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万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的一线用药，其治疗窗窄，血药浓度与疗效、不良反应及耐药菌株的产生密切相关[1-3]。目前，临床上借助治疗药物监测（TDM）来监测万古霉素稳态谷浓度，以评估临床疗效及不良反应。然而，TDM具有滞后性，不能用于制订给药方案及预测目标浓度；且在万古霉素给药后，如未达治疗窗，则需反复多次监测血药浓度，方能找到合适的给药方案。因此，一些医院引入万古霉素个体化给药系统，用以辅助临床决策万古霉素给药方案，目的是规避TDM的不足。
万古霉素个体化给药系统旨在利用群体药代动力学模型（PPK）模拟个体化给药，国内外已开发的系统有Vancomycin-calculator、TDMS2000、ClinCalc、GlobalRPh.com及JPKD[4-8]等。然而，因建模数据集的人口学特征各有不同，PPK模型对不同人群的模拟性能存在差异[9-10]。由于上述系统主要是以西方国家人群数据计算出的PPK参数模型，在应用于中国人群时，常出现明显误差[11]。
2017年焦正教授团队研发了个体化给药系统Smart Dose，该系统是基于中国人群的万古霉素PPK模型，使用贝叶斯算法，可设计及调整万古霉素的给药方案；适应人群包括使用万古霉素的普通成人以及特殊人群（新生儿、老年人、神经外科患者）等[12]。Smart Dose功能包括制定万古霉素初始方案、万古霉素调整方案及自定义用药方案。本研究将对Smart Dose用于中国人群万古霉素稳态谷浓度的效能预测进行评价，探讨其在万古霉素个体化给药过程中的作用意义。
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纳入2018年12月至2019年4月海军军医大学（第二军医大学）长海医院接受万古霉素治疗的患者，进行常规TDM监测。收集资料包括：①患者基本信息及用药指征，如姓名、年龄、性别、身高、体重、入出院时间、血常规、血清肌酐值、病原微生物检查、药敏试验结果等；②万古霉素TDM监测方案，如万古霉素血药浓度（谷）、给药方案、给药时间、滴注时长、采血时间等。
纳入标准：①2018年12月至2019年4月在长海医院住院期间使用万古霉素，且至少测定了1次万古霉素谷浓度的患者；②年龄≥18岁；③万古霉素用药量满4个维持剂量；④准确记录给药时间及采血时间；⑤用药前后均进行了肾功能检查。
排除标准：①年龄<18岁；②基本资料及肾功能检查结果缺失的患者；③万古霉素用药量不足4个维持剂量的患者；④给药时间及血药浓度监测采血时间未记录或不准确的患者；⑤行腹膜透析或者血液透析治疗的患者。
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仪器：ARCHITECTi1000SR全自动免疫分析仪、Abbott离心机（美国雅培公司）。
试药：万古霉素（规格：0.5 g，Eli Lilly Japan KK, Seishin Laboratorie）；万古霉素（规格：0.5 g，浙江医药有限公司新昌制药厂）；万古霉素校准品（0、5、10、25、50和100 μg/ml）；LiquichekTM TDM质控品（批号：27740，美国伯乐），包含Level 1[7.34（6.29–8.40）μg/ml]、Level 2 [21.8（18.2–25.3）μg/ml]和Level 3 [38.8（32.3–45.2）μg/ml]。最低定量限为2.5 μg/ml，允许误差为±24%。
血样采集：患者在万古霉素给药4～5个半衰期，血药浓度达到稳态后，于下一次给药前30 min采集外周静脉血，采用化学发光微粒子免疫分析法（CMIA）测得的万古霉素稳态谷浓度；如调整剂量，则按剂量调整给药3～4个半衰期后，下一次给药前30 min采血复查。
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Smart Dose万古霉素个体化给药系统是应用R语言中的rjags程序包调用JAGS软件, 实现最大后验贝叶斯法（MAPB）估算；该系统根据患者基本资料（性别、年龄、体重及身高），肾功能检查（肌酐值）及给药方案（给药剂量、给药时间、滴注时间、采血时间）预测万古霉素谷浓度。
将预测浓度分为初始预测浓度和调整预测浓度，初始预测浓度是根据患者年龄﹑性别﹑体重和肌酐、给药方案等参数估算出的初始稳态谷浓度；调整预测浓度是将大于等于一个万古霉素谷浓度实测值代入系统后，测算出新的药动学参数，进而预测得出的后续稳态谷浓度，即调整预测浓度。依据上述方法得出并比较Smart Dose对初始预测浓度和调整预测浓度的预测效能。
Smart Dose系统设置了不同人群模块，根据模块将患者来源分为神经外科患者和非神经外科患者两组，根据现有数据对预测结果进行对比分析，比较不同来源的患者的初始浓度预测效能。
将年龄中位数分为高年龄组（≥59岁）和低年龄组（<59岁）；给药前肌酐清除率以中位数分为高清除率组（≥90.97 ml/min）和低清除率组（<90.97 ml/min）；谷浓度以中位数分为高浓度组（≥8.16 mg/L）和低浓度组（<8.16 mg/L）；根据单日给药剂量不同，分为高剂量组（>1500 mg/d）和低剂量组（≤1500 mg/d）；根据中华人民共和国成人体质量判定诊断标准[13]，依据BMI指数将患者分为肥胖组（≥28 kg/m2）和非肥胖组（<28 kg/m2）；对各组分别进行初始浓度预测值与实测值的比较，探究以上因素对初始预测效能的影响。
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运用SPSS 21.0软件进行数据统计，对浓度预测值与实测值采用配对t检验及Bland-Altman图进行分析评价；实测值与预测值的差异，采用百分误差（PE）、平均百分比误差（MPE）以及平均绝对百分比误差（MAPE）表示。
$$ \begin{array}{l} PE = \displaystyle\frac{{{C_{pred}} - {C_{cobs}}}}{{{C_{cobs}}}} \times 100\% \\ MPE = \displaystyle\frac{1}{N}\sum\limits_{i = 1}^N {} PE\\ MAPE = \displaystyle\frac{1}{N}\sum\limits_{{\rm{i}} = 1}^N {|PE} | \end{array}$$ -
共纳入71例患者，其中男性患者48例，占总人数的67.6%；送检患者主要为颅内感染20例、肺部感染18例、感染性心内膜炎13例，骨关节置换术后感染7例，腹腔感染6例，其他感染7例；初始给药方案1000 mg，q12 h 50例；500 mg，q8 h 14例；500 mg，q12 h 6例；其他给药方案1例；万古霉素均采取静脉滴注方式给药。基本资料见表1。
表 1 万古霉素抗感染患者人口学统计资料
基本信息参数 例数/占比[n（%）] 中位数（最小值；最大值） 均数（$ \bar x$±s） 年龄（a/y) 71（100） 59（18；97） 57.35±19.87 <59 35（49.3） 45（18；58） 40.66±12.63 ≥59 36（50.7） 74（59；97） 73.58±9.24 体重（m/kg) 71（100） 67（38；96） 67.53±13.76 给药前肌酐清除率（ml/min) 71（100） 90.97（27.78；232.07） 100.25±46.51 <90.97 35（49.3） 66.57（27.78；90.18） 64.39±18.11 ≥90.97 36（50.7） 120.52（90.97；232.07） 135.11±38.36 谷浓度（c/mg/L） 71（100） 8.16（1.12；52.54） 10.91±8.71 <8.16 35（49.3） 5.61（1.12；7.86） 5.17±2.00 ≥8.16 36（50.7） 13.80（8.16；52.54） 16.84±9.10 万古霉素日剂量（m/mg) 71（100） 2000（1000；2000） 1767.61±394.89 ≤1500 20（28.2） 1000（1000；1500） 1175.00±244.68 >1500 51（71.8） 2000（2000；2000） 2000.00±0.00 BMI（kg/m2） 71（100） 23.88（14.84；32.87） 24.07±4.09 <28 57（80.3） 22.89（14.84；27.77） 22.58±3.01 ≥28 14（19.7） 29.41（28.96；32.87） 30.11±1.30 注：使用MDRD公式计算CLCR肌酐清除率 -
初始预测浓度组纳入71例初始浓度实测值，调整预测浓度组纳入22例调整浓度实测值。结果显示，初始浓度实测值与预测值的百分误差平均值为35.5%，允许的最大误差范围F30=34.3%；调整浓度实测值与预测值的百分误差平均值仅为11.2%，允许的最大误差范围F30=63.6%。初始浓度预测值与实测值误差（PE=35.47±74.49，MPE=35.5%，MAPE=57.9%）和调整浓度预测值与实测值误差（PE=−11.16±31.71，MPE=−11.2%，MAPE=25.4%）之间有差异有统计学意义（P=0.01），调整浓度预测值误差更低，即调整浓度预测值更接近于实测值。Smart Dose预测值与实测值的Bland-Altman图如图1所示；两组预测误差的PE、MPE和MAPE见表2。
图 1 万古霉素实测值与Smart Dose预测误差散点图
表 2 Smart Dose预测万古霉素稳态谷浓度的效能
预测浓度分组 PE（%） MPE（%） MAPE（%） 初始预测浓度 35.47±74.49 0.355 0.579 调整预测浓度 −11.16±31.71 −0.112 0.254 -
神经外科组纳入21例万古霉素初始浓度实测值；非神经外科组纳入50例初始浓度实测值。
Smart Dose预测结果显示，与非神经外科组患者（PE=39.93±81.75，MPE=39.9%，MAPE=64.8%）相比，神经外科组患者（PE=24.84±53.65，MPE=24.8%，MAPE=41.5%）的PE，MPE及MAPE均低于非神经外科患者组，差异有统计学意义（P=0.03），即神经外科组患者的初始浓度预测值更接近于真实值。预测结果的Bland-Altman图如图2所示；两组预测误差的PE、MPE及MAPE见表3。
图 2 基于万古霉素个体化给药系统Smart Dose的预测误差与实测值散点图
表 3 Smart Dose针对非神经外科患者组和神经外科患者组初始稳态谷浓度的预测效能
预测浓度分组 PE（%） MPE（%） MAPE（%） 神经外科患者组 24.84±53.65 0.248 0.415 非神经外科患者组 39.93±81.75 0.399 0.648 -
根据年龄中位数分为高年龄组（≥59岁）和低年龄组（<59岁），高年龄组和低年龄组分别纳入36例和35例万古霉素血药浓度初始实测值。将给药前肌酐清除率以中位数分为高清除率组（≥90.97 ml/min）和低清除率组（<90.97 ml/min），分别纳入36例和35例万古霉素血药浓度初始实测值；将谷浓度以中位数分为高浓度组（≥8.16 mg/L）和低浓度组（<8.16 mg/L），分别纳入36例和35例万古霉素血药浓度初始实测值。根据单日给药剂量不同，分为高剂量组（>1500 mg/d）和低剂量组（≤1500 mg/d），分别纳入51例和20例万古霉素血药浓度初始实测值。根据BMI指数将患者分为肥胖组（≥28 kg/m2）和非肥胖组（<28 kg/m2），肥胖组和非肥胖组分别纳入14例和57例万古霉素血药浓度初始实测值。分别比较各组间的PE、MPE、MAPE（见表4）。结果表明，Smart Dose对于高浓度组的初始浓度预测值更准确（P=0.001），对于不同的年龄（P=0.589）、肌酐清除率（P=0.537）、日剂量（P=0.386）、BMI（P=0.760）初始浓度的预测效能相仿。
表 4 Smart Dose对不同情况患者初始稳态谷浓度的预测效能
分组 PE（%） MPE（%） MAPE（%） 高年龄组 58.52±75.42 0.585 0.651 低年龄组 11.76±66.54 0.118 0.491 高清除率组 36.96±69.89 0.370 0.622 低清除率组 33.94±79.95 0.339 0.535 高浓度组 1.66±44.01 0.017 0.363 低浓度组 70.24±83.52 0.702 0.801 高剂量组 33.12±63.19 0.331 0.541 低剂量组 41.45±99.41 0.415 0.676 肥胖组 42.97±49.87 0.430 0.536 非肥胖组 33.63±79.63 0.336 0.590 -
本研究在评价新型万古霉素个体化给药系统Smart Dose临床效用的方向上，针对其预测效能（PE、MPE及MAPE）进行数据分析。根据系统本身模块设置，将所收集数据分为初始预测浓度组与调整预测浓度组，分析结果显示Smart Dose调整预测浓度在PE、MPE及MAPE方面均优于初始浓度预测值，即调整浓度预测值与实测值的接近程度优于初始浓度预测值与实测值[12]，提示Smart Dose系统更适合用于调整给药方案；建议患者先进行万古霉素血药浓度的TDM监测，获得一个实测浓度值后，再利用Smart Dose进行浓度调整，其结果会更加接近真实值。这可能因为调整预测浓度带入了前一次实测浓度、准确的滴注时间及采血时间，经过贝叶斯法得到新的药动学参数（表观分布容积、表观清除率）后，再根据给药方案进行预测。国内外多篇文献报道表明，药代动力学结合贝叶斯法能够更为准确地预测万古霉素血药浓度，且准确的给药时间、采血时间、滴注时间能够辅助预测[14-16]。
有研究表明，神经外科术后患者万古霉素的清除率高于非神经外科患者，而万古霉素在患者发生脑膜炎时可以透过血脑屏障进入脑脊液[17-18]，可见，神经外科患者在使用万古霉素时自身药动学参数有别于非神经外科患者，Smart Dose系统在研制时亦将二者区分[12]。故本研究将所收集数据分为神经外科患者组和非神经外科患者组，结果发现，Smart Dose对神经外科患者组预测效能（PE、MPE及MAPE）优于非神经外科患者组。这可能与系统本身将神经外科患者药动学参数模板单独建立，区别于普通患者有关。
本研究浓度数据离散程度较大，这可能与样本中存在高龄、自身的肾功能不全的患者有关，部分高龄或ICU患者实验室检查肌酐值普遍偏低[19-20]，此时不能单纯以肌酐值来衡量患者的肾功能；危重患者炎症反应、应激反应剧烈，可导致有效血容量不足，临床中可能会采用液体复苏保证有效的循环血量，因此，可能会影响万古霉素的药物分布和消除[20]。此外，老年重症患者肌酐清除率往往成为影响谷浓度的主要因素，降低了年龄及体重的影响，结果出现了一定的偏差[21]。同时，本研究发现高浓度组患者预测准确性较低浓度组高，这可能因为部分谷浓度在限定量以下的患者初始浓度实测值的准确性本身存在偏差，而低浓度患者在应用Smart Dose等个体化给药系统进行稳态谷浓度预测时，极有可能出现绝对误差过大的情形。再者，在TDM监测中，Smart Dose采用的荧光偏振免疫法与本实验的化学微粒发光法测量结果可能存在差异，需要矫正，否则直接使用结果可能出现误差增大的现象[22-23]。因此，临床药师需结合患者本身情况和疾病特点，优化个体药动学参数，以Smart Dose做为辅助手段来为临床合理用药提供依据。
本研究收集样本例数有限，仅Smart Dose关于万古霉素初始给药方案及调整给药方案两个模块进行效能评估，未对自定义给药方案（可用于模拟停药）进行评估。后续将扩大临床研究，完善对万古霉素个体化给药系统Smart Dose的效能评估，为合理应用Smart Dose用于临床万古霉素初始给药方案制定及调整提供科学依据。
Evaluation of Smart Dose's predictive effectiveness on vancomycin blood concentration
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摘要:
目的 评价个体化给药决策支持系统Smart Dose应用于中国人群治疗药物监测的临床效用。 方法 使用Smart Dose系统预测患者万古霉素谷浓度，分析谷浓度预测值与实测值之间的差异，以评价该系统对于万古霉素血药浓度的预测效能。 结果 Smart Dose调整浓度预测值与实测值之间的差异，平均百分比误差，平均绝对百分比误差小于初始浓度预测值与实测值之间的差异。神经外科组患者初始浓度预测值与实测值的差异比非神经外科组患者小，预测效能优于非神经外科组。高谷浓度组和低年龄组（<59岁）的初始浓度预测值更接近于实测值。不同的BMI对于初始浓度的预测效能相仿。 结论 Smart Dose系统更适合于万古霉素调整浓度的预测。用于初始浓度预测时，神经外科组、高谷浓度及低年龄组的预测值更准确。不同的BMI对于初始浓度预测效能相仿。 Abstract:Objective To evaluate clinical utility of the personalized drug delivery decision support system, Smart Dose, applied to the monitoring of therapeutic drugs in Chinese population. Methods Use Smart Dose system to predict the trough concentration of vancomycin in patients, analyze the difference between the predicted value and the measured value of the trough concentration, and to evaluate the prediction performance of the system for vancomycin blood concentration. Results Smart Dose adjusts the difference between the predicted value of concentration and the measured value, the average percentage error, and the average absolute percentage error is less than the difference between the predicted value of initial concentration and the measured value. The difference between the initial concentration prediction value and the measured value of the neurosurgery group was smaller than that of the non-neurosurgery group, and the prediction efficiency was better than that of the non-neurosurgery group. The predicted initial concentration of the high trough concentration group and the low-age group (<59 years old) are closer to the measured value. The predictive performance of different BMI for the initial concentration is similar. Conclusion Smart Dose system is more suitable for predicting the adjusted concentration of vancomycin; When used for initial concentration prediction, the prediction values of neurosurgery group, high trough concentration, and low age group are more accurate. Different BMI has similar performance in predicting initial concentration. -
Key words:
- vancomycin /
- therapeutic drug monitoring /
- software
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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图 1 万古霉素实测值与Smart Dose预测误差散点图
A.73例初始预测浓度组的Bland-Altman图；B.22例调整预测浓度组的Bland-Altman图注：粗实线为百分误差（PE)的平均值；细实线为允许的最大误差（F30)；虚线为95%LoA上下限。
图 2 基于万古霉素个体化给药系统Smart Dose的预测误差与实测值散点图
A.神经外科患者组初始浓度预测值的Bland-Altmand图；B.非神经外科患者组初始浓度预测值Bland-Altman图注：粗实线为百分误差（PE)的平均值；细实线为允许的最大误差（F30)；虚线为95%LoA上下限。
表 1 万古霉素抗感染患者人口学统计资料
基本信息参数 例数/占比[n（%）] 中位数（最小值；最大值） 均数（ $ \bar x$ ±s）年龄（a/y) 71（100） 59（18；97） 57.35±19.87 <59 35（49.3） 45（18；58） 40.66±12.63 ≥59 36（50.7） 74（59；97） 73.58±9.24 体重（m/kg) 71（100） 67（38；96） 67.53±13.76 给药前肌酐清除率（ml/min) 71（100） 90.97（27.78；232.07） 100.25±46.51 <90.97 35（49.3） 66.57（27.78；90.18） 64.39±18.11 ≥90.97 36（50.7） 120.52（90.97；232.07） 135.11±38.36 谷浓度（c/mg/L） 71（100） 8.16（1.12；52.54） 10.91±8.71 <8.16 35（49.3） 5.61（1.12；7.86） 5.17±2.00 ≥8.16 36（50.7） 13.80（8.16；52.54） 16.84±9.10 万古霉素日剂量（m/mg) 71（100） 2000（1000；2000） 1767.61±394.89 ≤1500 20（28.2） 1000（1000；1500） 1175.00±244.68 >1500 51（71.8） 2000（2000；2000） 2000.00±0.00 BMI（kg/m2） 71（100） 23.88（14.84；32.87） 24.07±4.09 <28 57（80.3） 22.89（14.84；27.77） 22.58±3.01 ≥28 14（19.7） 29.41（28.96；32.87） 30.11±1.30 注：使用MDRD公式计算CLCR肌酐清除率 
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表 2 Smart Dose预测万古霉素稳态谷浓度的效能
预测浓度分组 PE（%） MPE（%） MAPE（%） 初始预测浓度 35.47±74.49 0.355 0.579 调整预测浓度 −11.16±31.71 −0.112 0.254
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表 3 Smart Dose针对非神经外科患者组和神经外科患者组初始稳态谷浓度的预测效能
预测浓度分组 PE（%） MPE（%） MAPE（%） 神经外科患者组 24.84±53.65 0.248 0.415 非神经外科患者组 39.93±81.75 0.399 0.648
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表 4 Smart Dose对不同情况患者初始稳态谷浓度的预测效能
分组 PE（%） MPE（%） MAPE（%） 高年龄组 58.52±75.42 0.585 0.651 低年龄组 11.76±66.54 0.118 0.491 高清除率组 36.96±69.89 0.370 0.622 低清除率组 33.94±79.95 0.339 0.535 高浓度组 1.66±44.01 0.017 0.363 低浓度组 70.24±83.52 0.702 0.801 高剂量组 33.12±63.19 0.331 0.541 低剂量组 41.45±99.41 0.415 0.676 肥胖组 42.97±49.87 0.430 0.536 非肥胖组 33.63±79.63 0.336 0.590
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