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患者，男，58岁，体重58 kg。因背部不适数月，自行贴膏药治疗效果欠佳，外院胸部CT平扫示右肺下叶恶性肿瘤（24mm×18mm）伴左侧第10肋骨转移可能，为进一步诊治收住我院血液肿瘤科。患者无咳嗽咳痰、无咯血疼痛、无头晕头痛、无恶心呕吐；既往无高血压、糖尿病等慢性疾病史，无肝炎、结核等传染病史，无手术外伤史，无药物及食物过敏史；有吸烟、无饮酒史，无特殊家族史。
入院后经胸部CT增强、颅脑MRI增强、支气管镜涂片细胞学检查，以及CT引导下左侧第10肋转移灶穿刺活检，临床诊断为右肺恶性肿瘤中分化鳞癌cT1cNxM1 IV期，肋骨、脑转移，PD-L1 TPS>1%。完善全身检查，经知情同意后于2021年3月22日行第1周期紫杉醇+卡铂化疗联合卡瑞丽珠单抗(SHR-1210,Cam)免疫治疗，具体为：Cam （苏州盛迪亚生物医药有限公司，200 mg/瓶，批号：202011007F）200 mg，ivgtt，d0；紫杉醇注射液240 mg，ivgtt，d1；卡铂注射液405 mg，ivgtt，d1，q3w。2021年4月12日，患者行第2周期化疗入院时，自述2021年3月25日开始大腿及背部皮肤多发皮疹形成，伴瘙痒，医师考虑为紫杉醇注射液引起的过敏反应，即更改化疗方案，将紫杉醇注射液替换为注射用紫杉醇脂质体，其余药物和剂量不变，并给予盐酸西替利嗪片10 mg，qn，口服抗过敏治疗。经抗过敏治疗20 d后，皮疹和瘙痒治愈，在之后的治疗中也未再出现。同时查体发现，患者头皮、面部、颈部和胸腹部有散在的血管痣，大小不等，直径大约1～3 mm，凸起于皮肤表面，呈鲜红色。医师考虑为Cam导致的反应性皮肤毛细血管增生症(RCCEP），但因病情需要，继续按疗程行化疗+ Cam免疫治疗。2021年5月30日患者第4次入院治疗，头皮和面部的血管痣无明显增多，但有增大；胸腹部血管痣较之前明显增大、增多，并发展为“珍珠样”节，颜色随出现时间长短由鲜红色到暗红色，均为散在型，触之易破出血；颈后有一直径6 mm左右带蒂的结节，为“瘤样型”，呈咖啡色，皱缩状态。医师医嘱沙利度胺片50 mg，po，bid，抑制血管生成，并嘱避免搔抓、摩擦或强力揉搓，适当保护，穿宽松柔软的棉质衣物；破裂出血时可用云南白药胶囊粉末涂抹，并用纱布按压3～5 min至出血停止。患者服用沙利度胺10 d后因无法耐受嗜睡自行停药。在服用沙利度胺后随访的4个月中，血管痣的增长速度明显减慢，新发的减少，并逐渐自行破溃后结痂脱落，但是免疫治疗情况下胸腹部仍有新的血管痣出现，背部和大腿部也逐渐新发较小的血管痣，其他部位无明显增多。
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本例患者血管痣的出现与Cam的使用有时间相关性。首次使用Cam后3 d即出现血管痣，且随着免疫治疗次数增加，血管痣的相关病情进展符合Cam药品说明书和文献报道[1-2]中对RCCEP的描述，但出现的时间比已报道文献中的早。并用药品舒肝宁注射液、鸦胆子油乳注射液、盐酸帕洛诺司琼注射液、卡铂注射液和紫杉醇注射液的说明书和相关文献中均未有导致血管痣的报道，基本可排除并用药品的影响。患者第1周期使用后即出现血管痣，根据临床表现和RCCEP的分级处理原则，该不良反应分级为Ⅰ级，遂继续Cam原剂量使用，并再次出现血管痣。根据药品不良反应评价标准，该不良反应的关联性评价结果为“很可能”。
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Cam是程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)抑制剂，系一种人源性IgG4单克隆抗体。与其他的PD-1抑制剂一样，在提高抗恶性肿瘤疗效的同时，可能引起机体免疫功能的过度激活，从而导致全身多个系统的免疫相关不良事件(irAEs)发生，其中RCCEP是Cam最常见的irAEs，发生率高达77.6%。王锋等[1]报道Cam引起的RCCEP按形态大致分为“红痣型” “珍珠型” “桑椹型” “斑片型”和“瘤样型”，以“红痣型”和“珍珠型”最为多见。最早发生在面部、头皮、颈部和上胸壁，逐渐出现在腹壁、背部、四肢等部位皮肤。大多数在首次用药后2～4周内出现，颜色比较鲜亮，随着用药频次增加，结节逐渐增大、增多，范围逐渐扩大。至3～4个月时就不再增大，部分结节开始逐渐皱缩、干燥，颜色变黑，形成带蒂的结节，可自行脱落且不留明显瘢痕。
RCCEP的发生机制[3]可能为PD-1抑制剂阻断免疫抑制通路，重新激活免疫应答，破坏了促血管生长因子与抑制血管生长因子之间的动态平衡，刺激CD4+Th2细胞分泌白细胞介素-4(IL-4)和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，促进皮肤内常驻M0型巨噬细胞向M2型分化扩增，且释放血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，刺激皮肤毛细血管内皮细胞发生良性增生，属于免疫应激性反应。有报道称[4]，Cam联用抗血管生成药物时，RCCEP发生率明显降低，可能是因为抗血管生成药物可以阻断VEGF-VEGFR信号通路，抑制血管细胞，导致毛细血管的密度降低。
据林美珍等[5]报道沙利度胺可通过抑制IΚB激酶的活性来阻断NF-ΚB的活化，抑制VEGF和β-成纤维细胞生长因子(β-FGF)的分泌，降低细胞迁移和黏附，从而发挥抗血管生成作用。而该例患者在第4周期Cam治疗后口服沙利度胺片，血管痣的增长速度明显减慢，新发也有所减少，大多在刚发展为“珍珠型”时即逐渐破溃脱落，减少了大量出血的风险。
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RCCEP是Cam引起的最常见的irAEs，具有独特的形态学表现，并呈动态变化，大多为1～2级，无需停药，可用纱布保护，出血时可局部压迫止血，或用云南白药粉末涂抹止血；对于较大的结节可进行激光或手术切除。根据本例患者RCCEP的临床表现，按照《CSCO免疫检查点抑制剂相关的毒性管理指南2021》[6]分级为G1级，因此告知患者加强自我保护，并继续按疗程进行化疗+免疫治疗。
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RCCEP是Cam最常见的皮肤不良反应，其发生机制可能与VEGF的过度释放有关，因此，推测抗血管生成的靶向药物可减轻Cam所致RCCEP的不良反应。临床上也观察到沙利度胺对RCCEP的治疗有效，但应注意，沙利度胺有致畸的严重不良反应，对于有生育能力的患者，医师应告知患者在用药期间采取避孕措施。同时，医师和药师应注意监测其治疗疗效和副作用，以免发生不利于疾病治疗的不良反应。药师也要对Cam引起的RCCEP的临床表现、病理特征、治疗措施及转归情况加以关注，指导患者对RCCEP的自我管理，以及对沙利度胺的服用方法和可能发生的不良反应进行用药教育，以保证患者的用药安全。
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关键词:
- 注射用卡瑞利珠单抗 /
- 反应性皮肤毛细血管增生症 /
- 血管内皮生长因子 /
- 沙利度胺
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目前全球抑郁症的发病率为4.2%，中国已达6.9%，据世界卫生组织报道，抑郁症已成为导致人类死亡和致残的第二大类疾病[1]。百合知母汤始见于张仲景的《金匮要略•百合狐惑阴阳毒病脉证并治第三篇》，由知母和百合两味中药组成，两药配伍有养阴清热、除烦润燥之效，以润养心肺为大法，主治百合病[2]。百合病与现代医学的失眠多梦和抑郁症有很大关联[3]，而百合知母汤也已成为中医药治疗抑郁症、失眠、焦虑等精神神经性疾病的经典方药[4]。知百安神口服液来源于经典古方百合知母汤，按照方中百合与知母2∶1配比制备而成，在海军军医大学长征医院临床使用多年，用于抑郁症、失眠等症的治疗，疗效显著。本研究采用正交试验设计法，以主要成分芒果苷的含量为检测指标，对知百安神口服液制备工艺进行优化，并进行稳定性研究，为其质量控制、工业生产提供科学依据。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent，美国）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）；CPA225D十万分之一天平（Sartorius，德国）；WL-901涡旋振荡混合器（其林贝尔仪器制造有限公司，海门）；SK7200H型超声仪（科导超声仪器有限公司，上海）；SHH-250SD药物稳定性试验箱（重庆永生实验仪器厂，温度：15～65 ℃，±2 ℃，湿度：15%～95%，±5%）。
1.2 试药
知百安神口服液（中药材购自铜陵禾田中药饮片股份有限公司，口服液由海军军医大学长征医院制剂室制备）；芒果苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111607-201503，含量98.4%）；甲醇、乙腈、二氯甲烷为色谱纯试剂（Merck，德国）；甲酸为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水。
2. 方法与结果
2.1 芒果苷的含量测定
2.1.1 色谱条件
色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长为246 nm；流速1 ml/min；柱温30 ℃；进样量为5 μl。理论塔板数按芒果苷计算应不低于20 000。
表 1 梯度洗脱程序时间（t/min） A. 乙腈（%） B. 0.2%甲酸水溶液（%） 0 5 95 5 10 90 10 10 90 20 13 87 25 13 87 30 5 95 2.1.2 对照品溶液的制备
取芒果苷对照品适量，精密称定，用70%乙醇溶液溶解并稀释制成每1 ml中含0.15 mg芒果苷的溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备
精密量取知百安神口服液10 ml，用10 ml二氯甲烷萃取，震摇，静置，待完全分离。精密量取水相4 ml，加水定容至25 ml，经0.45 μm薄膜过滤，作为供试品溶液。
2.1.4 标准曲线的制备
取芒果苷对照品适量，精密称定，用70%乙醇溶液溶解并稀释，制成每1 ml中含1.04 mg芒果苷的溶液，作为对照品母液，采用逐级稀释的方法，将芒果苷配制成208、156、104、78、52、26、10.4 μg/ml的对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积对浓度进行线性回归分析，得回归方程为Y=16.56X−5.412（r=0.999 9），结果表明芒果苷在10.4～208 μg/ml范围内线性关系良好。
2.1.5 精密度试验
取“2.1.2”项下对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算得到芒果苷峰面积的RSD为0.24%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验
精密量取知百安神口服液（批号：120208）适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，计算得到芒果苷含量的RSD为0.72%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.7 重复性试验
精密量取知百安神口服液（批号：120208）适量，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。计算得到芒果苷含量的RSD为1.18%，结果表明该方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验
精密量取知百安神口服液（批号：120208）6份，每份5 ml，分别加入104 μg/ml的芒果苷对照品溶液各5 ml，混匀，按照“2.1.3”项下方法制备，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。计算得芒果苷的平均加样回收率为99.47%，RSD为0.86%，表明该方法准确度良好。
2.2 提取方法的选择
水提醇沉法是广泛应用于中药的提取方法，其操作方法简单，生产成本低廉，更适合于规模化生产。本实验依据大生产实际情况对制备工艺采用正交设计，拟对中药水醇提取法影响较大的因素即提取加水量、提取时间、提取次数和醇沉浓度为影响因素进行考察，但参照文献[5]发现，提取次数不适合加入到正交设计中，经过预实验结果并结合工艺化大生产能源等消耗考虑，确定提取次数为2次，可达到提取要求。因此，参照L9(34)设计正交试验，加水量为药材总量的6、10、12倍，提取时间为1、2、3 h，醇沉浓度为40%、60%、80%，以芒果苷的含量为检测指标，优选最佳提取工艺，见表2。
表 2 正交试验因素水平表水平 A因素加水量
（倍）B因素提取时间
（t/h）C因素醇沉浓度
（%）1 6 1 40 2 10 2 60 3 12 3 80 2.3 知百安神口服液正交试验结果
按处方称取各味药材共9份，按表2条件进行提取，按“2.1”项下方法进行含量测定，结果折合知百安神口服液芒果苷的含量（μg/ml），结果见表3。
表 3 正交试验结果编号 因素 芒果苷含量（μg/ml） A B C 1 1 1 1 371.58 2 1 2 2 453.26 3 1 3 3 282.74 4 2 1 2 504.40 5 2 2 3 300.59 6 2 3 1 370.01 7 3 1 3 440.91 8 3 2 1 293.82 9 3 3 2 381.15 K1 369.19 438.96 343.86 K2 391.67 349.22 446.27 K3 371.96 344.63 341.41 R 22.48 94.33 104.86 从正交试验结果可以看出，A、B、C三因素影响大小排序为C>B>A，即醇沉浓度为最大影响因素，经过极差分析并结合能源成本和工业操作的简便有效性，确定最佳工艺为A2B1C2，即10倍量水煎煮1 h，以60%醇浓度为醇沉浓度。
结合课题组前期研究和以上试验结果，知百安神口服液制备工艺的一般流程为：称取百合667 g、知母333 g，加10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.24（50 ℃）的清膏，加入乙醇使含醇量达60%，4 ℃静置72 h，滤过，加单糖浆200 ml，加水至1000 ml，搅匀、煮沸、放冷、滤过、灌封、灭菌即得。
依据上述优化的工艺，于本院制剂室扩大生产，依据“2.1”项下芒果苷的测定方法对3批（批号：170406、180104、180713）中试产品进行测定，所测芒果苷的含量分别为780.9、657.7、621.0 μg/ml。
2.4 知百安神口服液稳定性研究
根据制剂稳定性试验指导原则（《中国药典》2020年版四部制剂通则9000）及口服溶液剂（《中国药典》2020年版四部制剂通则0123）有关规定，取3批知百安神口服液（批号：170406-1、170406-2、170406-3），在温度（40±2）℃、相对湿度（75±5）%的条件下放置6个月进行加速试验，于第0、1、2、3、6个月末分别取样，按稳定性重点考察项目检测。另取3批知百安神口服液（批号：170406、180104、180713），在温度（25±2）℃、相对湿度（60±10）%的条件下放置12个月进行长期试验，分别于第0、3、6、9、12个月取样，按稳定性重点考察项目进行检测。稳定性加速试验和长期试验结果提示，知百安神口服液在12个月内稳定。结果见表4、表5。
表 4 知百安神口服液稳定性加速试验结果批号 检查项目 考察时间 性状 pH值 相对密度 芒果苷含量
（μg/ml）170406-1 0个月 棕褐色液体 4.30 1.08 780.9 1个月 棕褐色液体 4.34 1.09 660.9 2个月 棕褐色液体 4.45 1.08 654.1 3个月 棕褐色液体 4.24 1.07 531.2 6个月 棕褐色液体 4.46 1.05 456.8 170406-2 0个月 棕褐色液体 4.31 1.09 750.0 1个月 棕褐色液体 4.64 1.08 630.5 2个月 棕褐色液体 4.35 1.08 588.8 3个月 棕褐色液体 4.54 1.08 541.9 6个月 棕褐色液体 4.59 1.07 406.1 170406-3 0个月 棕褐色液体 4.30 1.08 789.1 1个月 棕褐色液体 4.19 1.09 671.3 2个月 棕褐色液体 4.13 1.07 611.9 3个月 棕褐色液体 4.39 1.06 500.6 6个月 棕褐色液体 4.56 1.05 438.9 表 5 知百安神口服液稳定性长期试验结果批号 检查项目 考察时间 性状 pH值 相对密度 芒果苷含量
（μg/ml）170406 0个月 棕褐色液体 4.30 1.08 780.9 3个月 棕褐色液体 4.91 1.08 667.9 6个月 棕褐色液体 4.71 1.07 604.8 9个月 棕褐色液体 4.24 1.06 540.6 12个月 棕褐色液体 4.15 1.04 434.0 180104 0个月 棕褐色液体 4.60 1.09 657.7 3个月 棕褐色液体 4.64 1.08 603.4 6个月 棕褐色液体 4.57 1.08 432.0 9个月 棕褐色液体 4.77 1.06 354.0 12个月 棕褐色液体 4.69 1.05 352.0 180713 0个月 棕褐色液体 4.43 1.09 621.0 3个月 棕褐色液体 5.09 1.08 703.2 6个月 棕褐色液体 4.70 1.08 524.0 9个月 棕褐色液体 4.69 1.07 483.1 12个月 棕褐色液体 4.78 1.07 439.9 3. 讨论
本课题组在前期研究工作中对知百安神口服液的质量标准进行了系统研究[6]，笔者选取芒果苷作为工艺研究的指标及所用芒果苷的含量测定方法，即以前期研究工作为基础进行。
前期工作中发现，随着放置时间的延长，该口服液的pH值变化较大，发现原因是口服液瓶盖中的胶塞材质为天然橡胶，天然橡胶塞长时间与药液接触会对药液pH值产生影响，更换为硅胶塞后，稳定性试验结果显示口服液的pH值可保持稳定，本研究中采用的均为更换后的现行包装。
文献报道[7]芒果苷可能受溶液pH值和温度的影响而不稳定，知百安神口服液的稳定性试验结果也证实了这点。从结果可以看出，芒果苷在水溶液的状态下，3个月内含量可稳定在10%以内，超过3个月会加速降解。《中国药典》2020年版对知母含量测定要求是检测芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量，但知母皂苷BⅡ需要应用蒸发光散射检测器检测，由于蒸发光散射检测器的检测误差较大，并不适用于制剂工艺考察。考虑到芒果苷是知百安神口服液的主要成分[6]，且制剂工艺考察周期并不长（不超过1个月），芒果苷又利于快速便捷检测，因此，选择芒果苷作为指标成分，优化知百安神口服液的提取工艺，而利用稳定性考察结果制订制剂的有效期则需考察多种检验因素，还需进一步研究。
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