下载:
下载:
-
氯新酮乳膏为解放军联勤保障部队第九八三医院的特色制剂，处方由酮康唑、哈西奈德和硫酸新霉素等组成，具有抗真菌、细菌感染及抗炎作用[1-2]。酮康唑为咪唑类抗真菌药，能降低真菌细胞色素 P450 的活性，妨碍真菌细胞膜合成类固醇，从而破坏真菌细胞膜结构，导致细胞内物质外泄；硫酸新霉素为氨基糖苷类抗生素；哈西奈德为皮质激素类药物，具有高效的抗炎作用。该药主要用于体癣、股癣、手足癣、皮肤念珠菌病、接触性皮炎、虫咬皮炎、神经性皮炎、湿疹及脓疱疮等皮肤病[2-4]，在临床应用多年，疗效确切。为了很好的控制该药质量，我们对其质量标准进行了完善和修订，重新建立了硫酸新霉素的含量测定方法，现报道如下。
-
Agilent 1260高效液相色谱仪，OpenLAB CDS色谱工作站，ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；酮康唑对照品（含量99.0%，批号：100296-201302）、哈西奈德对照品（含量99.2%，批号：100146-201504）、新霉素标准品（652单位/mg，批号：130309-201512）均购自中国食品药品检定所；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。氯新酮乳膏[批号：20190620，20190624，20190628，规格：10 g/支，其中：酮康唑1%（g/g），哈西奈德0.1%（g/g），硫酸新霉素5 000单位/g]由本院制剂室提供。
-
取本品1.0 g，加甲醇3 ml，搅拌2 min，分取甲醇溶液并过滤，于水浴上蒸发至干，向残渣加入甲醇0.5 ml，搅拌1 min，置离心管中，于冰水浴中冷却1 h，取出后迅速离心，取上清液作为供试品溶液。另取哈西奈德对照品1 mg、酮康唑10 mg分别加甲醇0.5 ml，振摇使溶解（必要时超声），作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各10 µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（3∶1∶0.5）为展开剂，展开，以碘蒸汽显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品未见干扰（见图1）。
图 1 氯新酮乳膏中哈西奈德、酮康唑的薄层鉴别
-
取本品约1.5 g（相当于硫酸新霉素7 500单位），置具塞离心管中，加三氯甲烷10 ml与水15 ml，强烈振摇，离心，取上层清液，作为供试品溶液。另取硫酸新霉素标准品，加水制成每1 ml约含2 mg的溶液作为标准品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020版四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10 µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲醇-三氯甲烷-氨水（13.5 mol/L）（60∶20∶40）为展开剂，展开，晾干，喷以1%茚三酮正丁醇溶液，在105 ℃加热2 min，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品未见干扰（见图2）。
图 2 氯新酮乳膏中硫酸新霉素的薄层鉴别
-
哈西奈德和酮康唑对照品溶液：精密称取酮康唑对照品49.98 mg，哈西奈德对照品10.02 mg，置25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制备对照品溶液（酮康唑为1.999 mg/ml，哈西奈德为0.400 8 mg/ml）。
新霉素标准品溶液：精密称取新霉素标准品约250.08 mg于25 ml的量瓶中，加水适量溶解并定容至刻度，摇匀，即为新霉素储备液10.00 mg/ml，相当于6 520单位/ml。精密量取储备液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 ml，置25 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，获得浓度分别为130.4、260.8、521.6、782.4、1 304、2 608单位/ml的标准品溶液。
-
哈西奈德和酮康唑供试品：取本品约2.5 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加90%甲醇30 ml至80 ℃水浴中加热2 min，振摇使溶解，放冷至室温，加水8.3 ml，再加90%甲醇至刻度，摇匀，于冰水浴中冷却2 h，取出后迅速滤过，弃去初滤液，取续滤液，离心，放至室温，即得。
硫酸新霉素供试品：精密称取本品约7.0 g于锥形瓶中，加三氯甲烷10 ml，振摇使基质分散，加3%盐水10 ml振摇后转移至100 ml分液漏斗中，强力振摇后，静置分层，分取水层置25 ml量瓶中，同法用水提取2次，每次5 ml，合并水层，用水定容至刻度，摇匀，取适量于离心管中，4 000 r/min离心15 min，取上清液，即得。
-
酮康唑和哈西奈德的阴性对照溶液：按照样品制备方法制备缺酮康唑和哈西奈德乳膏，按照2.2.1.2方法制备阴性对照溶液。
硫酸新霉素的阴性对照溶液：按照样品制备方法制备缺硫酸新霉素的乳膏，按照2.2.1.2方法制备阴性对照溶液。
-
色谱条件与系统适用性试验：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以甲醇-磷酸盐缓冲液（pH=7.40）75∶25为流动相，检测波长235 nm，流速1.0 ml/min。
-
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，结果见图3，供试品溶液中特征峰与对照品峰具有相同保留时间，阴性对照对应位置无干扰。
图 3 酮康唑和哈西奈德的HPLC图谱
-
分别精密吸取对照品溶液1、2、4、5、6、8、10和20 μl，依次进样，测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归得，酮康唑：Y=78 309X−180.73，r=0.999 9（n=8）；哈西奈德： Y=18 716X−50.475，r=0.999 9（n=8）。结果表明，酮康唑在1.999~39.98 μg的范围内, 哈西奈德在0.400 8~8.016 μg的范围内呈良好的线性关系。
-
精密吸取同一混合对照品溶液10 μl，按2.2.2.1项下色谱条件连续进样6次，按峰面积计算，结果哈西奈德和酮康唑的日内精密度RSD值分别为1.1%和0.7%（n=6）；连续进样5 d，记录峰面积，得哈西奈德和酮康唑的日间精密度RSD值为1.2%和0.8%（n=5），表明仪器精密度良好。
-
取同一批样品溶液（批号：20190620），分别于0、1、2、3、4、5、7和10 h测定，记录峰面积，哈西奈德和酮康唑的RSD为2.1%和1.8%（n=6），表明供试品溶液在10 h内稳定。
-
取同一批样品6份（批号：20190620），按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定，记录色谱图并计算含量。酮康唑和哈西奈德的平均标示百分含量分别为98.21%、103.0%，RSD为1.3%和1.1%，表明方法的重复性良好。
-
精密称取9份不含酮康唑和哈西奈德的阴性乳膏样品2.5 g，分别按照标示量的80%、100%、120%加入酮康唑（约20、25、30 mg）和哈西奈德（约2、2.5、3 mg）对照品适量，测定含量，计算样品回收率。结果酮康唑的平均回收率为97.75%，RSD为0.77%（n=9），哈西奈德的平均回收率为97.57%，RSD为0.84%（n=9），具体见表1。
表 1 氯新酮乳膏中酮康唑和哈西奈德回收率试验结果（n=9）
待测物 样品量
（g）加入量
（μg/ml）测得量
（μg/ml）回收率
（%）平均值
（%）RSD
（%）酮康唑 2.501 2 399.6 395.6 99.00 97.75 0.77 2.498 2 399.6 392.2 98.15 2.483 3 399.6 391.5 97.97 2.510 6 503.1 486.1 96.62 2.508 7 503.1 489.6 97.32 2.496 4 503.1 488.8 97.16 2.501 2 591.3 578.4 97.82 2.486 9 591.3 583.2 98.63 2.993 7 591.3 574.3 97.12 哈西奈德 2.501 2 40.12 38.78 96.66 97.57 0.84 2.498 2 40.12 39.12 97.51 2.483 3 40.12 39.15 97.58 2.510 6 49.53 48.78 98.49 2.508 7 49.53 48.36 97.64 2.496 4 49.53 49.12 99.17 2.501 2 59.77 57.97 96.99 2.486 9 59.77 57.74 96.60 2.993 7 59.77 58.26 97.47 -
3批样品（20190620、20190624、20190628），按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定，记录色谱图。结果3批样品哈西奈德的标示量百分含量分别为102.2%、104.5%、99.8%（n=3），酮康唑的标示量百分含量分别为99.2%、98.6%、102.5%（n=3）。
-
用旋光法对阴性对照溶液进行测定，旋光度为0，表明样品中其他成分和辅料不干扰硫酸新霉素的测定。
-
取不同浓度的标准品溶液分别测定，以旋光度（Y）为纵坐标，浓度（单位/ml）为横坐标（X），绘制标准曲线，并进行线性回归，得：Y = 8.60E-05 X，r=0.999 8（n=6）。结果表明，新霉素在130.4~2 608单位/ml的范围内呈良好的线性关系。
-
对同一标准品溶液连续测定6次，旋光度值分别为0.109 6、0.109 8、0.109 2、0.109 5、0.109 5、0.109 8，RSD为1.1%（n=6），表明方法精密度良好。
-
取同一批样品6份（批号：20190620），按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定。计算得到硫酸新霉素平均含量为4 525.7单位/g，RSD为1.6%（n=6），表明方法重复性良好。
-
取同一批样品溶液（批号：20190620），分别于0、0.5、1、1.5、2、4、6 h测定，计算得到旋光度的RSD为1.1%（n=7），表明在6 h内方法稳定性良好。
-
取氯新酮乳膏（批号：20190620）约3.5 g，共9份，分别加入新霉素标准品20、25、30 mg，每个浓度制备3份，按照规定制备样品溶液，以标准曲线计算得到的新霉素加标量和实际加入新霉素的量的比值作为回收率，结果见表2。测得百分回收率平均值为98.8%，RSD为2.6%。表明该方法准确率可达到要求。
表 2 新霉素回收率试验结果（n=9）
序号 样品重（g） 已知量（单位） 加入量
（单位）测得量
（单位）回收率
（%）平均值
（%）RSD
（%）1 3.549 16 628.6 13 437.7 29 644.1 96.9 98.8 2.6 2 3.526 16 520.9 13 659.4 30 504.0 102.3 3 3.519 16 488.1 13 059.6 28 987.1 97.4 4 3.498 16 389.7 16 586.9 32 649.1 98.0 5 3.618 16 951.9 16 860.7 33 412.4 97.6 6 3.529 16 534.9 16 345.6 32 639.4 98.5 7 3.511 16 450.6 19 644.8 35 547.8 97.2 8 3.546 16 614.6 20 114.2 36 040.6 97.2 9 3.489 16 347.5 19 696.9 36 736.3 104.3 -
3批样品，按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定，结果见表3。
表 3 3批样品硫酸新霉素含量测定结果（n=3）
批号 含量（单位/g） 标示量（%） 20190620 4 685.4 93.7 20190624 4 617.1 95.3 20190628 4 604.3 92.1 -
参照药典及文献[3-4]，对处方中的酮康唑、哈西奈德和硫酸新霉素分别进行了TLC鉴别研究，对样品的前处理方法、展开剂的比例等因素分别进行了考察，确立了最终的TLC方法。结果显示，斑点显色清晰稳定，专属性强，准确性好，基质和溶剂均无干扰，可用于氯新酮乳膏鉴别项下质量控制。
-
参考药典和文献[5-9]，经紫外扫描，酮康唑和哈西奈德在235 nm处均有最大吸收，故选235 nm作为检测波长。酮康唑和哈西奈德均不溶于水，溶于甲醇、氯仿等，本实验采用甲醇提取，水浴加热，冰浴冷却的方法，可有效除去乳膏剂中的杂质并提取完全。对于流动相的选择，考察了甲醇-水和甲醇-磷酸盐缓冲液为流动相，发现选用甲醇-磷酸盐缓冲液（pH=7.40）75∶25为流动相时，峰形较好，无拖尾。流动相pH值对于两峰的分离度影响较大，如果处理不好会造成峰的重叠，经研究发现甲醇-磷酸盐缓冲液（pH=7.40）为流动相时，可以达到分离效果，且峰形较好。
-
据文献报道，硫酸新霉素的测定方法主要有微生物法、免疫分析法、色谱法、分光光度法、荧光分析法、电化学分析法、共振散射色谱法和比色法等[9-15]。药典采用微生物鉴定法，该法操作繁琐，时间较长，重现性很差。硫酸新霉素在紫外区无特征吸收，采用色谱法和分光光度法时，需先进行衍生化处理，但衍生化试剂存在吸收峰，干扰严重，很难分离测定，而HPLC-ELSD法对检测器要求较高。硫酸新霉素具有旋光性，采用旋光法对硫酸新霉素含量进行测定，简单灵便。采用旋光法测定乳膏剂时，将待测药品从基质中提取出来，且保证其他药物无干扰是关键。实验研究发现，在提取过程中加入少量的氯仿溶液强力振摇破乳，使乳膏基质充分分散，有利于药物提取完全；同时，利用三种药物在水中溶解度的区别，硫酸新霉素极易溶于水，酮康唑和哈西奈德几乎不溶于水，采用水提取，4 000 r/min离心15 min，进行样品溶液的制备，可将硫酸新霉素充分分离提取。用旋光法对缺硫酸新霉素的阴性样品溶液进行测定，旋光度为0，验证了样品中的其他成分对硫酸新霉素的测定无干扰，可达到检测目的。经方法学考察，本方法操作简单、结果准确、重复性好、专属性强，可作为氯新酮乳膏中硫酸新霉素的质量控制方法。分别对3批样品的含量进行了测定，3批样品均能达到要求，但含量相对偏低，考虑可能因素是提取过程造成部分损失，以及硫酸新霉素的稳定性等因素造成，需要我们进一步考察研究。
Study on the Quality Control Standard of Lvxintong Rugao
-
摘要:
目的 建立氯新酮乳膏的质量控制方法。 方法 采用TLC法对氯新酮乳膏中的新霉素、酮康唑和哈西奈德进行定性鉴别；采用HPLC法对氯新酮乳膏中的酮康唑和哈西奈德进行含量测定；色谱条件为：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱；以甲醇-磷酸盐缓冲液（pH=7.40）75∶25为流动相，检测波长235 nm，流速1.0 ml/min；采用旋光法对氯新酮乳膏中的硫酸新霉素进行含量测定。 结果 鉴别和含量测定方法均有较好的专属性。酮康唑在1.999~39.98 μg 的范围内呈良好的线性关系（r=0.999 9）,平均回收率为97.75%，RSD为0.77%；哈西奈德在0.400 8~8.016 μg范围内呈良好的线性关系，平均回收率为97.57%，RSD为0.84%。硫酸新霉素的含量测定中，线性范围为130.4~2 608单位/ml，r=0.999 6（n=6），平均回收率为98.8%，RSD为2.6%。 结论 该法可用于氯新酮乳膏的质量控制。 Abstract:Objective To establish a quality control method for Lvxintong Rugao. Methods Ketoconazole, Halcinonide and Neomycin sulfate were identified by TLC. The content of Ketoconazole and Halcinonide were determined by HPLC. The chromatographic column of Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) column was used. Methanol-phosphate buffer (pH=7.40, 75:25) was applied as the mobile phase. The detection wavelength was 235 nm. The flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was set at room temperature. Neomycin Sulfate was determined by polarimetric analysis. Results The identification and determination methods showed good specificity. Ketoconazole and Halcinonide displayed good linearity within the range of 1.999~39.98 μg (r=0.999 9) and 0.400 8~8.016 μg (r=0.999 9), respectively. The average recoveries were 97.75% (RSD 0.77%) and 97.57% (RSD 0.84%), respectively. For the determination of Neomycin Sulfate, r=0.999 6 (n=6) in the range of 130.4~2 608 U/ml (n=6). The precision and repeatability of RSD were 1.1% and 1.6%, respectively. The solutions were stable in 6 h and the average recovery was 98.8% (RSD 2.6%). Conclusion The method could be used as the quality control method for Lvxintong Rugao. -
Key words:
- Lvxintong Rugao /
- Ketoconazole /
- neomycin sulfate /
- HPLC /
- polarimetric analysis
-
超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
-
表 1 氯新酮乳膏中酮康唑和哈西奈德回收率试验结果（n=9）
待测物 样品量
（g）加入量
（μg/ml）测得量
（μg/ml）回收率
（%）平均值
（%）RSD
（%）酮康唑 2.501 2 399.6 395.6 99.00 97.75 0.77 2.498 2 399.6 392.2 98.15 2.483 3 399.6 391.5 97.97 2.510 6 503.1 486.1 96.62 2.508 7 503.1 489.6 97.32 2.496 4 503.1 488.8 97.16 2.501 2 591.3 578.4 97.82 2.486 9 591.3 583.2 98.63 2.993 7 591.3 574.3 97.12 哈西奈德 2.501 2 40.12 38.78 96.66 97.57 0.84 2.498 2 40.12 39.12 97.51 2.483 3 40.12 39.15 97.58 2.510 6 49.53 48.78 98.49 2.508 7 49.53 48.36 97.64 2.496 4 49.53 49.12 99.17 2.501 2 59.77 57.97 96.99 2.486 9 59.77 57.74 96.60 2.993 7 59.77 58.26 97.47 
下载: 导出CSV
表 2 新霉素回收率试验结果（n=9）
序号 样品重（g） 已知量（单位） 加入量
（单位）测得量
（单位）回收率
（%）平均值
（%）RSD
（%）1 3.549 16 628.6 13 437.7 29 644.1 96.9 98.8 2.6 2 3.526 16 520.9 13 659.4 30 504.0 102.3 3 3.519 16 488.1 13 059.6 28 987.1 97.4 4 3.498 16 389.7 16 586.9 32 649.1 98.0 5 3.618 16 951.9 16 860.7 33 412.4 97.6 6 3.529 16 534.9 16 345.6 32 639.4 98.5 7 3.511 16 450.6 19 644.8 35 547.8 97.2 8 3.546 16 614.6 20 114.2 36 040.6 97.2 9 3.489 16 347.5 19 696.9 36 736.3 104.3
下载: 导出CSV
表 3 3批样品硫酸新霉素含量测定结果（n=3）
批号 含量（单位/g） 标示量（%） 20190620 4 685.4 93.7 20190624 4 617.1 95.3 20190628 4 604.3 92.1
下载: 导出CSV
-
[1] 刘彬果, 郝兵, 张新萍. 氯新酮乳膏的抗菌活性和对小鼠白念珠菌性阴道炎的疗效[J]. 药学服务与研究, 2012, 12(1):49-51. [2] 刘彬果, 张楠, 曾建. 氯新酮乳膏治疗老年念珠菌性阴道炎的疗效观察[J]. 药学服务与研究, 2017, 17(3):182,186,197. [3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)[S]. 2020年版. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 908-909,1732-1733. [4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)[S]. 2020年版. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 1620-1621. [5] 谭汇雄. 高效液相色谱法测定酮康唑曲安奈德乳膏中酮康唑的含量[J]. 中国现代药物应用, 2019, 13(12):232-233. doi: 10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2019.12.133 [6] 吴博, 王铁柱, 拜年, 等. 用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中三组分的含量[J]. 药学实践杂志, 2021, 39(2):152-156. [7] 余良钟, 李亦文, 梁勇坤. 酮康他索乳膏中酮康唑和丙酸氯倍他索含量测定方法的改进[J]. 中国药师, 2018, 21(1):183-185. doi: 10.3969/j.issn.1008-049X.2018.01.051 [8] 马鸿雁. HPLC法同时测定复方哈西奈德溶液中水杨酸和哈西奈德的含量[J]. 临床医药文献电子杂志, 2018, 5(28):9-10,12. [9] 黄敏文, 张倩, 侯玉荣, 等. 硫酸新霉素软膏的质量评价[J]. 中国抗生素杂志, 2020, 45(3):259-266. doi: 10.3969/j.issn.1001-8689.2020.03.010 [10] 李璞. 柱前衍生-HPLC法测定复方酮康唑乳膏中硫酸新霉素的含量[J]. 实用预防医学, 2010, 17(4):767-769. doi: 10.3969/j.issn.1006-3110.2010.04.063 [11] 江勋, 彭婷婷. 微生物浊度法测定硫酸新霉素效价方法探讨[J]. 中南医学科学杂志, 2016, 44(1):96-98. doi: 10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.026 [12] PENG J D, TANG J X, HE R, et al. Validation of the high performance liquid chromatography method for the analysis of neomycin sulfate with resonance Rayleigh scattering detection[J]. Anal Methods,2013,5:5572-5578. doi: 10.1039/c3ay41119b [13] RAŠIĆMIŠIĆID, MILETIĆ G Ž, MITIĆ S S, et al. Kinetic-spectrophotometric determination of neomycin[J]. J Anal Chem,2015,70(2):234-239. doi: 10.1134/S106193481502015X [14] 黄敏文, 侯玉荣, 张倩, 等. 高效液相色谱-脉冲安培电化学检测器法替代微生物检定法测定硫酸新霉素效价的研究[J]. 中国药学杂志, 2020, 55(2):133-140. [15] 金鹏飞, 何笑荣, 吴学军, 等. 新霉素氯己定软膏的质量控制研究[J]. 中国医药导报, 2016, 13(36):153-156. -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 3021
- HTML全文浏览量: 1555
- PDF下载量: 6
- 被引次数: 0
