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在长期空间飞行特殊环境中，保持航天员的健康是航天任务成功的首要目标。因此，安全有效的药物治疗和药品保障对航天员的健康至关重要。然而用于长期太空飞行的药物的稳定性变化，不能用陆地环境稳定性评价结果来判断[1]，在陆地上药物稳定性主要受处方、温度、光线、湿度和水分及包装材料等因素影响。而航天环境受微重力、硬真空、湿度变化、温差和辐射影响[2]，这些都可能导致药物的不稳定，其主要影响因素为空间辐射。空间辐射主要包括空间天然产生的非电离辐射和由人工产生的电离辐射。当药物暴露于任何电离辐射时，辐射导致药物分子发生价层电子跃迁，与赋形剂发生相互作用，导致药物的结构发生一定变化，从而丧失药理活性。
酒石酸唑吡坦(zolpidem tartrate)主要通过作用于中枢神经系统的苯二氮䓬受体，增强γ -氨基丁酸(GABA)系统的抑制机制，具有较强的镇静、催眠作用[3-4]。在载人航天特殊作业环境中，酒石酸唑吡坦可以用于治疗睡眠障碍，缓解由其导致的焦虑等情绪，是“太空药箱”的常用药品之一[2]。
为了考察酒石酸唑吡坦片在太空环境中的稳定性，以60Co辐射为辐射源模拟太空的射线环境。辐射技术是20世纪兴起的一种灭菌及保鲜技术，是以Χ射线、γ射线等电离辐射产生的高能射线抑制病原生物的生长而达到杀虫、杀菌等目的[5-6]。根据原中华人民共和国卫生部发布的《60Co辐射中药灭菌剂量标准》[7]和《美国药典》42[8] (USP42)对辐射灭菌的规定，选定了8、25、80 kGy这3个剂量，建立UHPLC法测定不同剂量辐射下的酒石酸唑吡坦片的含量变化。实验通过60Co辐射因素对航天药物稳定性的影响，从而预测太空环境中药品的有效期，为今后航天药品的制剂工艺、包装储存等提供必要的研究资料。
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LC-2030 PLUS高效液相色谱仪（日本岛津公司）包括LC-20ADXR溶剂输送泵，SPD-20A紫外检测器，SIL-20AXR 自动进样器和CTO-20A柱温箱；60Co辐照装置（海军军医大学辐照中心）。
酒石酸唑吡坦片 (思诺思，杭州赛诺菲制药有限公司，批号ET098)，酒石酸唑吡坦对照品(纯度99.8%，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号201921)；甲醇(Merck公司)，磷酸(上海安谱实验科技股份有限公司)，三乙胺(上海安谱实验科技股份有限公司)，均为色谱纯;水为自制纯化水（上海和泰仪器有限公司）。
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将酒石酸唑吡坦片（含包装）置于辐照环境中，设定辐射剂量，按照接收剂量为0、8、25、80 kGy进行60Co辐射，每天受辐照一次，于1个月后取样。
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精密称定酒石酸唑吡坦对照品约10 mg，置10 ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得酒石酸唑吡坦对照品储备液；再精密量取1 ml，置 100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得浓度为10 μg/ml的对照品溶液。
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取0、8、25、80 kGy辐射后的酒石酸唑吡坦片各10片，精密称定并研细成药粉。精密称取细粉适量（约相当于酒石酸唑吡坦10 mg）置于10 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液1 ml，置100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
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色谱柱为Inertsil C18柱(3.0 mm×150 mm，3.0 μm)，流动相为乙腈-甲醇-0.05 mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至5.5) (18∶26∶56)，检测波长为254 nm，流速为0.7 ml/min，柱温30℃，进样量为10 μl，色谱图中酒石酸唑吡坦的保留时间为3.92 min，理论塔板数按酒石酸唑吡坦峰计算大于5 000。精密称取标准品配制浓度约为10 μg/ml的对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，计算峰面积RSD为0.06％，表明仪器精密度良好。每个辐射强度取1批供试品，按照“2.3”项下配制供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，对照品溶液及供试品溶液的色谱结果见图1。
图 1 酒石酸唑吡坦超高效液相色谱图 （254 nm）
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精密量取对酒石酸唑吡坦对照品储备液适量置100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为5、10、20、40、80 μg/ml的工作曲线溶液。按“2.4”项下色谱条件分别进样10 μl进行测定，记录色谱图。以酒石酸唑吡坦对照品浓度 (X，μg/ml)为横坐标，相应峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=1.03
$ \times $ 105X+1.5×104， r=0.9996，结果表明酒石酸唑吡坦在5～80 μg/ml浓度范围内，线性关系良好。 -
精密称取同一批未受辐射的酒石酸唑吡坦片样品粉末（约相当于酒石酸唑吡坦10 mg）6份，照“2.3”项下制成供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件分别进样10 μl测定，记录峰面积，计算含量，其平均含量104.2%， RSD为0.87%，表明该方法重复性良好。
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取辐射强度为8 kGy 的供试品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按含量测定方法测定，在0、1、2、5、8、12 h分别进样10 μ1，记录峰面积，峰面积RSD为0.06%，表明溶液在12 h内稳定。
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精密称取同一批未辐射酒石酸唑吡坦片样品粉末（约相当于酒石酸唑吡坦10 mg）3份，分别置于10 ml量瓶中，再精密称取酒石酸唑吡坦对照品约8、10、12 mg各3份，分别置于上述3个10 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液1 ml，置 100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，每个浓度制备3份。按“2. 4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算平均加样回收率，结果见表1。
表 1 酒石酸唑吡坦片加样回收率试验结果(n=9)
称取量
(m/mg)原有量
(m/mg)加入量
(m/mg)测得量
（m/mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
（%）140.27 10.99 12.81 23.82 100.2 98.2 1.72 140.24 10.99 12.80 23.81 100.2 140.24 10.99 12.81 23.81 100.1 140.28 10.99 10.84 21.42 96.2 140.30 10.99 10.82 21.42 96.4 140.27 10.99 10.83 21.41 96.2 140.32 10.99 8.78 19.62 98.3 140.21 10.98 8.79 19.61 98.1 140.22 10.98 8.78 19.60 98.1 -
每个辐射强度取1批供试品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行3份，在“2.4”项的色谱条件下进样分析，记录色谱峰面积，按照外标法计算酒石酸唑吡坦含量，其 0、8、25和80 kGy辐射量下酒石酸唑吡坦平均含量分别为105.1%、106.4%、102.7%和105.4%（表2）。
表 2 酒石酸唑吡坦片含量测定结果
辐射剂量（kGy） 含量（%） 平均含量（%） 0 103.1 105.1 103.2 109.2 8 107.1 106.4 109.1 103.2 25 107.2 102.7 105.0 96.1 80 100.1 105.4 107.2 109.0 -
研究表明测定酒石酸唑吡坦原料药和片剂含量的方法主要有分光光度法[9]、高效液相色谱法[10]和毛细管区带电泳法[11]等。本实验采用超高效液相色谱法，相比于传统的高效液相色谱法，其色谱柱粒径更小，柱效更高， 出峰较快，大大提高了灵敏度和检测效率。
在建立超高效液相色谱法方法过程中，曾选用乙腈-0.05 mol/L磷酸溶液和甲醇-0.05 mol/L磷酸溶液，但是色谱峰不能完全分离，干扰性大。最终选用乙腈-甲醇-0.05mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至 5.5) (18∶26∶56)，试验结果表明，流动相中加入适量三乙胺调节其pH值， 在pH4.0～6.5的范围内，分离度随pH值增大而增大[12]， pH值<4.5时，酒石酸唑吡坦峰形较差，pH值>6.0时，酒石酸唑吡坦峰拖尾严重。经优化，选择pH5.5，其唑吡坦峰的对称性好，理论塔板数高，柱效更高。
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实验选定了8、25、80 kGy不同辐射剂量下对酒石酸唑吡坦片稳定性影响进行考察，结果显示随着辐射剂量逐步增大，在其他条件相同的情况下，酒石酸唑吡坦片的主药含量并没有明显变化，酒石酸唑吡坦片能保持相对稳定。药物含量指在制剂中药物量是否符合要求，在药物含量不变的情况下，药物的有效性还与剂型的相关特性有关，如溶出度等。有研究表明，药物受到一定剂量的辐射后，药物的溶出度会发生改变[13]。后续将从不同辐射剂量的酒石酸唑吡坦片的溶出度、水分等做进一步研究。
Determination of zolpidem tartrate tablets after radiation by UHPLC
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摘要:
目的 建立UHPLC法测定辐射后的酒石酸唑吡坦片含量，考察不同辐射剂量对酒石酸唑吡坦片含量的影响。 方法 采用超高效液相色谱法，对γ射线辐射的酒石酸唑吡坦片进行含量测定。采用C18柱以乙腈-甲醇-0. 05 mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至5.5）（18∶26∶56）为流动相，流速为0.7 ml/min，检测波长为254 nm。 结果 酒石酸唑吡坦浓度在5～80 μg/ml范围内线性良好，r=0.9996；平均加样回收率为98.2%，RSD为1.72%，重复性为0.87%。0、8、25和80 kGy辐射量下酒石酸唑吡坦含量分别为105.1%、106.4%、102.7%和105.4%。 结论 超高效液相色谱法分析周期短、结果准确，适用于辐射后酒石酸唑吡坦片的含量测定，辐射后酒石酸唑吡坦片含量基本保持不变。 Abstract:Objective To establish a UHPLC method for the determination of zolpidem tartrate tablets after radiation, and to investigate the effect of different radiation doses on the content of zolpidem tartrate tablets. Methods Ultra high performance liquid chromatography was used. The content of zolpidem tartrate tablets irradiated by γ-ray was determined. Using C18 column, acetonitrile methanol-0.05 mol/L phosphoric acid solution (the pH value as 5.5 with triethylamine) (18∶26∶56) was used as the mobile phase. The flow rate was 0.7 ml/min, and the detection wavelength was 254 nm. Results The method validation showed good linearity in the concentration range of 5-80 μg/ml (r=0.999 6); The average recovery was 98.2%, RSD was 1.72%, and the repeatability was 0.87%. The contents of zolpidem tartrate were 105.1%, 106.4%, 102.7% and 105.4% under 0, 8, 25 and 80 kGy radiation. Conclusion UHPLC has accurate results with short analysis cycle in this study. It is suitable for the determination of zolpidem tartrate tablets after radiation. The content of zolpidem tartrate tablets remained basically unchanged after radiation. -
高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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图 1 酒石酸唑吡坦超高效液相色谱图 （254 nm）
A. 对照品；B. 8 kGy辐射量供试品；C. 25 kGy辐射量供试品; D. 80 kGy辐射量供试品；1.酒石酸唑吡坦。
表 1 酒石酸唑吡坦片加样回收率试验结果(n=9)
称取量
(m/mg)原有量
(m/mg)加入量
(m/mg)测得量
（m/mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
（%）140.27 10.99 12.81 23.82 100.2 98.2 1.72 140.24 10.99 12.80 23.81 100.2 140.24 10.99 12.81 23.81 100.1 140.28 10.99 10.84 21.42 96.2 140.30 10.99 10.82 21.42 96.4 140.27 10.99 10.83 21.41 96.2 140.32 10.99 8.78 19.62 98.3 140.21 10.98 8.79 19.61 98.1 140.22 10.98 8.78 19.60 98.1 
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表 2 酒石酸唑吡坦片含量测定结果
辐射剂量（kGy） 含量（%） 平均含量（%） 0 103.1 105.1 103.2 109.2 8 107.1 106.4 109.1 103.2 25 107.2 102.7 105.0 96.1 80 100.1 105.4 107.2 109.0
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