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伏立康唑（voriconazole）是第二代三唑类广谱抗真菌药，主要用于治疗由侵袭性曲霉菌、念珠菌等引起的侵袭性感染[1-2]。伏立康唑血药浓度受多种因素影响，其中，肝脏和肾脏疾病[3]是导致伏立康唑较大个体化差异的重要因素，伏立康唑的临床疗效及不良反应与药物浓度有明显相关性[4]。目前用于伏立康唑的血药浓度监测的方法主要有：酶联免疫法、高效液相色谱法[5]，超高效液相色谱-串联质谱法[6]，其中，酶联免疫法存在假阳性，高效液相色谱法检测时间较长。本研究采用的超高效液相色谱-串联质谱检测方法灵敏度高，简便快速，适用于伏立康唑血药浓度监测。由于伏立康唑大部分在肝脏代谢，肝脏疾病患者的血药浓度具有可变性和不可预知性，尤其是肝功能不全的患者，治疗药物监测对其尤为重要。然而，国内针对肝功能不全患者的伏立康唑药物浓度监测鲜有报道，笔者应用自建方法对肝功能不全患者进行伏立康唑治疗药物血药浓度监测，根据患者临床症状和生化指标及时调整用药方案，避免了药物不良反应的发生，具有一定的临床意义。
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LC-30AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB Qtrap 5500型质谱仪，配有电喷雾电离源 (美国AB SCIEX公司)。AL 204型分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Simplicity纯水仪(美国Millipore公司)；H1850R 低温高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；XH-B 型旋涡混合器（湖北姜堰市康健医疗器具有限公司）。伏立康唑对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100862-201402，纯度99.8%)；氟康唑对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100314-201605，纯度99.8%)；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
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色谱柱：InertSustain C18 HP（3.0 mm×100 mm，3 μm）；流动相：水 -乙腈（15∶85）；流速: 0.3 ml/min，柱温：35 ℃；进样量：1 μl。
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电喷雾离子源（ESI），正离子多反应监测（MRM）模式监测。喷雾电压（IS）5 550 V；离子化温度（TEM）550 ℃；雾化气（GS1）55 psi；辅助气（GS2）60 psi；气帘气（CUR）)20 psi；碰撞气（CAD）10 psi；去簇电压（DP）80 V。伏立康唑和内标氟康唑的定量分析离子分别为m/z：350.9/282.2和m/z：307.0/238.0；碰撞能量分别为25 V和22 V。
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精密称取伏立康唑适量，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得1 mg/ml伏立康唑储备液，置2～8 ℃冰箱保存，备用。
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精密称取氟康唑适量，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得1 mg/ml的氟康唑储备液，置2～8 ℃冰箱保存，备用。临用前用甲醇稀释成500 ng/ml的内标溶液。
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取样本血浆50 μl，加入500 ng/ml内标液50 μl，加入甲醇250 μl，在微型混合器上涡流振荡1 min混匀，13000 r/min低温4 ℃离心5 min，取上清液1 μl进样分析。
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分别取人空白血浆、人空白血浆加伏立康唑对照品和内标溶液、临床使用伏立康唑的患者血浆样品加内标溶液，按照“2.4”项下方法处理，按“2.1”和“2.2”项下条件进行检测。伏立康唑和内标的保留时间分别为4.61、3.64 min，峰形良好，血浆中其他成分对伏立康唑和内标的测定无干扰，方法的专属性好。结果见图1。
图 1 伏立康唑和内标提取离子色谱图
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取不同来源的健康人血浆，精密加入不同浓度的对照品溶液，配制成浓度为0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg/ml的标准曲线工作液。以伏立康唑浓度为横坐标，伏立康唑峰与内标峰面积的比值为纵坐标，采用最小二乘法进行加权回归计算，回归方程为：Y=0.732 36 X−0.013 55（r=0.999 5）。结果表明，人空白血浆中伏立康唑在0.1～20 μg/ml内线性关系良好。本方法伏立康唑定量下限（S/N>10）为0.1 μg/ml。
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以人空白血浆为基质，制备浓度分别为0.3、8、15 μg/ml的低、中、高3 个水平的质控样品各6 份，连续检测3 d，按“2.4”项下方法处理后分析测定，计算其日内、日间精密度，结果见表1。
表 1 方法学考察结果(n=6)
浓度（μg/ml） 日内 日间 提取
回收率
（%）基质
效应
（%）$\bar{x}\pm s$ 精密度(%) $\bar{x}\pm s$ 精密度(%) 0.3 0.27±0.01 3.47 0.28±0.01 3.43 93.57 88.85 8 7.75±0.40 5.13 7.66±0.08 1.09 91.05 90.37 15 14.32±0.29 2.04 14.69±0.41 2.76 92.46 93.61 -
取6个不同来源的健康人空白血浆作为基质，制备浓度分别为0.3、8、15 μg/ml的低、中、高3 个水平的质控样品，按“2.4”项下方法处理并测定，得到伏立康唑峰面积A1；以6个不同来源的人空白血浆甲醇沉淀提取液配制浓度分别为0.3、8、15 μg/ml的低、中、高3 个水平的样品各6 份，得到伏立康唑峰面积A2；以流动相代替空白血浆，同样方法配制备0.3、8、15 μg/ml的低、中、高3 个水平的样品各6 份，得到伏立康唑峰面积A3；以A1/A2的值计算提取回收率，A2/A3的值计算基质效应，结果见表1。
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以人空白血浆为基质，制备浓度分别为0.3、8、15 μg/ml的质控样品，考察样品室温放置稳定性（12 h）、冻融稳定性（反复冻融3次）、冷冻稳定性（−20 ℃放置30 d），结果见表2。
表 2 稳定性考察结果(n=6)
浓度(μg/ml) 室温放置12 h 反复冻融3次 −20 ℃放置30 d $\bar{x}\pm s$ RSD(%) $\bar{x}\pm s$ RSD(%) $\bar{x}\pm s$ RSD(%) 0.3 0.30±0.01 2.83 0.28±0.01 5.32 0.31±0.02 5.31 8 7.98±0.21 2.62 8.15±0.27 3.31 7.87±0.30 3.78 15 14.56±0.63 4.35 14.51±0.56 3.89 15.08±1.02 6.79 -
对本院10名真菌感染使用伏立康唑的肝功能不全患者进行治疗药物监测，稳态谷浓度最大值为18.7 μg/ml，最小值为0.97 μg/ml。在 Pascual 等[7] 的研究中，设定伏立康唑的治疗药物浓度范围为 1.0～5.5 μg/ml。其中一名患者肝硬化、胆石症伴梗阻性黄疸，行经内镜逆行性胰胆管造影术（ERCP）后胆红素、C-反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）进行性升高，存在胆管感染，且患者反复腹泻，合并肠道真菌感染，予加用伏立康唑抗真菌治疗。用药前肌酐值81 μmol/L，碱性磷酸酶259 U/L，谷氨酰转肽酶69 U/L，谷草转氨酶116.3 U/L，伏立康唑胶囊口服给药，负荷剂量400 mg，q12 h，维持剂量为200 mg，q12 h，达到稳态谷浓度后监测浓度值为18.7 μg/ml，复查生化，肌酐值151 μmol/L，碱性磷酸酶324 U/L，谷氨酰转肽酶154 U/L，谷草转氨酶154 U/L，胆红素仍持续性升高，伴肾功能不全，为防止发生严重肝损害和不良反应，予停药处理。还有一名患者肝炎后肝硬化、肝功能衰竭伴黄疸，粪便培养出黑霉菌，予伏立康唑抗真菌治疗，用药前肌酐值49 μmol/L，碱性磷酸酶198 U/L，谷氨酸转氨酶99 U/L，谷草转氨酶211 U/L。伏立康唑片剂口服给药，负荷剂量400 mg，q12 h，维持剂量为200 mg，q12 h，达到稳态谷浓度后监测浓度值为10.7 μg/ml，已超出伏立康唑治疗窗浓度高限，患者诉视物变黄，初步考虑为药物引起的不良反应，临床医生调整剂量为 100 mg，q12 h，达到稳态浓度后复测伏立康唑的血药浓度为5.1 μg/ml，视物变黄较前缓解，无视物模糊，黄疸下降，凝血酶原活动度（PTA）改善，感染症状有所好转。
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在色谱法测定伏立康唑血药浓度的文献中，前人多采用乙酸乙酯-环己烷或者三氯甲烷萃取剂提取[8-9]，前处理的过程操作比较复杂，时间长。本研究使用甲醇蛋白沉淀方法，能够较好地去除血浆样本中内源性物质的干扰，降低基质效应对检测的影响，前处理方法简单快速，缩短了检测时间。所选内标氟康唑稳定性好，保留时间适宜且峰形好，定量准确，同时，液相方法使用乙腈-水等度洗脱，将分析时间缩短至6 min以内，分析效率显著提高。综上所述，本研究建立的伏立康唑血药浓度的测定方法具有较好的专属性，操作简便，回收率好、灵敏度高，可满足伏立康唑日常血药浓度的测定和药动学研究的需要，为合理使用伏立康唑提供依据。
伏立康唑谷浓度低于治疗窗最低浓度时临床治疗效果不好，当谷浓度高于治疗窗最大浓度时，中枢系统[10]和肝功能[11]的不良反应发生率会明显升高。其中，视觉障碍最为常见，与用药剂量较大或血药浓度较高有关，一般用药剂量减少或停药后可完全恢复。患者个体化差异和药物间相互作用等因素会导致血药浓度偏高或偏低，影响伏立康唑的治疗效果。此外，患者肝功能不全会影响伏立康唑的代谢，导致代谢时间减慢，半衰期延长，药物不良反应的发生率增加，从而使得肝损害进一步加重。
本例中两名患者肝功能损害较严重，伏立康唑用药需更加谨慎。伏立康唑在脑脊液和脑组织液中可达到较高浓度，有研究表明伏立康唑药物浓度与视觉副作用的发生率呈正相关，临床药师通过监测伏立康唑血药浓度，及时调整用药，结合患者实际病情制订个体化给药方案，提高治疗效果，避免了药物不良反应的发生，为临床肝功能不全患者合理用药提供依据。
The assay of voriconazole in plasma from patients with hepatic insufficiency by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法以测定人血浆中伏立康唑的浓度，用于临床治疗药物监测。 方法 血浆中加入甲醇进行蛋白沉淀，取上清液用于UPLC-MS/MS分析。分析柱为InertSustain C18 HP (3.0 mm×100 mm，3 μm)，流动相为水-乙腈（15:85）等度洗脱，流速0.3 ml/min，柱温35 ℃。电喷雾离子化电离源ESI正离子检测，MRM扫描，检测离子分别为m/z：350.9/282.2（伏立康唑）和m/z：307.0/238.0（内标氟康唑）。 结果 伏立康唑的血药浓度在0.1～20 μg/ml 范围内线性关系良好（r=0.999 5），方法定量下限为0.1 μg/ml。提取回收率在90%以上，高、中、低3种浓度的日内和日间RSD均<10%。应用所建方法对10例肝功能不全的用药患者进行治疗药物监测，浓度范围在0.97～18.70 μg/ml之间。 结论 该方法准确、快速且灵敏度高，适用于临床伏立康唑的治疗药物监测，并为肝功能不全患者的合理化用药提供依据。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 伏立康唑 /
- 肝功能不全 /
- 治疗药物监测
Abstract:Objective To establish an UPLC-MS/MS method of voriconazole assay in human plasma for clinical therapeutic drug monitoring. Methods The plasma samples were treated with methanol to precipitate protein and the supernatants were assayed by UPLC-MS/MS. The chromatographic column was InertSustain C18 HP (3.0 mm×100 mm, 3 μm) with the mobile phase of water and acetonitrile solution (15:85) at 35 ℃ and 0.3 ml/min flow rate. ESI was used for Mass Spectrum in positive ion MRM mode with target ions m/z: 350.9/282.2(voriconazole) and m/z: 307.0/238.0(fluconazole). Results The linear range of voriconazole was 0.1–20 μg/ml (r=0.999 5）. The lower limit of quantitation was 0.1 μg/ml. The extraction recovery was higher than 90%. RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%. The plasma concentrations measured by this method were in the range of 0.97 to 18.7 μg/ml from 10 patients with hepatic insufficiency who were treated with voriconazole. Conclusion The established method was fast, accurate and sensitive. It can be applied for the therapeutic drug monitoring of voriconazole, and provided a good base for rationalized medication treatment in patients with hepatic insufficiency. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- voriconazole /
- hepatic insufficiency /
- therapeutic drug monitoring
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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表 1 方法学考察结果(n=6)
浓度（μg/ml） 日内 日间 提取
回收率
（%）基质
效应
（%）$\bar{x}\pm s$ 精密度(%) $\bar{x}\pm s$ 精密度(%) 0.3 0.27±0.01 3.47 0.28±0.01 3.43 93.57 88.85 8 7.75±0.40 5.13 7.66±0.08 1.09 91.05 90.37 15 14.32±0.29 2.04 14.69±0.41 2.76 92.46 93.61 
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表 2 稳定性考察结果(n=6)
浓度(μg/ml) 室温放置12 h 反复冻融3次 −20 ℃放置30 d $\bar{x}\pm s$ RSD(%) $\bar{x}\pm s$ RSD(%) $\bar{x}\pm s$ RSD(%) 0.3 0.30±0.01 2.83 0.28±0.01 5.32 0.31±0.02 5.31 8 7.98±0.21 2.62 8.15±0.27 3.31 7.87±0.30 3.78 15 14.56±0.63 4.35 14.51±0.56 3.89 15.08±1.02 6.79
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