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伏立康唑（voriconazole）是第二代三唑类广谱抗真菌药，主要用于治疗由侵袭性曲霉菌、念珠菌等引起的侵袭性感染[1-2]。伏立康唑血药浓度受多种因素影响，其中，肝脏和肾脏疾病[3]是导致伏立康唑较大个体化差异的重要因素，伏立康唑的临床疗效及不良反应与药物浓度有明显相关性[4]。目前用于伏立康唑的血药浓度监测的方法主要有：酶联免疫法、高效液相色谱法[5]，超高效液相色谱-串联质谱法[6]，其中，酶联免疫法存在假阳性，高效液相色谱法检测时间较长。本研究采用的超高效液相色谱-串联质谱检测方法灵敏度高，简便快速，适用于伏立康唑血药浓度监测。由于伏立康唑大部分在肝脏代谢，肝脏疾病患者的血药浓度具有可变性和不可预知性，尤其是肝功能不全的患者，治疗药物监测对其尤为重要。然而，国内针对肝功能不全患者的伏立康唑药物浓度监测鲜有报道，笔者应用自建方法对肝功能不全患者进行伏立康唑治疗药物血药浓度监测，根据患者临床症状和生化指标及时调整用药方案，避免了药物不良反应的发生，具有一定的临床意义。
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LC-30AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB Qtrap 5500型质谱仪，配有电喷雾电离源 (美国AB SCIEX公司)。AL 204型分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Simplicity纯水仪(美国Millipore公司)；H1850R 低温高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；XH-B 型旋涡混合器（湖北姜堰市康健医疗器具有限公司）。伏立康唑对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100862-201402，纯度99.8%)；氟康唑对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100314-201605，纯度99.8%)；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
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色谱柱：InertSustain C18 HP（3.0 mm×100 mm，3 μm）；流动相：水 -乙腈（15∶85）；流速: 0.3 ml/min，柱温：35 ℃；进样量：1 μl。
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电喷雾离子源（ESI），正离子多反应监测（MRM）模式监测。喷雾电压（IS）5 550 V；离子化温度（TEM）550 ℃；雾化气（GS1）55 psi；辅助气（GS2）60 psi；气帘气（CUR）)20 psi；碰撞气（CAD）10 psi；去簇电压（DP）80 V。伏立康唑和内标氟康唑的定量分析离子分别为m/z：350.9/282.2和m/z：307.0/238.0；碰撞能量分别为25 V和22 V。
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精密称取伏立康唑适量，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得1 mg/ml伏立康唑储备液，置2～8 ℃冰箱保存，备用。
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精密称取氟康唑适量，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得1 mg/ml的氟康唑储备液，置2～8 ℃冰箱保存，备用。临用前用甲醇稀释成500 ng/ml的内标溶液。
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取样本血浆50 μl，加入500 ng/ml内标液50 μl，加入甲醇250 μl，在微型混合器上涡流振荡1 min混匀，13000 r/min低温4 ℃离心5 min，取上清液1 μl进样分析。
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分别取人空白血浆、人空白血浆加伏立康唑对照品和内标溶液、临床使用伏立康唑的患者血浆样品加内标溶液，按照“2.4”项下方法处理，按“2.1”和“2.2”项下条件进行检测。伏立康唑和内标的保留时间分别为4.61、3.64 min，峰形良好，血浆中其他成分对伏立康唑和内标的测定无干扰，方法的专属性好。结果见图1。
图 1 伏立康唑和内标提取离子色谱图
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取不同来源的健康人血浆，精密加入不同浓度的对照品溶液，配制成浓度为0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg/ml的标准曲线工作液。以伏立康唑浓度为横坐标，伏立康唑峰与内标峰面积的比值为纵坐标，采用最小二乘法进行加权回归计算，回归方程为：Y=0.732 36 X−0.013 55（r=0.999 5）。结果表明，人空白血浆中伏立康唑在0.1～20 μg/ml内线性关系良好。本方法伏立康唑定量下限（S/N>10）为0.1 μg/ml。
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以人空白血浆为基质，制备浓度分别为0.3、8、15 μg/ml的低、中、高3 个水平的质控样品各6 份，连续检测3 d，按“2.4”项下方法处理后分析测定，计算其日内、日间精密度，结果见表1。
表 1 方法学考察结果(n=6)
浓度（μg/ml） 日内 日间 提取
回收率
（%）基质
效应
（%）$\bar{x}\pm s$ 精密度(%) $\bar{x}\pm s$ 精密度(%) 0.3 0.27±0.01 3.47 0.28±0.01 3.43 93.57 88.85 8 7.75±0.40 5.13 7.66±0.08 1.09 91.05 90.37 15 14.32±0.29 2.04 14.69±0.41 2.76 92.46 93.61 -
取6个不同来源的健康人空白血浆作为基质，制备浓度分别为0.3、8、15 μg/ml的低、中、高3 个水平的质控样品，按“2.4”项下方法处理并测定，得到伏立康唑峰面积A1；以6个不同来源的人空白血浆甲醇沉淀提取液配制浓度分别为0.3、8、15 μg/ml的低、中、高3 个水平的样品各6 份，得到伏立康唑峰面积A2；以流动相代替空白血浆，同样方法配制备0.3、8、15 μg/ml的低、中、高3 个水平的样品各6 份，得到伏立康唑峰面积A3；以A1/A2的值计算提取回收率，A2/A3的值计算基质效应，结果见表1。
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以人空白血浆为基质，制备浓度分别为0.3、8、15 μg/ml的质控样品，考察样品室温放置稳定性（12 h）、冻融稳定性（反复冻融3次）、冷冻稳定性（−20 ℃放置30 d），结果见表2。
表 2 稳定性考察结果(n=6)
浓度(μg/ml) 室温放置12 h 反复冻融3次 −20 ℃放置30 d $\bar{x}\pm s$ RSD(%) $\bar{x}\pm s$ RSD(%) $\bar{x}\pm s$ RSD(%) 0.3 0.30±0.01 2.83 0.28±0.01 5.32 0.31±0.02 5.31 8 7.98±0.21 2.62 8.15±0.27 3.31 7.87±0.30 3.78 15 14.56±0.63 4.35 14.51±0.56 3.89 15.08±1.02 6.79 -
对本院10名真菌感染使用伏立康唑的肝功能不全患者进行治疗药物监测，稳态谷浓度最大值为18.7 μg/ml，最小值为0.97 μg/ml。在 Pascual 等[7] 的研究中，设定伏立康唑的治疗药物浓度范围为 1.0～5.5 μg/ml。其中一名患者肝硬化、胆石症伴梗阻性黄疸，行经内镜逆行性胰胆管造影术（ERCP）后胆红素、C-反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）进行性升高，存在胆管感染，且患者反复腹泻，合并肠道真菌感染，予加用伏立康唑抗真菌治疗。用药前肌酐值81 μmol/L，碱性磷酸酶259 U/L，谷氨酰转肽酶69 U/L，谷草转氨酶116.3 U/L，伏立康唑胶囊口服给药，负荷剂量400 mg，q12 h，维持剂量为200 mg，q12 h，达到稳态谷浓度后监测浓度值为18.7 μg/ml，复查生化，肌酐值151 μmol/L，碱性磷酸酶324 U/L，谷氨酰转肽酶154 U/L，谷草转氨酶154 U/L，胆红素仍持续性升高，伴肾功能不全，为防止发生严重肝损害和不良反应，予停药处理。还有一名患者肝炎后肝硬化、肝功能衰竭伴黄疸，粪便培养出黑霉菌，予伏立康唑抗真菌治疗，用药前肌酐值49 μmol/L，碱性磷酸酶198 U/L，谷氨酸转氨酶99 U/L，谷草转氨酶211 U/L。伏立康唑片剂口服给药，负荷剂量400 mg，q12 h，维持剂量为200 mg，q12 h，达到稳态谷浓度后监测浓度值为10.7 μg/ml，已超出伏立康唑治疗窗浓度高限，患者诉视物变黄，初步考虑为药物引起的不良反应，临床医生调整剂量为 100 mg，q12 h，达到稳态浓度后复测伏立康唑的血药浓度为5.1 μg/ml，视物变黄较前缓解，无视物模糊，黄疸下降，凝血酶原活动度（PTA）改善，感染症状有所好转。
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在色谱法测定伏立康唑血药浓度的文献中，前人多采用乙酸乙酯-环己烷或者三氯甲烷萃取剂提取[8-9]，前处理的过程操作比较复杂，时间长。本研究使用甲醇蛋白沉淀方法，能够较好地去除血浆样本中内源性物质的干扰，降低基质效应对检测的影响，前处理方法简单快速，缩短了检测时间。所选内标氟康唑稳定性好，保留时间适宜且峰形好，定量准确，同时，液相方法使用乙腈-水等度洗脱，将分析时间缩短至6 min以内，分析效率显著提高。综上所述，本研究建立的伏立康唑血药浓度的测定方法具有较好的专属性，操作简便，回收率好、灵敏度高，可满足伏立康唑日常血药浓度的测定和药动学研究的需要，为合理使用伏立康唑提供依据。
伏立康唑谷浓度低于治疗窗最低浓度时临床治疗效果不好，当谷浓度高于治疗窗最大浓度时，中枢系统[10]和肝功能[11]的不良反应发生率会明显升高。其中，视觉障碍最为常见，与用药剂量较大或血药浓度较高有关，一般用药剂量减少或停药后可完全恢复。患者个体化差异和药物间相互作用等因素会导致血药浓度偏高或偏低，影响伏立康唑的治疗效果。此外，患者肝功能不全会影响伏立康唑的代谢，导致代谢时间减慢，半衰期延长，药物不良反应的发生率增加，从而使得肝损害进一步加重。
本例中两名患者肝功能损害较严重，伏立康唑用药需更加谨慎。伏立康唑在脑脊液和脑组织液中可达到较高浓度，有研究表明伏立康唑药物浓度与视觉副作用的发生率呈正相关，临床药师通过监测伏立康唑血药浓度，及时调整用药，结合患者实际病情制订个体化给药方案，提高治疗效果，避免了药物不良反应的发生，为临床肝功能不全患者合理用药提供依据。
The assay of voriconazole in plasma from patients with hepatic insufficiency by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法以测定人血浆中伏立康唑的浓度，用于临床治疗药物监测。 方法 血浆中加入甲醇进行蛋白沉淀，取上清液用于UPLC-MS/MS分析。分析柱为InertSustain C18 HP (3.0 mm×100 mm，3 μm)，流动相为水-乙腈（15:85）等度洗脱，流速0.3 ml/min，柱温35 ℃。电喷雾离子化电离源ESI正离子检测，MRM扫描，检测离子分别为m/z：350.9/282.2（伏立康唑）和m/z：307.0/238.0（内标氟康唑）。 结果 伏立康唑的血药浓度在0.1～20 μg/ml 范围内线性关系良好（r=0.999 5），方法定量下限为0.1 μg/ml。提取回收率在90%以上，高、中、低3种浓度的日内和日间RSD均<10%。应用所建方法对10例肝功能不全的用药患者进行治疗药物监测，浓度范围在0.97～18.70 μg/ml之间。 结论 该方法准确、快速且灵敏度高，适用于临床伏立康唑的治疗药物监测，并为肝功能不全患者的合理化用药提供依据。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 伏立康唑 /
- 肝功能不全 /
- 治疗药物监测
Abstract:Objective To establish an UPLC-MS/MS method of voriconazole assay in human plasma for clinical therapeutic drug monitoring. Methods The plasma samples were treated with methanol to precipitate protein and the supernatants were assayed by UPLC-MS/MS. The chromatographic column was InertSustain C18 HP (3.0 mm×100 mm, 3 μm) with the mobile phase of water and acetonitrile solution (15:85) at 35 ℃ and 0.3 ml/min flow rate. ESI was used for Mass Spectrum in positive ion MRM mode with target ions m/z: 350.9/282.2(voriconazole) and m/z: 307.0/238.0(fluconazole). Results The linear range of voriconazole was 0.1–20 μg/ml (r=0.999 5）. The lower limit of quantitation was 0.1 μg/ml. The extraction recovery was higher than 90%. RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%. The plasma concentrations measured by this method were in the range of 0.97 to 18.7 μg/ml from 10 patients with hepatic insufficiency who were treated with voriconazole. Conclusion The established method was fast, accurate and sensitive. It can be applied for the therapeutic drug monitoring of voriconazole, and provided a good base for rationalized medication treatment in patients with hepatic insufficiency. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- voriconazole /
- hepatic insufficiency /
- therapeutic drug monitoring
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近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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表 1 方法学考察结果(n=6)
浓度（μg/ml） 日内 日间 提取
回收率
（%）基质
效应
（%）$\bar{x}\pm s$ 精密度(%) $\bar{x}\pm s$ 精密度(%) 0.3 0.27±0.01 3.47 0.28±0.01 3.43 93.57 88.85 8 7.75±0.40 5.13 7.66±0.08 1.09 91.05 90.37 15 14.32±0.29 2.04 14.69±0.41 2.76 92.46 93.61 
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表 2 稳定性考察结果(n=6)
浓度(μg/ml) 室温放置12 h 反复冻融3次 −20 ℃放置30 d $\bar{x}\pm s$ RSD(%) $\bar{x}\pm s$ RSD(%) $\bar{x}\pm s$ RSD(%) 0.3 0.30±0.01 2.83 0.28±0.01 5.32 0.31±0.02 5.31 8 7.98±0.21 2.62 8.15±0.27 3.31 7.87±0.30 3.78 15 14.56±0.63 4.35 14.51±0.56 3.89 15.08±1.02 6.79
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