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枇芩口服液是我院皮肤科的临床经验方，主要由枇杷叶、黄芩、赤芍、甘草等十三味中药制成，具有清热、祛湿、凉血等功效，临床主要用于治疗寻常型痤疮[1]。目前质量控制指标为制剂中的总黄酮以及君药黄芩中的成分[2]，不能全面反映制剂的整体质量。组方中黄芩、枇杷叶为君药，具有清热解毒，凉血消肿作用。黄芩活性成分主要为黄酮类化合物，其中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素抗炎及抑菌效果好。枇杷叶等药材中含有绿原酸和咖啡酸成分，具有抗菌、消炎等作用。组方中的芍药苷及甘草中的甘草酸胺同样具有抗炎、抑菌及免疫调节等功效，诸药合用，在治疗寻常痤疮中发挥协同作用[3]。本研究拟采用双波长高效液相色谱法测定绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素含量[4-5]，以进一步完善其质量标准。
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Agilent 1200 Series高效液相色谱系统（含DAD检测器，美国Agilent公司）；AUX220电子分析天平（日本岛津公司）。
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枇芩口服液（自制，批号：20200220、20200224、20200315）；黄芩苷对照品（批号：110715-201821，含量95.4%）、黄芩素对照品（批号：111595-200905，含量98.5%）、绿原酸对照品（批号：110753-201415，含量96.2%）、芍药苷对照品（批号：110736-201337，含量94.9%）、甘草酸铵对照品（批号：110731-201418，含量93.1%），咖啡酸对照品（批号：110885-200102）、汉黄芩素对照品（批号：111514-200403，含量98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，TEDIA公司，批号：18085030）。
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Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)为色谱柱；流动相：0.02%磷酸水溶液(A)–乙腈(B)梯度洗脱，洗脱程序：0～10 min，10%B；10～20 min，10%～20%B；20～30 min，20%～25%B；30～40 min，25%～30% B；40～50 min，30%～40% B；50～60 min，40%～70% B； 60～65 min，70%～30% B；65～70 min，30%～10%B；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。
检测波长：0～18.0 min，325 nm（检测绿原酸、咖啡酸）；18.0～65.0 min，280 nm（检测芍药苷，黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素）。
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分别称取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成含绿原酸355.9 μg/ml、咖啡酸550.0 μg/ml、芍药苷1480 μg/ml、黄芩苷772.7 μg/ml、黄芩素660.0 μg/ml、甘草酸铵642.4 μg/ml和汉黄芩素499.8 μg/ml的单一对照品储备液。精密吸取上述对照品储备液适量，置于同一10 ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度依次为35.59、5.500、296.1、77.27、66.00、128.5和1.999 μg/ml的混合对照品溶液。
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精密量取相应批号的枇芩口服液2ml，置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
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根据处方中各药的比例，依次制备不含绿原酸（缺茵陈、墨旱莲和枇杷叶）、咖啡酸（缺夏枯草、墨旱莲、枇杷叶和丹参）、赤芍、黄芩和甘草的阴性样品，按“2.2.2”项下供试品溶液制备阴性溶液。
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精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，结果见图1。在供试品溶液色谱中，与对照品溶液色谱中绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素位置上均有相应的色谱峰出现，且色谱峰之间的分离度均˃1.5，理论板数˃3000。
图 1 枇芩口服液HPLC色谱图
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分别精密吸取对照品储备液0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、5.00ml置于5ml棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀。即得系列浓度的混合对照品溶液，按照上述的色谱分析条件进样分析，以浓度（X，μg/ml）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及线性范围，结果见表1。
表 1 枇芩口服液中有效成分的回归方程、相关系数和线性范围
有效成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 绿原酸 Y=18.102X−0.0003 0.9991 3.559～35.59 咖啡酸 Y=51.805X+0.0874 0.9993 0.5500～5.500 芍药苷 Y=2.2865X+0.5859 0.9999 29.61～296.1 黄芩苷 Y=215.23X+43.349 0.9999 7.727～77.27 黄芩素 Y=14.843X−69.402 0.9998 6.600～66.00 甘草酸铵 Y=4.7447X−48.701 0.9995 12.85～128.5 汉黄芩素 Y=413.09X−64.950 0.9998 0.1999～1.999 -
精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果显示绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.57%、1.98%、1.74%、1.07%、2.01%、1.41%和1.69%，表明仪器精密度良好。
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取同一批样品（批号：20200224）6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积，绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.91%、1.90%、0.68%、1.41%、1.78%、1.40%和1.97%，表明方法重复性良好。
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取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积，绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.05%、1.90%、1.32%、1.06%、1.78%、2.02%和1.87%，结果表明供试品溶液在10 h内稳定。
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精密量取已知含量（批号：20200224）的枇芩口服液1ml，共9份，分别按相当于绿原酸、咖啡酸、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵和汉黄芩素含有量的80%、100%、120%加入对照品溶液（不同加入量各3份），按“2.1”项下色谱条件进样，测定含量，并计算加样回收率和RSD，结果见表2。
表 2 枇芩口服液加样回收率测定结果(n=9)
成 分 样品含量
(µg)加入量
(µg)测得量
(µg)回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）绿原酸 66.46 56.94 122.4 98.24 98.55 0.75 66.46 71.18 136.2 98.02 66.46 88.98 154.9 99.39 咖啡酸 11.32 8.800 19.94 97.99 97.95 0.67 11.32 11.00 22.02 97.27 11.32 13.20 24.33 98.59 芍药苷 638.3 493.5 1117.7 97.14 97.58 0.67 638.3 592.2 1220.7 98.34 638.3 710.6 1329.3 97.25 黄芩苷 151.3 123.6 274.13 99.38 99.70 0.61 151.3 154.5 304.73 99.31 151.3 185. 5 337.47 100.40 黄芩素 103.7 84.48 187.93 99.71 98.88 1.51 103.7 105.6 209.07 99.78 103.7 132.0 231.93 97.15 甘草酸铵 115.5 102.8 217.17 98.90 98.26 1.41 115.5 128.5 243.0 99.22 115.5 154.2 264.57 96.67 汉黄芩素 1.908 1.599 3.427 95.02 96.41 1.41 1.908 1.999 3.837 96.50 1.908 2.399 4.252 97.72 -
取3个批号枇芩口服液（批号：20200220、20200224、20200315），按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算7种成分的含量，结果见表3.
表 3 枇芩口服液7种成分的含量测定结果（n=3，μg/ml）
批号 绿原酸 咖啡酸 芍药苷 黄芩苷 黄芩素 甘草酸铵 汉黄芩素 20200220 69.54 12.11 615.3 157.3 99.97 112.2 1.709 20200224 66.46 11.32 638.3 151.3 103.7 115.5 1.908 20200315 65.80 11.21 633.2 149.2 105.2 117.2 1.911 -
试验中选择的7种成分来源于黄芩、夏枯草、茵陈、赤芍和甘草，全面覆盖君、臣、佐、使中的多味药材，将其作为质控指标，以提高质量控制的整体性和特征性。因测定成分绿原酸分别存在于组方中茵陈、枇杷叶等药材中，咖啡酸存在于枇杷叶、丹参等药材中，因此按照相应的方法制备阴性供试品溶液。
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试验采用高效液相的DAD检测器分别对7种对照品在200～400 nm处扫描，结果绿原酸和咖啡酸在325 nm波长处有最大紫外吸收，芍药苷，黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素在280 nm波长处有最大吸收，因此本实验选择325nm和280 nm作为测定波长。
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考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸水溶液等流动相系统，结果采用乙腈-0.02%磷酸水溶液梯度洗脱，对照品溶液与供试品溶液各成分分离度较好，梯度洗脱中基线相对平稳，峰形较好。此外，对柱温、流速、进样量等色谱条件进行优化最终确定色谱条件。
Simultaneous determination of seven components in Piqin oral liquid by dual-wavelength HPLC
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摘要:
目的 建立高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中绿原酸、咖啡酸、芍药苷、甘草酸铵、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素7种成分含量。 方法 采用双波长HPLC，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.02%磷酸水溶液(A)–乙腈(B)，梯度洗脱。流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。检测波长：0～18.0 min，325 nm（检测绿原酸、咖啡酸）；18.0～65.0 min，280 nm（检测芍药苷，黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵、汉黄芩素）。 结果 枇芩口服液中的绿原酸、咖啡酸、芍药苷、甘草酸铵、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素完全分离，7种成分峰面积与浓度的线性关系良好，加样回收率为96.41%～99.70%。 结论 该法操作简单、准确、重复性好，可用于枇芩口服液的质量控制。 Abstract:Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC) method for simultaneous determination of the contents of 7 components of chlorogenic acid, caffeic acid, paeoniflorin, ammonium glycyrrhizinate, baicalin, baicalein, and wogonin in Piqin oral liquid. Methods A double-wavelength HPLC method was performed. The column was Agilent Zorbax SB-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was 0.02% phosphoric acid aqueous solution (A)-acetonitrile (B) gradient elution; Flow rate: 1.0 ml/min; Column temperature: 35℃; Injection volume: 20 μl; Detection wavelength: 0-18.0 min, 325 nm (detect chlorogenic acid, caffeic acid); 18.0-65.0 min, 280 nm (detect paeoniflorin, baicalin, baicalein, ammonium glycyrrhizinate, wogonin) . Results The chlorogenic acid, caffeic acid, paeoniflorin, ammonium glycyrrhizinate, baicalin, baicalein and wogonin were completely separated. Seven components have a good linear relationship between the peak area and concentration, with the recoveries between 96.41% and 99.70%. Conclusion This method is simple, accurate and reproducible, and can be used for the quality control of Piqin oral liquid. -
Key words:
- Piqin oral liquid /
- HPLC /
- double-wavelength /
- content determination
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海绵是具有代表性的海洋生物，其共附生微生物也是近年来研究的热点。在海洋高盐、高压、低温、寡营养的生存环境下，海绵共附生微生物能够产生结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物。其中海绵共附生真菌是海绵化学多样性的重要来源[1]。
曲霉属 (Aspergillus sp)真菌分布广泛而且研究丰富。海洋曲霉属真菌的次级代谢产物主要包括聚酮类[2]、生物碱类[3]、肽类[4]、萜类[5]等化合物，具有抗肿瘤[6]、抗菌[7]、抗病毒[4]等生物活性。本课题的土曲霉(Aspergillus terreus)是从我国南海西沙永兴岛海域的棕色扁海绵Phakellia fusca中分离得到的，属于散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Tri-chocomaceaez)的一种真菌，在海洋动植物和陆地植物中均有分布。该菌的次级代谢产物具有多样性，包括生物碱类化合物[8]、丁烯酸内酯类化合物[9]、萜类化合物[10]、环肽类化合物[11]等。本文采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、高效液相色谱等多种分离方法从土曲霉Aspergillus terreus中共分离得到8个单体化合物。通过理化常数测定、波谱数据分析等方法确定了化合物的结构。化合物1～8的结构见图1。
1. 材料和方法
1.1 样品
菌株来源于棕色扁海绵Phakellia fusca，由上海交通大学海洋药物研究中心鉴定为Aspergillus terreus，菌株保存在上海交通大学医学院附属仁济医院药学部海洋药物研究中心（菌株编号152805）。
1.2 仪器与试剂
Agilent 600核磁共振波谱仪（美国 Agilent 公司）；Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XBridge C18半制备型液相色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm）；快速制备色谱仪（法国Interchim公司）；OSB-2100旋转蒸发仪（日本EYELA 公司）；振荡培养箱（上海知楚）。薄层硅胶、200~300目柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20凝胶（瑞典GE Healthcare公司）；色谱纯试剂（天津康科德科技有限公司）；其他分析纯有机试剂（上海化学试剂公司）；氘代试剂（剑桥同位素实验室）。
1.3 发酵与萃取
取Aspergillus terreus单菌落接种到装有100 ml PDB培养液的250 ml三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养3 d，以该发酵液10%的接种量接到装有500 ml的真菌2号培养液（甘露醇20 g，麦芽糖20 g，CaCO3 15 g，葡萄糖10 g，谷氨酸钠10 g，酵母提取物3 g，玉米浆1 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，海盐30 g，蒸馏水1 L）的1 L三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养10 d，获得菌株的发酵物。收集发酵液24 L，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到乙酸乙酯相浸膏9.3 g。
1.4 提取分离
乙酸乙酯相浸膏首先经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（体积比为1∶1）作为溶剂进行洗脱，得到组分Fr.1～Fr.4。组分Fr.2经硅胶柱色谱（石油醚：丙酮 = 100∶1～0∶100）分离得到组分Fr.2-1～Fr.2-9。组分Fr.2-5经反相中压柱色谱分离得到8个亚组分，其中Fr.2-5d经重结晶得到化合物3 (2.5 mg)。组分Fr.2-6经LH-20凝胶柱色谱和反相半制备HPLC（38%乙腈-水）分离得到化合物1 (3.5 mg, tR = 21.0 min)。化合物2 (3.5 mg, tR = 13.0 min)由组分Fr.2-7经反相半制备HPLC，以33%乙腈-水为流动相等梯度洗脱得到。组分Fr.2-8以乙腈-水 (体积比10∶90～100∶0)为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（20%乙腈-水）分离得到化合物4 (2.0 mg, tR=30.0 min)、 化合物5 (4.0 mg, tR=28.0 min)和化合物6 (9.0 mg, tR=14.0 min)。Fr.3经过硅胶柱色谱分离得到7个组分，其中Fr.3-3经反相半制备HPLC进一步纯化得到化合物7 (1.7 mg, tR=12.0 min)。组分Fr.3-4以20%～100%的乙腈-水为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（15%乙腈-水）分离得到化合物8 (18.0 mg, tR = 8.0 min)。
2. 结构鉴定
化合物1为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为黄色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 466.15。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 12.23 (1H, s)为氨基质子信号；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.82 (1H, dd, J=8.5, 0.8 Hz, H-3), 7.89 (1H, dd, J=7.9, 1.3 Hz, H-6), 7.60 (1H, td, J=8.5, 1.3 Hz, H-4), 7.22 (1H, m, H-5)，芳香质子信号δH 9.21 (1H, brs, H-9), 8.70 (1H, d, J=4.5 Hz, H-1′), 8.25 (1H, dt, J=8.0, 2.2 Hz, H-3′), 7.36 (1H, dd, J=8.0, 4.5 Hz, H-2′)，提示3-取代吡啶环的存在；1个芳香质子信号δH 7.27 (1H, s, H-10′)；4个甲氧基质子信号δH 3.97 (3H, s, 4″-OCH3), 3.91 (3H, s, 3″-OCH3), 3.90 (3H, s, 5″-OCH3), 3.82 (3H, s, 7″-OCH3)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示24个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.2, 167.2, 164.0为羰基碳信号；17个芳香碳信号；δC 61.3, 61.3, 56.5, 52.7为4个甲氧基碳信号。碳信号归属为：δC 168.2 (C-7)、167.2 (C-7′′)、164.0 (C-7′)、152.6 (C-4′)、151.5 (C-5′′)、149.3 (C-2′)、148.8 (C-3′′)、146.9 (C-4′′)、140.4 (C-2)、135.2 (C-6′)、133.6 (C-4)、130.3 (C-1′)、127.9 (C-6)、125.8 (C-2′′)、123.8 (C-5)、123.6 (C-5′)、121.8 (C-3)、120.4 (C-1′′)、119.0 (C-1)、108.8 (C-6′′)、61.3 (3″-OCH3)、61.3 (4″-OCH3)、56.5 (5″-OCH3)、52.7 (7″-OCH3)。该化合物核磁数据与参考文献[11]对照基本一致，确定化合物为methyl-3,4,5-trimethoxy-2-(2-(nicotinamido)benzamido) benzoate。
化合物2为黄色粉末(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 457.14。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，δH 12.19 (1H, s, 3-NH), 11.10 (1H, s, 1′′-NH), 8.52 (1H, d, J = 8.1 Hz, 1′-NH)为氨基质子信号；1个芳香质子单峰信号δH 9.29 (1H, s, H-7)；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.44 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7′′), 7.92 (1H, dd, J = 7.9, 1.5 Hz, H-4′′), 7.63 (1H, td, J = 7.9, 1.5 Hz, H-6′′), 7.20 (1H, td, J = 7.6, 1.5 Hz, H-5′′)；2个相邻的连接杂原子的次甲基质子信号δH 4.55 (1H, dd, J = 8.1, 2.9 Hz, H-2′), 4.41 (1H, m, H-4′)；3个甲基质子信号δH 3.70 (3H, s, H-9′′), 3.52 (3H, s, H-9), 1.19 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-5′)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示20个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.8, 167.3, 162.7, 159.5, 150.1为羰基碳信号；10个芳香碳信号；δC 65.9, 59.8为2个连杂原子的次甲基碳信号；δC 52.4, 28.6, 20.5为3个甲基碳信号，结合氢谱信号，确定有一个甲氧基和一个氮甲基。碳信号归属为：δC 168.8 (C-3′)、167.3 (C-8″)、162.7 (C-10)、159.5 (C-4)、151.2 (C-8a)、150.1 (C-2)、146.3 (C-7)、139.3 (C-2′′)、138.2 (C-6)、134.2 (C-6′′)、130.7 (C-4′′)、127.2 (C-4a)、123.4 (C-5′′)、120.7 (C-7′′)、117.1 (C-3′′)、65.9 (C-4′)、59.8 (C-2′)、52.4 (C-9″)、28.6 (C-9)、20.5 (C-5′)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +98 (c 0.1, MeOH)。该核磁数据与参考文献[12]对照基本一致，确定该化合物为terrelumamide A。化合物3为白色结晶(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 323.13。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 7.2-7.5 (10H, m, H-3′-H-7′, H-3′′-H-7′′)为10个芳香质子信号，提示存在2个单取代苯基；2个亚甲基质子信号δH 4.20 (2H, brs, H-1′′), 3.94 (2H, brs, H-1′)；1个甲氧基质子信号δH 3.92 (3H, s, 2-OCH3)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)共显示19个碳信号，结合DEPT谱推断δC 158.2为羰基碳信号；12个芳香碳信号；δC 34.0, 30.4为2个亚甲基碳信号，提示结构中存在两个苄基基团；δC 61.8为甲基碳信号；δC 144.2, 140.6, 129.4为3个烯碳信号。碳信号归属为：δC 158.2 (C-5), 144.2 (C-6), 140.6 (C-2), 136.5 (C-2′′), 135.6 (C-1′), 129.6 (C-3′, 7′), 129.4 (C-3, 3′′, 7′′), 128.6 (C-4′, 6′), 127.8 (C-4′′, 6′′), 126.9 (C-5′, 5′′), 61.8 (2-OCH3), 34.0 (C-1′′), 30.4 (C-1′)。该化合物核磁数据与参考文献[13]对照基本一致，确定化合物为emeheterone。
化合物4为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.07 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.89 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1个亚甲基质子信号δH 1.58 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13), 0.96 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基脂肪碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个缩醛碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.4为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳谱信号归属为：δC 157.9 (C-4)、155.0 (C-2)、143.5 (C-6)、132.7 (C-3)、115.8 (C-8)、95.0 (C-5)、70.5 (C-9)、40.4 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的ECD曲线显示在217 nm处有负的Cotton 效应(Δε −5.86)，其核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定该化合物为(8R, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物5为黄色结晶(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.06 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.90 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1组亚甲基质子信号δH 1.56 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-13), 0.95 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个次甲二氧基碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.5为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳信号归属为：δC 157.8 (C-4)、155.0 (C-2)、143.4 (C-6)、132.8 (C-3)、115.8 (C-8)、95.1 (C-5)、70.5 (C-9)、40.5 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的核磁数据与化合物4对比基本一致，ECD曲线显示在217 nm处有正的Cotton 效应(Δε +25.34)，提示为化合物4的差向异构体。将此化合物的核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定化合物为(8S, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物6为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛溶液无明显显色，ESIMS给出的分子离子峰[M+H]＋m/z 245.12。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，给出1组单取代的苯环芳香质子信号δH 7.32 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-5′), 7.26 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-4′), 7.20 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-6′)；2个次甲基氢信号δH 4.25 (1H, dd, J=10.5, 2.9 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.65-3.50 (2H, m, H-3); 3.65-3.50 (1H, m, H-10), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.5 Hz, H-10); 2.30 (1H, m, H-5), 1.88 (1H,m, H-5); 1.98 (2H, m, H-4)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示14个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.6, 165.3为酰胺羰基碳信号；6个芳香碳信号；δC 59.3, 56.4为2个连氮次甲基碳信号；δC 45.6, 37.0, 28.5, 22.7为4个亚甲基碳信号，提示结构中存在苯丙氨酸和脯氨酸片段。碳信号归属为：δC 169.6 (C-7)、165.3 (C-1)、136.1 (C-1′)、129.4 (C-2′)、129.4 (C-6′)、129.3 (C-3′)、129.3 (C-5′)、127.7 (C-4′)、59.3 (C-6)、56.4 (C-9)、45.6 (C-3)、37.0 (C-10)、28.5 (C-5)、22.7 (C-4)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -47 (c 0.1, MeOH)，将核磁数据与参考文献[15]对照基本一致，最终确定化合物为cyclo(S-Pro-S-Phe)。化合物7为浅黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色不明显，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 284.13。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中给出2个氨基质子信号δH 10.83 (1H, s, H-1′), 7.71 (1H, s, H-8)；1组邻二取代的苯环芳香质子信号δH 7.54 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8′), 7.03 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-7′), 6.94 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-6′)；1个芳香质子单峰信号δH 7.16 (1H, s, H-2′)；2个次甲基氢信号δH 4.28 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.36 (1H, m, H-3), 3.23 (1H, m, H-10), 3.21(1H, m, H-3), 3.05 (1H, m, H-10), 1.95 (1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-4), 1.59 (1H, m, H-4), 1.36 (1H, m, H-5)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示16个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.0, 165.5为酰胺羰基碳信号；8个芳香碳信号；δC 58.4, 55.2为2个连氮次甲基碳信号；δC 44.6, 27.7, 25.8, 21.8为4个亚甲基碳信号。碳信号归属为：δC 169.0 (C-7)、165.5 (C-1)、136.0 (C-9′)、127.3 (C-4′)、124.4 (C-2′)、120.8 (C-7′)、118.6 (C-5′)、118.2 (C-6′)、111.2 (C-8′)、109.3 (C-3′)、58.4 (C-6)、55.2 (C-9)、44.6 (C-3)、27.7 (C-5)、25.8 (C-10)、21.8 (C-4)。将核磁数据与化合物6对比，化合物7中吲哚基取代了化合物6中的苯基。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -90 (c 0.1, MeOH)，将该核磁数据与参考文献[16]对照基本一致，最终确定化合物为brevianamide F。化合物8为棕黄色油状(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋Na]＋m/z 177.06。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，给出3个烯氢信号δH 6.72 (1H, m, H-7), 6.37 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-6), 6.00 (1H, s, H-2)，其中一对为反式烯氢；2个羟基信号δH 5.80 (1H, s, 5-OH), 5.68 (1H, s, 4-OH)；2个连氧次甲基质子信号δH 4.50 (1H, m, H-4), 3.89 (1H, m, H-5)；1个甲基质子信号δH 1.88 (3H, d, J = 6.3 Hz, H-8)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示8个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 203.7为酮羰基碳信号；4个双键碳信号；δC 80.8, 76.4为2个连氧次甲基碳信号；δC 19.1为甲基碳信号。碳信号归属为：δC 203.7 (C-1)、168.5 (C-3)、139.4 (C-7)、125.5 (C-6)、124.8 (C-2)、80.8 (C-5)、76.4 (C-4)、19.1 (C-8)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +78 (c 0.1, MeOH)，将该化合物核磁数据与参考文献[17]对照基本一致，确定化合物为terrein。3. 活性测试
对分离得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试。采用PBS缓冲液为反应体系，利用α-葡萄糖苷酶，以4-硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）为特异性底物，以阿卡波糖作为阳性药，分别设立空白对照组、α-葡萄糖苷酶空白组和PNPG空白组，评价化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，化合物3具有较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L。其他化合物没有明显的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。另外，还对化合物的抗氧化活性进行测试。采用DPPH的方法，以抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸作为阳性药对分离得到的化合物进行了体外抗氧化活性测试。结果显示这些化合物抗氧化活性不明显。
4. 讨论
本研究从棕色扁海绵共附生真菌土曲霉中分离得到了8个化合物，其中化合物3、4、5、7为首次从该菌中分离得到，丰富了土曲霉次级代谢产物的多样性，为进一步探索该属真菌的化学成分和生源途径提供了理论依据。
根据文献报道，化合物2可以提高胰岛素的敏感性[13]，化合物4和5测试了多个肿瘤细胞系，均显示细胞毒活性不明显[15]，化合物6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄体微球菌、白色念珠菌和隐球菌等具有很好的抗菌活性[16]，化合物7对PaCa-2胰腺细胞的抗癌活性和抗菌活性都不明显[17]，化合物8能够抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP-CR的血管生成素分泌，能够抑制人脐静脉内皮细胞的血管形成[18]。为了更好的探究该真菌代谢产物的活性，对分离得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性测试。其中化合物3显示了较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的机制有待于进一步研究。
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图 1 枇芩口服液HPLC色谱图
注：A1.混合对照品(325nm)；A2.混合对照品(280nm)；B1.供试品(325nm)；B2.供试品(280nm)；C.绿原酸阴性样品、D.咖啡酸阴性样品(325nm)；E.赤芍阴性样品、F.黄芩阴性样品、G.甘草阴性样品(280nm) 1.绿原酸；2.咖啡酸；3.芍药苷；4.黄芩苷；5.黄芩素；6.甘草酸铵；7.汉黄芩素
表 1 枇芩口服液中有效成分的回归方程、相关系数和线性范围
有效成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 绿原酸 Y=18.102X−0.0003 0.9991 3.559～35.59 咖啡酸 Y=51.805X+0.0874 0.9993 0.5500～5.500 芍药苷 Y=2.2865X+0.5859 0.9999 29.61～296.1 黄芩苷 Y=215.23X+43.349 0.9999 7.727～77.27 黄芩素 Y=14.843X−69.402 0.9998 6.600～66.00 甘草酸铵 Y=4.7447X−48.701 0.9995 12.85～128.5 汉黄芩素 Y=413.09X−64.950 0.9998 0.1999～1.999 
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表 2 枇芩口服液加样回收率测定结果(n=9)
成 分 样品含量
(µg)加入量
(µg)测得量
(µg)回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）绿原酸 66.46 56.94 122.4 98.24 98.55 0.75 66.46 71.18 136.2 98.02 66.46 88.98 154.9 99.39 咖啡酸 11.32 8.800 19.94 97.99 97.95 0.67 11.32 11.00 22.02 97.27 11.32 13.20 24.33 98.59 芍药苷 638.3 493.5 1117.7 97.14 97.58 0.67 638.3 592.2 1220.7 98.34 638.3 710.6 1329.3 97.25 黄芩苷 151.3 123.6 274.13 99.38 99.70 0.61 151.3 154.5 304.73 99.31 151.3 185. 5 337.47 100.40 黄芩素 103.7 84.48 187.93 99.71 98.88 1.51 103.7 105.6 209.07 99.78 103.7 132.0 231.93 97.15 甘草酸铵 115.5 102.8 217.17 98.90 98.26 1.41 115.5 128.5 243.0 99.22 115.5 154.2 264.57 96.67 汉黄芩素 1.908 1.599 3.427 95.02 96.41 1.41 1.908 1.999 3.837 96.50 1.908 2.399 4.252 97.72
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表 3 枇芩口服液7种成分的含量测定结果（n=3，μg/ml）
批号 绿原酸 咖啡酸 芍药苷 黄芩苷 黄芩素 甘草酸铵 汉黄芩素 20200220 69.54 12.11 615.3 157.3 99.97 112.2 1.709 20200224 66.46 11.32 638.3 151.3 103.7 115.5 1.908 20200315 65.80 11.21 633.2 149.2 105.2 117.2 1.911
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[1] 王庆芬, 杨育儒, 沈秋莲, 等. 枇芩颗粒剂体外抑制金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的作用[J]. 中国现代应用药学, 2015, 32(12):1457-1460. [2] 王庆芬, 倪晓霞, 李杰, 等. 高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量[J]. 中国药业, 2015, 24(16):93-95. [3] 缪小海. 面膜联合中药汤剂治疗寻常痤疮的可行性分析[J]. 临床医药文献电子杂志, 2019, 6(76):150-151. [4] 姚晓, 蒋骊龙, 陈建伟. 双波长HPLC同时测定小儿咳喘灵颗粒中8种有效成分的含量[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(7):1036-1040. [5] 邱小玉, 刘玉萍, 刘烨, 等. HPLC法同时测定茵栀黄口服液中10种有效成分[J]. 中草药, 2019, 50(15):3648-3653. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2019.15.020 -
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