与生产，进一步提高陈香露白露片的质量一致性，从而实现其疗效的稳定性和有效性。
Simultaneous determination of seven constituents in Chenxiang Lubailu tablet by HPLC
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摘要:
目的 构建同步测定陈香露白露片中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯和去氢木香内酯含量的HPLC法。 方法 采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，流速1.0 ml/min，柱温35 ℃，检测波长237 nm（检测甘草苷、甘草酸铵、木香烃内酯、去氢木香内酯）、283 nm（检测橙皮苷）、330 nm（检测川陈皮素、橘皮素），进样量10 μl，对采集的16批次样品进行7种成分的含量检测。 结果 甘草苷、橙皮苷、甘草酸铵、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的线性范围分别为1.110~55.72（r=0.9992）、22.15~1108（r=0.9995）、6.140~307.2（r=0.9995）、1.130~56.25（r=0.9997）、0.3700~18.75（r=0.9982）、0.5200~26.01（r=0.9991）、1.180~58.95（r=0.9999）μg/ml。回收率（n=9）分别为98.71%、98.12%、98.44%、98.22%、99.17%、99.18%、97.93%，RSD分别为0.16%、0.67%、0.57 %、0.62%、0.48%、0.56%、0.58%。16批样品中甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量分别为0.1250~1.174、2.354~7.426、1.822~27.21、0.0370~1.399、0.0723~0.4433、0.0140~0.1990、0.2207~1.407 mg/g。 结论 该方法准确性高、重复性好、耐用性强，可用于陈香露白露片的质量控制和评价。 Abstract:Objective To establish the method for the simultaneous determination of liquiritin, ammonium glycyrrhizinate, hesperidin, nobiletin;tangeretin;costunolide, dehydrocostuslactone in Chenxiang Lubailu tablet by HPLC. Methods ZORBAX Eclipse XDB-C18 chromatographic column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used. The mobile phase was methanol-0.1% phosphoric acid solution. Gradient elution with flow rate of 1.0 ml/min was used. Column temperature was 35 ℃. Detection wavelength for liquiritin, ammonium, tangeretin, and costunolide was at 237 nm. Detection wavelength for glycyrrhizinate was at 283 nm. Detection wavelength for hesperidin and nobiletin was at 330 nm. Injection volume was 10 μl. 16 batches of samples were tested. Results The linear ranges for the detection of liquiritin, ammonium, glycyrrhizinate, hesperidin, nobiletin, tangeretin, and costunolide were 1.110 - 55.72 (r=0.9992), 22.15 - 1108 (r=0.9999), 6.140 - 307.2 (r=0.9995), 1.130 - 56.25 (r=0.9997), 0.3700 - 18.75 (r=0.9982), 0.5200 - 26.01 (r=0.9991), and 1.180 - 58.95 (r=0.9999) μg/ml respectively. The average recoveries were 98.71%, 98.12%, 98.44%, 98.22%, 99.17%, 99.18%, and 97.93%, and the RSDs were 0.16%, 0.67%, 0.57%, 0.62%, 0.48%, 0.56%, and 0.58% respectively. The contents of the seven components in 16 batches of samples were 0.1250 - 1.174, 2.354 - 7.426, 1.822 - 27.21, 0.0370 - 1.399, 0.0723 - 0.4433, 0.0140 - 0.1990, and 0.2207 - 1.407 mg/g respectively. Conclusion The method is accurate, reproducible and durable, which could be used to the quality control and evaluation of Chenxiang Lubailu tablet. -
Key words:
- HPLC /
- Chenxiang Lubailu tablet /
- liquiritin /
- ammonium glycyrrhizinate /
- hesperidin /
- nobiletin /
- tangeretin /
- costunolide /
- dehydrocostuslactone
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溃疡性结肠炎（ulceractive colitis, UC）属于炎症性肠病的一种，有着较高的发病率，其特征为损伤性炎症，近年来有关其病因及发病机制的研究受到广泛关注，但至今仍不明确[1]。对于溃疡性结肠炎的治疗目前多采用手术、抗感染、糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗，但上述治疗手段均为对症治疗，且药物长期使用的不良反应很容易造成疾病复发[2]。因此，探究溃疡性结肠炎的发病机制，将为今后治疗药物的研发提供理论基础。
Metrnl（Meteorin-like）是近年来新发现的神经营养因子，也叫Cometin, Subfatin或是IL-39[3-4]。 Jorgensen等[4]在2012年将Metrnl描述为类似于Meteorin（Metrn）的神经营养因子。Metrnl基因开放阅读框包含4个外显子，由936个碱基对编码311个氨基酸。Metrnl蛋白包含45个N端信号肽序列，切除信号肽后的266个氨基酸构成分子量约为30 000的成熟蛋白分子，整个蛋白分子没有穿膜区域，是一种分泌蛋白。到目前为止，关于Metrnl功能的研究较少，我们前期针对该蛋白相关研究确认Metrnl为一种新的细胞因子，阐明了Metrnl通过PPARγ信号通路介导胰岛素的增敏作用的重要机制[5]。 Jorgensen等[4]报道了Metrnl在神经突触生长和成神经细胞迁移中的神经营养活性。Watanabe等[6]报道，Metrnl是潜伏过程（Latent process，LP）基因，可用于细胞分化和神经突触延伸。脂肪组织Metrnl能促进脂肪细胞分化、改善代谢、抑制炎症从而调节脂肪功能，对抗肥胖引起的胰岛素抵抗[7]。通过检测Metrnl在各种组织中的表达，我们发现Metrnl在人和小鼠胃肠组织中，特别是在肠上皮细胞中都高度表达，并发现肠上皮Metrnl敲除后可以通过抑制肠上皮细胞的自噬而加重溃疡性结肠炎，提示 Metrnl是溃疡性结肠炎的治疗靶点[8]。
肠道微环境形成了良好的微生物群栖息地，肠道微生物群被认为是人体的重要器官，越来越多的研究将这种微生物环境与胃肠道疾病联系起来。肠道菌群在溃疡性结肠炎中起着重要作用，如在无菌状态下，无法制备出某些小鼠结肠炎模型（如IL-10缺陷型小鼠等）[9-10]。也有研究报道，在治疗溃疡性结肠炎患者时，联合使用抗生素也显示出了较好疗效[11]。此外，与健康人群相比，溃疡性结肠炎患者的肠道菌群组成也发生了显著变化[12]。但由于人类肠道菌群的复杂性和多样性，目前尚未清楚某些特定菌属与溃疡性结肠炎发病机制的关系。
因此，本研究聚焦溃疡性结肠炎，从肠道微生态角度出发，探究肠上皮Metrnl对于溃疡性结肠炎的作用以及对肠道菌群调节机制的影响。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂和仪器
雄性C57小鼠（8周龄，20只，16~20 g），上海西普尔-必凯实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016）。Villin-cre小鼠[B6.Cg-Tg(Vil1in-cre)1000Gum/J，021504]，2只，16~20 g，美国JAX公司（北京澄天生物科技有限公司代理），生产许可证号：SYXK（京）2018-0016），用于产生肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠（Metrnl(-/-)）。所有小鼠饲养于相对洁净环境下，使用独立通风系统（individual ventilated cages, IVC）动物房，温度恒定（22~26 ℃），室内明暗交替12 h（08:00至20:00照明），相对湿度为40%~70%，笼内维持正压20~25 Pa，每小时换气60~70次。所有实验动物的使用，都经过海军军医大学动物管理机构的同意和认证，符合实验动物饲养及相关管理规定。所有动物实验均按照美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行，并得到海军军医大学动物伦理委员会的批准。IVC系统购自上海鸣励实验室科技发展有限公司。TRIzol试剂（15596026），美国Invitrogen公司；葡聚糖硫酸钠盐（dextran sodium sulfate，DSS），MFCD00081551，分子量36 000~50 000，美国MP公司，引物，生工生物工程有限公司；包埋机（JB- L5，德国徕卡有限公司）；切片机（RM2126，德国徕卡有限公司）；RT-PCR仪器（ABI 7500系统，美国赛默飞公司）；粪便DNA提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，Qiagen, Hilden, 德国）；紫外微量分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Scientific, 美国）；DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA GelExtraction Kit，Axygen Biosciences, 美国）；微型荧光计（QuantiFluor-ST，Promega, 美国）；测序仪（Illumina MiSeq，Illumina, 美国）。
1.2 肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠的制备
首先按照本课题组已报道的方法[5]制备Metrnlloxp/loxp小鼠。根据报道的Metrnl(-/-)小鼠的繁殖策略[13]，即将Metrnlloxp/loxp小鼠与购买的Villin-Cre小鼠进行交配，产下后代小鼠基因型为Metrnlloxp/wtVillin-Cre。将Metrnlloxp/wtVillin-Cre小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠交配，产生下一代Metrnlloxp/loxpVillin-Cre小鼠。继续与Metrnlloxp/loxp交配，产下的后代，经基因型鉴定分别为Metrnlloxp/loxpVillin-Cre（Metrnl(-/-)）和Metrnlloxp/loxp（Metrnl(+/+)）。
1.3 RT-PCR定量肠道组织Metrnl mRNA表达
按照本课题组已报道的方法[3]，使用TRIzol试剂从肠道组织中提取总RNA，并使用ABI 7500系统进行RT-PCR。最终的20 μl反应混合物包括10 μl SYBR Green，2 μl cDNA模板和1 μl引物。通过重复反应确定平均阈值循环（Ct），将靶基因表达标准化为GAPDH，并使用ΔΔCT方法获得定量测量结果。Metrnl上游引物（F）CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT，下游引物（R）GGACAACAAAGTCACTGGTACAG；GAPDH上游引物（F）GTATGACTCCACTCACGGCAAA，下游引物（R）GGTCTCGCTCCTGGAAGATG。
1.4 DSS诱导肠炎模型制备
雄性C57小鼠（8周龄）于实验室适应2周后，按照本课题组已报道的方法进行模型制备[7]，将DSS溶于水中，分别至终浓度为3%和1%，让小鼠自由饮用。
小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分，按照我们之前已报道的的评分标准进行评分[8]，对体重下降程度、大便性状、血便情况共3部分分别进行评分，然后进行加和，计算总分数。具体评分标准如下（表1）。
表 1 小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分表疾病评分 体重下降 (%) 大便性状 大便潜血 0 <1 正常 阴性 1 ≥1-5 - + 2 ≥5-10 软 ++ 3 ≥10-15 - +++ 4 ≥15 腹泻 ++++ 注：“-” 无此性状；“+” 潜血程度。 1.5 结肠长度检测及HE染色
小鼠处死后，取整个结肠部位，测量长度进行比较。然后将结肠下段部位组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片机切至4 μm的切片，按照之前的实验方法[14]，进行HE染色，染色后在光学显微镜下观察炎症细胞浸润情况，组织损伤情况并拍照记录。
1.6 肠道菌群测定
使用16S核糖体RNA基因测序技术检测肠道菌群。为了进行样品收集和DNA提取，从实验小鼠中收集粪便样品，并在取样后3h内将其冷冻在−80°C下。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit进行DNA提取。使用NanoDrop 2000测量细菌DNA的浓度。然后，将16S核糖体RNA基因测序用于检测细菌DNA。基因的V3-V4区域使用FastPfu聚合酶通过条形码索引引物（338F和806R）进行PCR扩增。然后通过AxyPrep DNA GelExtraction Kit，凝胶提取纯化扩增子，并使用QuantiFluor-ST进行定量。将纯化的扩增子以等摩尔浓度合并，并使用Illumina MiSeq仪器进行末端配对测序。
1.7 微生物宏基因组学分析
16S rRNA测序数据由Quantitative Insights Into Microbial Ecology平台（V.1.9.1）处理，并进行了MegaBLAST搜索，将生物分类单位的读数（OTU）与国家生物技术信息中心16S rRNA数据库中的参考序列比对。按照文献报道的方法[15]进行宏基因组学分析，从16S rRNA序列推算肠道微生物组的基因组，并且对每个样品的基因含量进行了预测。
1.8 统计分析
本实验结果数据以（
$\bar x $ ±s）表示，使用SPSS18.0软件进行统计分析。多组以上比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），各组与正常对照组比较采用Dunnett t检验法，两组比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 Metrnl(-/-)小鼠未表现结肠炎症状
我们构建了肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除（Metrnl(-/-)）小鼠，并检测了Metrnl mRNA在大肠和小肠组织中的表达。结果表明，Metrnl(-/-)小鼠中Metrnl mRNA的表达在结肠和小肠组织中极低（图1A）。 HE结肠切片显示Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间均无组织损伤和炎症细胞浸润（图1B）。以上结果表明，肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除后不会诱发溃疡性结肠炎。
2.2 溃疡性结肠炎模型制备条件的选择
在建立DSS诱发的溃疡性结肠炎模型之前，为了选择最佳的观察时间和DSS给药浓度，我们分别选择3％DSS和1％DSS进行造模，并观察了不同DSS浓度下C57小鼠的存活时间。结果显示，在3％DSS组的第6天，出现了小鼠死亡；直至给药10 d，全部小鼠死亡（图2A）。在1％DSS组中，未观察到小鼠死亡。与对照组相比，3％DSS组的小鼠体重在第5天时显著性降低（P<0.05），而1％DSS组的体重并无显著改变（图2B）。同样，与对照组相比，3％DSS组小鼠DAI增加（P<0.05），结肠长度显著性缩短（P<0.05），而1％DSS组在疾病活动指数、结肠长度方面均无明显变化（图2C-D）。 组织形态学方面，3％DSS组表现出结肠炎表型，具有明显的组织损伤，而对照组并无明显变化（图2E）。因此，我们选择3％DSS和5 d的给药时间作为后续实验条件。
2.3 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响
给予Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠3％DSS后，两组小鼠均表现出溃疡性结肠炎症状，其特征为持续的体重减轻、疾病活动指数增加、血性腹泻、结肠长度缩短以及结肠炎症（图3）。在此过程中，在给药后第5天时，与Metrnl(+/+)小鼠体重减轻（−8.27± 1.32）%相比，Metrnl(-/-)小鼠的体重减轻（−14.92±1.05）%，具有统计学差异（P<0.05，图3A）；与Metrnl(+/+)小鼠的疾病活动指数（6.00±1.63）相比，Metrnl(-/-)小鼠显著增加至（9.67±1.38）（P<0.05，图3B）；与Metrnl(+/+)小鼠结肠长度（7.08±0.89 cm）相比，Metrnl(-/-)小鼠结肠更短（5.77±0.58 cm）（P<0.05）（图3D）；为了排除上述差异不是由小鼠摄入不同量的3%DSS引起的，我们还检测了两组小鼠的饮水量。结果显示两组小鼠饮水量之间并无显着差异（图3C）。
图 3 Metrnl敲除后对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响A. 体重；B.疾病评分；C.水摄入量；D.结肠长度；E.结肠组织HE染色P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。2.4 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的菌群平衡的影响
我们通过高通量16S rRNA基因测序，检测了Metrnl对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中肠道菌群的影响。应用Chao1 丰度估计量（chao1 richness estimator），香农多样性指数（shannon diversity index），辛普森多样性指数（simpson diversity index）三种指标评价各组小鼠中菌群的Alpha多样性（图4A-C）。结果显示，在未进行DSS造模之前，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠的Alpha多样性并无显著差异；而进行3%DSS造模后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠出现了差异，其中Metrnl(-/-)小鼠多样性显著下降（图4A-C）。主成分分析显示，在给予3%DSS造模后的Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间微生物的组成显著不同（图4D）。检测小鼠粪便微生物组成，结果显示，在“门”这一层面，给予3%DSS后拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria）在Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间存在显著的不同（图4E）。在Metrnl(-/-)小鼠中，Bacteroidetes和Proteobacteria显著降低，而Firmicutes显著升高。在“纲”这一层面，发现给予DSS后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）具有显著差异。值得注意的是，拟杆菌纲（Bacteroidia）属于拟杆菌门（Bacteroidetes）；梭菌纲（Clostridia）属于厚壁菌门（Firmicutes）（图4F）。为了进一步探究影响给予DSS后造成Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间状态的原因，我们又在“目”层面进行了检测，结果显示（图4G），拟杆菌目（Bacteroidales），属于杆菌纲（Bacteroidia）；梭菌目（Clostridiales），属于梭菌纲（Clostridia）发生了显著改变。
图 4 肠上皮Metrnl 敲除对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群动态平衡的影响A. Chao1丰度估计量；B.香农多样性指数；C.辛普森多样性指数；D.主成分分析；E.门水平上的丰度；F.纲水平上的丰度；G.目水平上的丰度P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。3. 讨论
本研究用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型并从对肠道微生物影响的角度出发，探究肠上皮Metrnl特异性敲除对于肠道菌群调节的影响以及对溃疡性结肠炎的作用。发现Metrnl在溃疡性结肠炎小鼠模型中具有保护的功能，该效应可能是Metrnl通过对肠道菌群的调节所致。 近期有一篇关于Metrnl改善克罗恩氏病（CD）的报道，该研究表明肠系膜脂肪组织与肠道存在交互作用，发现小鼠在给予Metrnl后，可通过激活STAT5/PPARγ信号通路，从而达到促进脂肪细胞分化来减轻肠系膜脂肪组织病变的作用[16]。该研究表明Metrnl确实可以影响炎症性肠病的发生发展。除此以外，我们进一步证实了，肠上皮特异性Metrnl敲除后可以加重DSS诱导的溃疡性结肠炎，并且该作用是通过抑制AMPK-mTOR-p70S6K通路，下调了肠上皮细胞自噬水平产生的[7]。
肠道微环境形成了合适的微生物群栖息地，已证明会影响多种消化系统疾病的发生[17]。肠道菌群稳态的紊乱已被广泛认为与炎症性肠病的发病机制和进展密切相关[8]。肠道菌群主要有三种功能，分别是代谢作用，保护作用和营养作用[18-19]。正常人肠道中在“门”这一层面，主要有四类微生物群，包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形杆菌门（Proteobacteria）[20-21]。
溃疡性结肠炎的主要特征是有益细菌的减少。拟杆菌门（Bacteroidetes）是革兰阴性厌氧细菌，构成了哺乳动物胃肠道中主要微生物群[22]。目前认为，拟杆菌门可以通过免疫调节和维持体内平衡而对宿主发挥有益作用。据报道，拟杆菌门可以通过分泌多糖A（polysaccharide A, PSA）来增强抗炎因子IL-10的mRNA表达[23-24]。本研究结果显示出类似趋势，在给予3%DSS进行溃疡性结肠炎造模后，Metrnl(-/-)小鼠症状更加严重，与Metrnl(+/+)小鼠相比，其拟杆菌门的成分显著下降。然而，拟杆菌门在溃疡性结肠炎中并不完全有益。有报道显示，拟杆菌门可以侵入肠道组织并引起个别患者的肠道损伤[25]。因此针对该类菌属的作用还有待进一步验证。除此以外，由于SCFA具有增强肠壁屏障和免疫系统的作用，从而有助于抵抗病原体，因此产生SCFA的菌群目前认为对人体是有益的，例如Faecalibacterium prausnitzii，Roseburia或Eubacterium[26-28]。放线菌门（Actinobacteria）中的双歧杆菌属（Bifidobacterium）也是有益菌群[29-30]。然而，在该属中发现了有争议的结果，因为有研究报道显示，与对照组相比，溃疡性结肠炎患者的Bifidobacterium增加了[31- 32]，其原因可能是疾病程度的造成的。因此，需要进一步的研究来阐明该有益菌群在溃疡性结肠炎中的作用。
相反的，目前很多研究显示菌群在溃疡性结肠炎中显著增加，如变形杆菌门（Proteobacteria）下的黏附侵入性大肠杆菌属（adherent-invasive Escherichia coli）和巴斯德杆菌属（Pasteurellaceae），厚壁菌门（Firmicutes）下的韦荣氏球菌属（Veillonellaceae）和瘤胃球菌属（Ruminococcus gnavus），梭杆菌属（Fusobacterium）。我们的研究结果也显示出类似趋势，在给予DSS后，与Metrnl(+/+)小鼠相比，Metrnl(-/-)小鼠的厚壁菌的成分显著上升。除此以外，以下菌属也被认为具有潜在致病性，如大肠杆菌属（Escherichia），沙门菌属（Salmonella），耶尔森菌属（Yersinia），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），幽门螺杆菌属（Helicobacter），弧菌属（Vibrio）[31, 33-36]。目前报道较多的是黏附侵入性大肠杆菌，此种细菌能够黏附并穿过肠道黏液屏障，侵入肠道上皮层，促进TNFα分泌和炎症的发生[37-38]。本研究表明，肠上皮特异性Metrnl敲除后，在3%DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中，导致肠道菌群动态平衡的进一步紊乱，表明恢复菌群动态平衡对于治疗溃疡性结肠炎至关重要。
需要注意的是，大量研究表明，目前并没有明确具体的哪一种微生物群对人体是有益的，因为每个人的菌群特征都不同。一般而言，只有相对平衡的微生物群，才能最佳地维持人体的代谢和免疫功能以及预防疾病的发展。在健康的肠道中，病原菌和共生菌群可以共存而不会出现问题。但是，这种平衡的任何紊乱都会导致营养不良，从而改变微生物与宿主之间的相互作用[39]。尽管目前普遍认为溃疡性结肠炎中肠环境平衡的破坏是显著发生的，但是造成肠道平衡紊乱的生物学机制的仍然未知，并且不清楚这种紊乱究竟是造成溃疡性结肠炎的原因还是结果。
本研究仍存在不足。首先，肠道微生态对溃疡性结肠炎的保护作用的详细机制仍未探究清楚，特别是肠道中存在的主要4类微生物群（拟杆菌，厚壁菌，放线菌，变形杆菌）对溃疡性结肠炎的作用还有待证实。其次，肠上皮特异性Metrnl敲除后通过调节肠道菌群的组成，从而加重3%DSS诱导的溃疡性结肠炎的作用证据仍不十分充分，需要今后在进一步的研究中加以阐明。
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图 1 陈香露白露片HPLC色谱图
1.甘草苷; 2.橙皮苷; 3.甘草酸铵; 4.川陈皮素; 5.橘皮素; 6.木香烃内酯; 7.去氢木香内酯; A.混合对照品; B.供试品; C.缺川木香阴性样品; D.缺甘草阴性样品; E.缺陈皮阴性样品
表 1 7种成分的线性范围、线性回归方程与相关系数
成分 线性范围（μg/ml） 回归方程 r 甘草苷 1.110~55.72 Y=17125X+155.53 0.9992 橙皮苷 22.15~1108 Y =5784.3X+7.1165 0.9995 甘草酸铵 6.140~307.2 Y =15716X+375.13 0.9999 川陈皮素 1.130~56.25 Y =21135X+32.117 0.9997 橘皮素 0.3700~18.75 Y =20148X+72.316 0.9982 木香烃内酯 0.5200~26.01 Y=21432X+4.1189 0.9991 去氢木香内酯 1.180~58.95 Y=15235X-135.15 0.9999 
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表 2 16 批样品中7种成分含量测定结果（mg/g，n=2）
批号 甘草苷 橙皮苷 甘草酸铵 川陈皮素 橘皮素 木香烃内酯 去氢木香内酯 201207 0.5967 1.822 2.354 0.0847 0.1840 0.1990 0.9440 190202 0.6090 3.513 3.413 1.399 0.2773 0.0487 1.407 200506 1.053 9.611 3.643 0.351 0.0723 0.0140 0.4123 210106 0.6203 3.634 2.682 0.0433 0.0930 0.0673 0.2647 210107 0.6433 3.855 2.761 0.0480 0.2883 0.0460 0.2207 210110 0.2047 3.034 2.689 0.3313 0.1237 0.0993 0.2907 201102 0.6677 5.209 2.613 0.1530 0.2897 0.0417 0.4200 20191211 1.107 6.832 3.724 0.4360 0.0843 0.0180 0.2243 20210105 1.158 10.68 4.002 0.0633 0.1477 0.1323 0.2927 20210111 1.174 9.624 3.971 0.0370 0.0830 0.1857 0.8773 20201212 1.085 9.204 3.860 0.0993 0.2333 0.1890 0.4257 20201001 1.055 10.333 3.682 0.8917 0.1937 0.1023 1.293 200902 0.747 8.085 2.947 0.9430 0.2137 0.0870 1.326 200901 0.8807 27.21 3.080 1.044 0.2270 0.1263 0.5503 201202 0.5473 5.573 2.584 1.144 0.2437 0.1280 0.3333 200601 0.1250 5.374 7.426 0.0883 0.4433 0.0650 0.3890
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[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准(中药成方制剂第八册)[S]. 1993: 87. [2] 高学敏. 中药学[M]. 北京: 中国中医药出版社, 2002: 432. [3] 吴惠君, 欧金龙, 池晓玲, 等. 陈皮药理作用研究概述[J]. 实用中医内科杂志, 2013, 27(9s):91-92. [4] 杨豆, 张卫波. 甘草化学成分及药理作用研究[J]. 湖南饲料, 2017(3):21-23. doi: 10.3969/j.issn.1673-7539.2017.03.010 [5] 毛景欣, 王国伟, 易墁, 等. 川木香化学成分及药理作用研究进展[J]. 中草药, 2017, 48(22):4797-4803. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.22.032 [6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（二部）2020年版[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020. [7] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）2020年版[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020. -
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