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美沙拉嗪化学名为5-氨基水杨酸，是轻、中度溃疡性结肠炎有效的一线治疗药物。它直接作用于炎症黏膜，可抑制引起炎症的前列腺素合成、抑制炎症介质白三烯的形成而起抗炎作用，具有疗效好及毒副作用小等优点[1-2]。美沙拉嗪口服后在体内被迅速吸收，在肠腔及肝脏中经N-乙酰转移酶代谢为主要产物N-乙酰-5-氨基水杨酸。一般认为，其在肠腔黏膜局部浓度越大越有利于发挥作用[3]。
目前市售的美沙拉嗪药物有美沙拉嗪缓释颗粒剂（Etiasa）、美沙拉嗪肠溶片等剂型，考虑到人们的用药方便和美沙拉嗪的作用部位，课题组开发了美沙拉嗪药物的新剂型，即美沙拉嗪肠溶缓释颗粒剂，以期同时发挥药物肠溶和缓释的作用效果，均匀释放、定位起效，达到更好、更有效的治疗溃疡性结肠炎并减轻毒副作用的效果。为了考察美沙拉嗪新制剂与市售制剂的区别，本实验考察了美沙拉嗪新制剂临床前体内药动学特征，以市售制剂为参比，考察新制剂的相对生物利用度，进行药动学参数的比较评价；并且进一步考察了美沙拉嗪肠溶缓释颗粒剂的制剂学肠溶和缓释特点，评价作用部位释放情况，为该药新制剂提供系统可靠的临床前药动学数据，并为进一步的制剂工艺和处方的优化提供依据。
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VARIAN 1200L型液相色谱-质谱联用仪（美国瓦里安公司）；Dionex SUMMIT高效液相色谱仪（美国戴安公司）；Jouan CR3i型多功能高速冷冻离心机（法国Jouan公司）；SAVANT SPD121P SpeedVac型减压离心浓缩仪（北京塞万特公司）；XS205 Dual Range型电子分析天平（梅特勒-托利多公司）。
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美沙拉嗪标准对照品（批号：100546-200902，含量：99.8%）、乙酰美沙拉嗪标准对照品（批号100711-200401，含量：99.3%）、氯唑沙宗标准对照品均由上海市药物（中药）代谢产物研究重点实验室提供；美沙拉嗪肠溶缓释颗粒剂（1 g/袋，批号DV121102-1A）为自研制剂；美沙拉嗪缓释颗粒剂（批号：07444，规格500 mg/袋，Ethypharm生产，法国）为市售制剂；甲醇（MERK公司）、乙腈（TEDIA公司）、甲酸（ROE SCIENTIFIC INC公司）均为色谱纯试剂；醋酸铵（江苏强盛功能化学股份有限公司）为分析纯；水为去离子水（经Hi-Tech水纯化系统自制）。
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健康、成年SD大鼠，体重180～220 g，雌、雄数量均等，年龄6～8周，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号SCXK（沪）2012-0005]。
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流动相为甲醇-5 mmol/L醋酸铵水溶液（85∶15）；流速为0.4 ml/min，进样量10 μl[4-5]。
电喷雾离子源，负离子模式检测，多反应监测方式进行一/二级质谱分析。质谱检测工作参数如下：美沙拉嗪、乙酰美沙拉嗪和内标氯唑沙宗Q1(Mass)分别是151.7、193.8、167.8；Q3(Mass)分别是107.9、149.7、131.7；扫描时间0.33s，SIM宽0.7，Q1峰宽3.0；Q3峰宽2.0；Needle-4500V；Shield-25 V；雾化气为空气，48psi；干燥气为空气，300 ℃，20psi；毛细管电压为−35 V；碰撞能分别是13、14、19 V，碰撞气：1.84mTorr；检测器电压为1 650 V[6-7]。
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精密称取美沙拉嗪、乙酰美沙拉嗪和内标氯唑沙宗适量，加甲醇溶解，配制成浓度为5 mg/ml的标准储备液，然后采用相应的流动相逐级稀释，得到系列混合工作溶液和内标溶液。同法制备质控标准样品的系列混合工作溶液和内标溶液。
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取100 μl血浆样品，加入氯唑沙宗溶液10 μl，涡旋；然后加入甲醇300 μl，涡旋3 min，离心10 min（8000 r/min）；吸取上清液250 μl，再离心5 min（12000 r/min）；吸取上清液100 μl待测。
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在上述分析方法下，考察样品、内标和内源性物质的干扰情况。结果表明生物样品中的内源性物质不干扰美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪的测定，结果见图1。
图 1 SD大鼠血浆中美沙拉嗪、乙酰美沙拉嗪的LC-MS/MS典型谱图
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精密吸取美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪系列混合标准工作溶液，用空白血浆进行提取，配制成美沙拉嗪的浓度为0.1002、0.2004、0.501、2.004、5.01、10.02、20.04 μg/ml和乙酰美沙拉嗪的浓度为0.02012、0.0503、0.2012、1.006、5.03、10.06、20.12 μg/ml，进样分析后求得美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪的标准曲线方程分别为Y =0.6914C+0.0310（r=0.9993）、Y =3.1022C +0.0227（r=0.9999），线性范围为0.1002～20.04 μg/ml和0.02012～20.12 μg/ml，最低定量限分别为0.1002和0.02012 μg/ml（S/N>5）。
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按照上述方法配制最低定量限、低、中、高4个浓度的质控标准样品，美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪质控标准样品浓度分别为0.1004、0.02004，0.2008、0.0501，2.008、1.002和16.064、16.032 μg/ml。结果表明，准确度和精密度满足生物基质样品测定要求。
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在低、中、高3个浓度下，美沙拉嗪和乙酰美沙拉嗪在SD大鼠血浆中基质效应在70%～98%之间，绝对回收率在70%～90%之间，表明内源性物质对被测物质存在一定的抑制或增强的作用，但不影响样品的分析测定。
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血浆样品在室温下放置4h、−80 ℃保存60 d，处理后在自动进样器内放置24 h，以及3次冻融循环后样品均保持稳定，RSD在15%以内。结果表明，各生物基质样品在所考察的时间和条件下稳定，对测定结果的影响可以忽略。
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12只成年、健康SD大鼠，雌性、雄性各半，随机分成2组，每组6只；分别灌胃给予自研制剂和市售制剂各0.1 g/kg。
分别于给药前及给药后的1、2、3、4、5、6、8、12、24、36和48 h，从SD大鼠眼眶取血，置肝素化EP管中，离心，取上层血浆，置于−80 ℃冰箱保存待测。按照上述样品前处理的方法对生物基质样品进行预处理，并进样分析，计算目标药物浓度[8]。
数据处理：药动学数据以三因素方差分析和双单侧t检验进行统计分析。应用中国药科大学开发的药动学处理软件BAPP2.0程序计算有关药动学参数。
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采用非房室模型法估算的以美沙拉嗪表征的两组成年、健康SD大鼠给予自研制剂和市售制剂0.1 g/kg后的体内药动学参数见表1，药时曲线见图2。
表 1 口服给药后体内以美沙拉嗪表征的药动学参数
样品 cmax
(μg/ml)tmax
(h)t1/2
(h)MRT
(h)AUC0~48
(μg·h/ml)AUC0~∞(μg·h/ml) 自研制剂 5.66±0.77 4.3±0.8 15.92±4.64 18.21±4.76 53.94±4.03 59.49±7.24 市售制剂 6.74±0.41 5.0±1.1 13.97±3.40 16.97±3.56 66.49±5.16 71.68±8.85 
图 2 自制和市售美沙拉嗪的药时曲线图
用梯形面积法(AUC)估算的以美沙拉嗪表征的自研制剂和市售制剂的相对生物利用度为(90.62±9.36)%，即平均生物利用度基本一致。
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采用非房室模型法估算的以乙酰美沙拉嗪表征的两组成年、健康SD大鼠给予自研制剂和市售制剂0.1 g/kg后的体内药动学参数见表2，药时曲线见图3。
表 2 口服给药后体内以乙酰美沙拉嗪表征的药动学参数
样品 cmax
(μg/ml)tmax
(h)t1/2
(h)MRT
(h)AUC0~48
(μg·h/ml)AUC0~∞ (μg·h/ml) 自研制剂 7.93±0.75 5.7±0.8 7.32±0.51 9.93±0.30 75.05±4.91 75.56±5.02 市售制剂 10.22±1.37 6.0±0.0 6.84±1.01 10.02±0.81 94.27±8.67 94.79±8.56 
图 3 自制和市售乙酰美沙拉嗪的药时曲线图
采用梯形面积法(AUC)估算的以乙酰美沙拉嗪表征的自研制剂和市售制剂的相对生物利用度为(87.36±10.43)%，即平均生物利用度基本一致。
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流动相为乙腈-20 mmol/L醋酸铵水溶液（2∶98）；流速1.0 ml/min；检测波长为304 nm，柱温25 ℃。
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精密称取美沙拉嗪适量，加甲醇溶解，配成浓度为5 mg/ml的标准储备液，采用相应的流动相来逐级稀释，得到系列混合工作溶液和内标溶液。同法制备质控标准样品的系列混合工作溶液和内标溶液。
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将SD大鼠胃肠消化道分段内容物样品在室温下解冻，将药物颗粒数量大于5粒的内容物样品转移至100 ml烧杯中，搅拌均匀，再准确加入50 ml去离子水清洗相应的消化道分段，并溶解其内容物；药物颗粒数量小于5粒的内容物样品转移至10 ml EP离心管中，搅拌均匀，再准确加入5 ml去离子水清洗相应的消化道分段，并溶解其内容物[9-10]；分别超声溶解各内容物样品20 min，取1 ml溶液12000 r/min离心10 min，分离上清液，再12000 r/min离心10 min后，分离上清液待测。
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在上述分析方法下，考察了样品和内源性物质的干扰。结果表明生物样品中的内源性物质不干扰美沙拉嗪的测定，结果见图4～图8。
图 4 大鼠胃内容物样品中美沙拉嗪的HPLC图
图 5 大鼠十二指肠内容物样品中美沙拉嗪的HPLC图
图 6 大鼠空肠内容物样品中美沙拉嗪的高效液相色谱图
图 7 大鼠回肠内容物样品中美沙拉嗪的HPLC图
图 8 大鼠结肠内容物样品中美沙拉嗪的HPLC图
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精密吸取适量美沙拉嗪，用空白胃内容物提取上清液，配制成美沙拉嗪浓度分别为0.5045、1.009、5.045、10.09、20.18、50.45和100.9 μg/ml的溶液，进样分析，求得标准曲线方程为Y=0.1308C+0.0053（r=0.9996），线性范围为0.5045～100.9 μg/ml，最低定量限为0.5045 μg/ml（S/N>5）；用空白肠道内容物提取上清液配制成美沙拉嗪浓度分别为0.5135、1.027、5.135、10.27、20.54、51.35和102.7 μg/ml，进样分析后求得标准曲线方程为Y=0.1961C-0.0081，r=0.9999，线性范围为0.5135～102.7 μg/ml，最低定量限为0.5135 μg/ml（S/N>5）。
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按照上述方法配制最低定量限、低、中、高4个浓度的质控标准样品，SD大鼠胃内容物美沙拉嗪质控标准样品浓度为0.502、1.004、10.04和80.32 μg/ml，SD大鼠肠内容物美沙拉嗪质控标准样品浓度为0.504、1.008、10.08、80.64 μg/ml。结果表明，准确度和精密度满足生物基质样品测定要求。
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在最低定量限、低、中、高4个浓度下，SD大鼠胃肠道内容物中美沙拉嗪的绝对回收率在95%～99%之间，表明内源性物质对被测物质存在一定的抑制或增强的作用，但不影响样品的分析测定。
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本实验生物基质中药物浓度大于标准曲线上限，须经稀释后再测定，故考察了稀释效应。配制高浓度的质控样品，稀释相应倍数至高浓度，按照生物样品前处理方法进样测定，代入标准曲线求得美沙拉嗪浓度，稀释效应采用测定值与理论值RE值表示。结果表明，样品经稀释后分析结果准确，能满足生物基质样品分析要求。
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胃肠道样品在室温下放置4 h、−80 ℃长期保存60 d、处理后在自动进样器内放置36 h，以及3次冻融循环后样品均保持稳定，RSD在15%以内。结果表明，各生物基质样品在所考察的时间和条件下稳定，对测定结果的影响可以忽略。
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选用60只成年、健康SD大鼠，雌雄各半，实验SD大鼠禁食过夜（禁食15 h）后，随机分成2大组，分别以100 mg/kg给予自研制剂和市售制剂；每一大组又随机分成5小组，每小组6只，选取给药后2、4、6、8和12 h的大鼠胃肠消化道内分布的美沙拉嗪颗粒及药物残留量。另取6只SD大鼠（雌雄各半）作为空白对照，同样禁食过夜（禁食15 h）。分别于给药后2、4、6、8和12 h（每一时间点各6只SD大鼠），将SD大鼠乙醚麻醉，完整取出胃、十二指肠段、空肠段、回肠段和结肠段组织，分段解剖分离药物颗粒及内容物，置于−80 ℃冰箱保存待测。按胃肠消化道分段内容物样品预处理方法操作，测定胃肠消化道内容物中美沙拉嗪的浓度[11-12]。
由胃肠消化道内容物中美沙拉嗪浓度计算而得的自制和市售两种美沙拉嗪缓释颗粒相应的胃肠道美沙拉嗪残留量结果见图9和图10。
图 9 自研制剂在消化道各部位不同时间点的药物残留量
图 10 市售制剂在消化道各部位不同时间点的药物残留量
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本实验通过大鼠口服给药考察了美沙拉嗪肠溶缓释颗粒剂的药动学特征、相对生物利用度，并与市售制剂的药动学参数进行了比较研究，结果表明，自研制剂口服后给药后吸收和消除过程基本呈线性动力学特征。通过相对生物利用度和药动学参数的统计分析比较，提示自研制剂与市售制剂无显著性差异。
从药物颗粒分布结果看，自研制剂的微丸在SD大鼠胃肠消化道内具有一定流动性，且包衣对胃肠消化液的耐受性较好，随着SD大鼠胃肠消化道的蠕动，缓释颗粒微丸会逐步进入空肠、回肠和结肠，崩解并释放药物产生治疗作用；市售制剂微丸在SD大鼠胃肠消化道内流动性好，缓释颗粒微丸会较快进入空肠、回肠和结肠，崩解并释放药物产生治疗作用，同时，包衣在胃肠消化液中可能存在一定耐受性问题，使不同时间点胃肠消化道不同部位出现部分微丸的崩解，造成药物提前释放。
从美沙拉嗪不同部位药物含量看，自研制剂口服给药后在2～8 h时间段胃部内容物均存在高浓度分布，并随着时间的推移较快进入并存在于空肠、回肠和结肠，随后在6～12 h后，逐步在结肠达到高浓度分布，其结果有助于美沙拉嗪药物的体内吸收，以及缓释颗粒剂在作用部位的定点释放而发挥治疗效果；市售制剂SD大鼠口服后，缓释颗粒微丸会较快进入十二指肠、空肠、回肠、甚至结肠，在2～6 h时间段回肠内容物相对维持较高浓度分布，并随着时间的推移较快进入结肠，使结肠内容物中药物含量在4～12 h时间段内持续较高水平，有利于药物在作用位点及时释放以提高疗效。
Study on pharmacokinetic and gastrointestinal distribution study of mesalazine enteric-coated sustained-release granules in rats
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摘要:
目的 评价新型制剂美沙拉嗪肠溶缓释颗粒剂在SD大鼠体内的药动学以及在胃肠道的分布情况，了解该制剂临床前药动学特征及胃肠道分布特征。 方法 采用大鼠口服给药，测定其血药浓度和胃肠道残留浓度；以美沙拉嗪缓释颗粒剂（市售制剂）为参照，评价美沙拉嗪肠溶缓释颗粒剂（自研制剂）在大鼠体内吸收和消除过程、相对生物利用度、药物在胃肠道分布情况。 结果 美沙拉嗪肠溶缓释颗粒剂在大鼠体内，与美沙拉嗪缓释颗粒剂以美沙拉嗪表征的相对生物利用度为(90.62±9.36)%。美沙拉嗪肠溶缓释颗粒剂口服给药后在2~8 h时间段，药物在胃部存在高浓度分布，随着时间的推移逐步进入并残存于空肠、回肠和结肠，6~12 h后在结肠达到高浓度分布，其结果有助于美沙拉嗪药物的体内吸收，以及缓释颗粒剂在作用部位的定点释放与发挥疗效。 结论 美沙拉嗪肠溶缓释颗粒剂吸收和消除过程基本呈线性动力学特征，药动学参数与市售制剂无显著性差异，且在胃肠道有一定流动性，包衣对消化液耐受性好，胃肠道分布特征有利于药物的体内吸收和作用部位的定点释放。 Abstract:Objective To evaluate the pharmacokinetics of the new mesalazine enteric-coated sustained-release granules in SD rats and their distribution in the gastrointestinal tract, and to understand the preclinical pharmacokinetics and gastrointestinal distribution characteristics of the preparation. Methods Rats were administered orally to determine the drug concentrations in plasma samples and in the gastrointestinal tract. The commercially available mesalazine sustained-release granule was used as a reference to self-developed one to evaluate the process of absorption and elimination in vivo, relative bioavailability, and distribution in the gastrointestinal tract. Results The relative bioavailability of mesalazine enteric-coated sustained-release granule and non-enteric-coated one characterized by mesalazine was 89.62% ± 9.36%. After oral administration of mesalazine enteric-coated sustained-release granules, the drug has a high concentration distribution in the stomach within 2-8 hours, and gradually enters and remains in the jejunum, ileum and colon over time for 6-12 hours and then reaching a high concentration distribution in the colon. This help for the absorption of mesalazine, as well as the fixed-point release of the drug to produce a therapeutic effect. Conclusion The absorption and elimination process of mesalazine enteric sustained-release granule showed linear kinetic characteristics. There was no significant difference in pharmacokinetic parameters from the commercially available formulations, and it had a certain fluidity in the gastrointestinal tract. Good gastrointestinal distribution characteristics help the absorption of drugs in the body and the targeted release of the site of action -
Key words:
- mesalazine /
- enteric sustained-release granules /
- pharmacokinetic /
- rats /
- gastrointestinal tract
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据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。
1.1.2 细胞株
人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。
1.1.3 仪器
AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。
1.2 方法
1.2.1 曲妥珠单抗的表达与纯化
用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。
1.2.2 流式细胞术
细胞按3×104个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。
1.2.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO2，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.4 CCK8检测细胞增殖
将细胞按1×104个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A对照−A实验）/（A对照−A背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。
1.2.5 Western blot检测
根据分组将细胞按5×105个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。
1.2.6 统计学方法
采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度
将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×103）左右（图1）。
2.2 流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性
采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC50值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC50值为1.203 nmol/L，两者EC50值大约一致（图2）。
2.3 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 3 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；*P<0.05，****P<0.0001，与空白组比较；△△△△P<0.0001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.4 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 4 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；△△△P<0.001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.5 Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响
图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。
图 5 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；****P<0.0001，与对照组比较；##P<0.01、###P<0.001、 ####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较3. 讨论
ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×105的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。
曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。
茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长[22]。
为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。
本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
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表 1 口服给药后体内以美沙拉嗪表征的药动学参数
样品 cmax
(μg/ml)tmax
(h)t1/2
(h)MRT
(h)AUC0~48
(μg·h/ml)AUC0~∞(μg·h/ml) 自研制剂 5.66±0.77 4.3±0.8 15.92±4.64 18.21±4.76 53.94±4.03 59.49±7.24 市售制剂 6.74±0.41 5.0±1.1 13.97±3.40 16.97±3.56 66.49±5.16 71.68±8.85 
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表 2 口服给药后体内以乙酰美沙拉嗪表征的药动学参数
样品 cmax
(μg/ml)tmax
(h)t1/2
(h)MRT
(h)AUC0~48
(μg·h/ml)AUC0~∞ (μg·h/ml) 自研制剂 7.93±0.75 5.7±0.8 7.32±0.51 9.93±0.30 75.05±4.91 75.56±5.02 市售制剂 10.22±1.37 6.0±0.0 6.84±1.01 10.02±0.81 94.27±8.67 94.79±8.56
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[1] 马士杰, 罗小玲, 谢睿, 等. 美沙拉嗪缓释颗粒剂不同用药方式在轻-中度溃疡性结肠炎中的临床疗效[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2016, 25(11):1305-1306. [2] 林德鑫. 美沙拉嗪肠溶片治疗激素抵抗型重症溃疡性结肠炎的临床疗效评价[J]. 医学理论与实践, 2019, 32(7):1001-1002. [3] 解占峰. 美沙拉嗪缓释颗粒治疗溃疡性结肠炎30例疗效观察[J]. 中国肛肠病杂志, 2018, 38(7):54-55. doi: 10.3969/j.issn.1000-1174.2018.07.025 [4] 苏诗娜, 谢清春, 梁超峰, 等. 美沙拉嗪缓释胶囊含量测定方法的研究[J]. 今日药学, 2018, 28(4):233-237. doi: 10.12048/j.issn.1674-229X.2018.04.005 [5] 苏诗娜, 吕竹芬, 梁超峰, 等. 美沙拉嗪肠溶缓释微丸的制备及体外释放度考察[J]. 广东药科大学学报, 2018, 34(2):127-136. [6] 许勇, 王闰. LC-MS/MS法测定吡非尼酮在大鼠体内的药动学参数[J]. 中南药学, 2015, 13(9):919-922. doi: 10.7539/j.issn.1672-2981.2015.09.007 [7] 吴畅烜, 缪明星, 王毅兵, 等. LC-MS法研究熊胆粉提取物中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸在大鼠体内药物代谢动力学[J]. 中南药学, 2016, 14(7):716-720. [8] 饶志, 秦红岩, 邵云云, 等. 液相色谱-质谱联用方法测定大鼠血浆、尿液及结肠组织中美沙拉嗪及其代谢产物N-乙酰-5-ASA的浓度[J]. 中国药学杂志, 2014, 49(14):1252-1257. [9] 陈云. 美沙拉嗪对结肠炎大鼠肠黏膜完整性的影响[J]. 现代诊断与治疗, 2014, 25(17):3881-3882. [10] 王星星, 贺沁, 赵婕, 等. 美沙拉嗪联合酪酸梭菌对溃疡性结肠炎大鼠治疗作用及机制研究[J]. 延安大学学报, 2019, 17(1):5-8. [11] 黄林雄, 战丹, 韦文俊, 等. 糖苷PAL在大鼠胃肠道吸收动力学研究[J]. 中南药学, 2009, 7(5):335-337. [12] 李楠, 冯玲玲, 蒋学华, 等. 黄芩苷磷脂复合物大鼠在体胃肠道吸收研究[J]. 中国药学杂志, 2016, 51(12):994-998. 期刊类型引用(0)
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