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冠状病毒(coronavirus，CoVs)，在电子显微镜下呈“冠状”或冠状形态，因而命名为冠状病毒，可感染人类并容易引起急/慢性呼吸道系统疾病[1]。冠状病毒科分为α、β、γ和δ 4个属[2]，已知感染人的冠状病毒共有7种，分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2，其中，前4种病毒致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻度感染，后3种对人类健康产生严重威胁，具有较高的致死率，分别是2003年出现的冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)感染的严重急性呼吸道综合征、2012年在中东地区出现高致病性冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)感染的中东呼吸综合征和2019年出现的一种新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)[3]。
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冠状病毒是一种包膜病毒，具有直径为120~160 nm的圆形或椭圆形病毒体[4]。冠状病毒粒子外包裹着脂肪膜，膜表面有3种糖蛋白，分别是刺突糖蛋白(spike glycoprotein，S 蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M 蛋白)和小膜蛋白(envelope protein，E 蛋白)。其中，S蛋白是在病毒体表面上形成配体的I型糖蛋白，介导与宿主受体的连接，由S1和S2两个亚基组成；M蛋白是一种前蛋白，主要参与病毒的装配过程；E蛋白是一种高度疏水的蛋白，可促进病毒的组装和释放。病毒的基因组RNA与核衣壳蛋白(nucleocapsid，N蛋白)在病毒膜内复合形成螺旋衣壳(图1A)。
图 1 冠状病毒的结构(A)和SARS-CoV、MERS-CoV的基因结构(B)
冠状病毒RNA基因组是不分段的单股正链RNA，大小为26～32 kb，是RNA病毒中基因组最大的病毒[5]。冠状病毒的基因顺序一致，为5'-复制酶-S-E-M-N-3'，其中，RNA 5'端为被封端，具有甲基化的帽状结构，3'端被聚腺苷酸化，具有poly(A)尾巴，具有传染性。从5'端开始，基因组长度的2/3(长度：20～22 kb)区域由两个重叠的开放阅读框(open reading frame)1a和1b组成，共同起着病毒RNA聚合酶(Pol)的作用，编码翻译成两个多肽，pp1a和pp1ab[6]。这些多聚蛋白酶包括：类木瓜样蛋白酶(papain-like protease，PLpro)、3C胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(3C chymotrypsin like protease, 3CLpro，也称为主蛋白酶，Mpro)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)和解旋酶(helcase，Hel)等[7]。对于所有冠状病毒，结构蛋白编码在3′端，占基因组的1/3，按S-E-M-N顺序排列(图1B)。
冠状病毒通过S蛋白附着在特定的细胞受体上，S1亚基和同源受体之间的特异性相互作用会触发S2亚基的构象变化，导致病毒包膜和细胞膜融合，并释放核衣壳进入细胞质；病毒在组织蛋白酶介导下与细胞表面受体结合以内体途径或细胞表面非内体途径进入宿主细胞，低pH和pH依赖性的半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶可以促进冠状病毒通过内体途径进入宿主细胞[8]。病毒进入细胞后，正链RNA翻译产生负链RNA聚合酶前体蛋白，通过蛋白质水解过程产生RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)；在RNA聚合酶的作用下，生成全长的反义负链模板。从负链亚基因组模板中合成亚基因组mRNAs；亚基因组mRNAs的翻译会产生病毒结构蛋白，在内质网(endoplasmic reticulum, ER)中进行病毒膜蛋白装配，并形成小泡运出。在内质网高尔基体中间体(ER-Golgi intermediate compartment, ERGIC)中被衣壳蛋白包裹的正链RNA与膜蛋白识别，小泡内卷，包住RNA。病毒通过高尔基体(golgi apparatus, GA)释放囊泡，囊泡与质膜融合释放病毒，病毒继续感染其他细胞(图2)。冠状病毒RNA在复制过程中，因纠正其错误复制的酶活性较低，很容易出现病毒错误复制，导致病毒变异株的出现。
图 2 冠状病毒的生命周期
冠状病毒的生命周期是一个复杂、连续、多步的过程，病毒配体S蛋白、与病毒转录复制相关的RdRp、PLpro和3CLpro等多种蛋白质和酶发挥关键作用，是治疗冠状病毒感染疾病的关键药物靶标，以它们为靶点，国内外研究者发现了一系列的小分子抑制剂[9-22]，现分述如下。
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2003年，Hilgenfeld等报道了人冠状病毒(229E株)3CLpro(HCoV 229E 3CLpro)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV) 3CLpro的晶体结构，为抗冠状病毒药物研究提供了重要的结构生物学基础。Hilgenfeld等以此同源模建了SARS-CoV 3CLpro的三维结构，通过分子对接发现多肽类似物1(AG7088, rupintrivir，图3)可能对SARS-CoV 3CLpro具有良好的抑制活性[11]。该化合物原是一种鼻病毒3Cpro抑制剂，用于治疗普通感冒，但口服生物利用度低，需鼻腔给药，临床研究已终止[12]。
图 3 化合物1~5的化学结构和优化设计
2005年，Mesecar等确定AG7088与SARS 3CLpro结合的晶体结构，为后续结构优化和构效关系研究提供了重要的结构生物学基础。根据AG7088与SARS-3CLpro的结构模式，AG7088可划分为P1～P4四个区域。以此为模板对P2位点进行改造，合成了一系列多肽类小分子抑制剂。用荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer, FRET)酶水平活性研究表明，含有2-甲基丙烯基基团的化合物2(Kinact= 0.045/min，t1/2= 15 min, 图3)活性优于含有苯基基团的化合物3(Kinact= 0.014/min，t1/2= 49 min)，提示P2位点对应SARS 3CLpro的空腔可以容纳较小侧链残基[13]。以此为模板对P4位点再进行改造，又合成了一系列多肽类小分子抑制剂。化合物4的IC50值为200 μmol/L，但抗病毒活性丧失；随后，以化合物4(图3)为先导，在P4位点优化获得的化合物5[IC50=10 μmol/L，IC50(antiviral)=100 μmol/L]比化合物4[IC50= 200 μmol/L，IC50(antiviral)：未测]对SARS 3CLpro抑制活性和抗病毒活性更好。该化合物P4位点从原有的5-甲基异恶唑-3-基团变成1-[(叔丁氧羰基)氨基]-2-羟基乙烷-1-基团，易与SARS 3CLpro的谷氨酸(166)残基形成更多的氢键相互作用，有利于提高活性[14]。
2004年，Vederas等合成了一系列在α位带有邻苯二甲酰肼基团的酮-谷氨酰胺类似物，并测试其抑制抗SARS-CoV 3CLpro的活性。在酶水平系统构效关系表明：将三肽(Ac-Val-Thr-Leu)附着在谷氨酰胺上可产生更好的抑制剂6(IC50= 0.60 µmol/L，图4)[15]。2005年，Wong等以1为先导化合物，对其P1～P4位点优化设计，合成了一系列衍生物，其中，化合物7(图4)在酶水平对SARS-CoV 3CLpro的IC50值为1 µmol/L、Ki(inhibition constant)值为0.52 µmol/L，在感染了SARS-CoV的Vero E6细胞中测得的EC50值为0.11 µmol/L和CC50值>200 µmol/L，选择性指数(SI，selectivity index, CC50/EC50)>1 818[16]。
图 4 化合物6~8的化学结构和化合物8的结合模式图
2006年，Hsu等发现了化合物8(Ki= 53 nmol/L，图4),在SARS-CoV感染的Vero E6细胞EC50值为0.6 µmol/L。通过解析化合物8与SARS 3CLpro结合的晶体结构，化合物8 P1位点醛基的羰基基团与SARS 3CLpro的Cys145共价结合形成C-S共价键、与SARS 3CLpro的Gly143和Cys145形成两个N-H氢键、P1位点五元环内酰胺基团与SARS 3CLpro的His163、Phe140、Glu166形成3个氢键，P2和P3位点的N-H键分别与Gln189和Glu166的羰基氧原子形成氢键、P3位点的羰基氧原子与SARS 3CLpro的Glu166的N-H键形成氢键，这些共价键作用和氢键作用使化合物8和SARS 3CLpro紧密结合[17]。
此外，国内外还报道了一系列多肽或多肽类似物作为SARS-CoV 3CLpro抑制剂。2008年，Rao等解析了SARS-CoV 3CLpro的突变体H41A晶体结构，发现了化合物9(Ki= 3.3 µmol/L，图5)在酶水平上对SARS-CoV 3CLpro具有抑制作用，可以作为SARS-CoV 3CLpro小分子抑制剂[18]。2013年，Hua等通过基于片段的药物设计策略设计合成了一系列3CLpro抑制剂，当P1位置为谷氨酰胺，P2位置为亮氨酸，P3位置为萘丙氨酸残基时，化合物10(图5)在酶水平对SARS-CoV 3CLpro的IC50值为0.23 µmol/L [19]。2015年，Simmons等筛选含有2100个化合物库，发现了化合物11(k11777，图5)在酶水平(IC50= 0.68 nmol/L)对SARS-CoV 3CLpro的活性最好，对其优化将哌嗪环上的甲基换成乙基时，在酶水平化合物12(图5)的IC50值为0.04 nmol/L [20]。2011年，Akaji等报道了丝氨酸衍生物13(图5)在酶水平对SARS-CoV 3CLpro的抑制活性较好，IC50值为30 µmol/L [21]，进一步优化获得的苯异丝氨酸衍生物14(IC50= 43 µmol/L, 图5)比化合物13(IC50= 30 µmol/L)的活性低[22]。
图 5 化合物9~14的化学结构
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（1）天然产物
2006年，蒋华良等首次报道一种天然化合物15(槲皮素-3-β-半乳糖苷，图6)具有SARS-CoV 3CLpro抑制活性(IC50=42.79 μmol/L)。在分子对接模拟的基础上，由15为模板设计合成了8种衍生物，构效关系研究发现：①去除了槲皮素部分的7-羟基，活性降低；7-羟基上引入一个大的糖基取代基对活性影响不大；②糖基乙酰化使得活性丧失；③用其他糖取代半乳糖不影响活性。其中，化合物16(图6)活性较好，IC50为24.14 μmol/L[23]。2012年，Jeong等运用FRET法研究了64种天然化合物对SARS解旋酶的抑制作用。化合物17(杨梅素, 图6)通过影响ATP酶活性而非解旋酶活性，间接抑制了SARS-CoV解旋酶蛋白的表达，在酶水平对SARS-CoV病毒活性IC50值为2.71 μmol/L[24]。2014年，Park等发现补骨脂种子的乙醇提取物具有抗SARS-CoV PLpro活性，在酶水平IC50值为15 μmol/L。进一步分离获得6种芳香族化合物，它们均以剂量依赖性方式抑制PLpro，其中化合物18活性最佳(图6)在酶水平对SARS-CoV PLpro的IC50为4.2 μmol/L[25]。2015年，Ryu等发现含有羟基的查尔酮化合物19(图6)对3CLpro和PLpro的抑制IC50值分别为11.4和1.2 μmol/L[26]。2017年，Lee等从布鲁氏假单胞菌提取的多酚类化合物对3CLpro和PLpro具有抑制活性，多酚类化合物对PLpro的活性强于3CLpro；其中，化合物20(图6)对PLpro抑制活性最佳，IC50值为3.7 μmol/L[27]。
图 6 化合物15~20的化学结构
（2）三氮唑类
2016年，Wong等采用微滴定板组合反应策略修饰先导化合物，从中发现一类稳定的苯并三唑酯SARS-CoV 3CLpro抑制剂，动力学和质谱分析表明，该类化合物通过酰化修饰3CLpro的活性位点Cys145发挥作用，其中，化合物21(图7)在酶水平活性最佳，Ki为7.5 nmol/L[28]。此前，Stauffer等筛选NIH分子探针库(Molecular Libraries Probe Production Centers Network, MLPCN)发现了类似结构的SARS-CoV 3CLpro抑制剂，化合物22(图7)在酶水平对SARS-CoV 3CLpro的IC50为4.1 μmol/L[29]。
图 7 化合物21~22的化学结构
（3）咪唑类
2010年，Liang等设计一系列吡唑啉酮类化合物作为SARS-CoV 3CLpro抑制剂，其中，化合物中23(图8)在酶水平对SARS-CoV 3CLpro表现出了较强的抑制作用，IC50为5.5 μmol/L[30]。2016年，Liang等通过“老药新用”的方法筛选神经氨酸酶(neuraminidase)对SARS-CoV的作用，化合物24(图8)在酶水平对SARS-CoV 3CLpro 的IC50为16.4 μmol/L[31]。
图 8 化合物23~24的化学结构
（4）萘环类
2014年，Mesecar等对多种化学文库的高通量筛选，确定化合物25在酶水平具有SARS-CoV PLpro抑制活性IC50为8.7μmol/L。以此为先导化合物，开展结构优化和构效关系研究，发现化合物26(图9)中引入乙胺基基团与SARS-CoV PLpro的Gln270、Tyr269形成氢键，酶水平提高了20倍(IC50=0.46 μmol/L)，对SARS-CoV感染的Vero E6细胞的抗病毒活性为EC50=6 μmol/L[32]。2010年，Mesecar等通过对多种化学文库进行高通量筛选，鉴定了一种新的先导化合物27(图9)，在酶水平对SARS-CoV PLpro抑制活性IC50为59.2 μmol/L，在SARS-CoV感染的Vero E6细胞中无抗病毒活性。以27为先导化合物合成一系列类似物和进行构效关系研究，将甲氧基替换为乙酰胺基优化得到化合物28(图9)，28中的乙酰胺基基团与SARS-CoV PLpro的Tyr269形成氢键，28与SARS-CoV PLpro结合更加紧密，在酶水平(IC50=0.39 μmol/L)和抑制SARS-CoV感染的Vero E6细胞(EC50=8.3 μmol/L)方面同样有效[33]。2006年，来鲁华等以化合物29(图9)为模板，集中改变N-1和C-5位置取代基合成了一系列靛红类衍生物，研究了其构效关系。当N-1位置为β-萘亚甲基，C-5位置为甲酰胺时，化合物30在酶水平(图9)表现出明显的抑制作用，IC50为0.37 μmol/L[34]。
图 9 化合物25~30的化学结构
（5）喹啉类
2004年，Keyaerts等检测了抗疟药氯喹对感染SARS-CoV 的Vero E6细胞的抗病毒潜力。结果表明，化合物31(图10)的IC50值为8.8 μmol/L[35]。2005年，Nichol等发现化合物31(氯喹)对SARS-CoV(ED50为4.4 μmol/L)发挥抗病毒作用，提示其可能具有治疗方面的优势[36]，2014年，Wilde等检测了氯喹对感染SARS-CoV的Vero E6细胞的抗病毒活性，EC50值为4.1μmol/L，CC50 >128 μmol/L，SI>31[37]。2017年，Kao等对50240种化合物进行筛选SARS-CoV小分子抑制剂，鉴定出喹啉类化合物32(图10)，其在感染SARS-CoV的FRHK4细胞中测得的EC50值为8.4 μmol/L，在有效浓度下未观察到明显的细胞毒性[38]。
图 10 化合物31~32的化学结构
（6）吡啶类
2008年，James等利用高通量筛选发现了化合物33(MAC-5576，图11)对SARS-CoV 3CLpro的酶活性IC50值为0.5 μmol/L；以33为先导化合物，基于分子对接技术设计合成了一系列衍生物，其中，含有氯苯取代的化合物34(图11)对SARS-CoV 3CLpro酶抑制活性提高了10倍(IC50值为0.06 μmol/L)，表明SARS-CoV 3CLpro与呋喃一侧结合口袋具有较大疏水空腔，可以容纳苯环等大基团，为进一步结构优化提供了重要依据[39]。2008年，Vederas等制备一系列芳基亚甲基酮类似物，用FRET测试SARS 3CLpro抑制剂的酶活性。构效活性和35(图11)与SARS 3CLpro结合模型研究表明：3个芳香环对SARS-CoV 3CLpro具有良好抑制作用。该类化合物中35(图10)对IC50的抑制作用值为13 μmol/L[40]。2012年，Stauffer等利用NIH分子文库进行高通量筛选SARS-CoV 3CLpro抑制剂，得到探针化合物36(图11)，在酶水平对SARS-CoV 3CLpro的IC50值为1.5 μmol/L，对SARS-CoV感染的Vero E6细胞抗病毒活性EC50值为12.9 μmol/L。此外，化合物36在中性PBS缓冲溶液溶解性较好(95 μg/ml)[41]。2008年，Mesecar等设计合成一系列5-氯吡啶酯衍生物，用FRET检测抗SARS-CoV 3CLpro的活性。构效关系表明，吲哚环第4位具有5-氯吡啶基酯的抑制剂37(图11)是最有效的抑制剂，在酶水平对SARS-CoV 3CLpro的IC50值为30 nmol/L，在感染SARS-CoV的Vero E6 细胞中测得EC50值为6.9 μmol/L[42]。
图 11 化合物33~37的化学结构
（7）其他类
此外，通过虚拟筛选体外酶活性测试还发现一系列SARS-CoV 3CLpro小分子抑制剂，如血清素拮抗剂38(图12)(IC50= 5 μmol/L)[43]、异染色质衍生物39(图12)(IC50= 0.95 μmol/L)[44]、砜类化合物40(图12)(IC50= 0.3 μmol/L)[45]、卤甲基酮抑制剂41(图12)(Ki= 0.31 μmol/L)[46]、不对称的芳香族二硫醚化合物42(图12)(IC50= 0.516 μmol/L)[47]、非天然的五元环杂环碳环核苷1,2,4-三唑类似物43(图12)对SARS-CoV感染的Vero E6细胞EC50为21 μmol/L[48]。2018年，Denison等发现核苷类似物44(图12)(GS-5734，remdesivir)在体外和SARS-CoV小鼠模型中能有效抑制人和人畜共患的冠状病毒。在感染SARS-CoV的人气道上皮细胞(human airway epithelial cells, HAE)原代培养物中评估44的抗病毒活性，显示44的EC50值为0.069 μmol/L[49]，通过定量逆转录聚合酶链反应发现，随着44剂量的增加，SARS-CoV感染的细胞内病毒基因组和亚基因组RNA数量均呈剂量依赖性减少，与病毒滴度降低一致[50]。
图 12 化合物38~44的化学结构
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2015年，Radtke等设计一系列双柔性核苷类似物并测试其活性，其中，化合物45(图13)在感染MERS-CoV的Vero E6细胞中显示抗病毒活性EC50值为23 μmol/L[51]。2017年，Grünweller等用双重萤光素酶测定法和病毒感染的原代细胞分析化合物46(图13)对病毒翻译的影响，确定感染MERS-CoV的MRC-5细胞的EC50值为1.3 μmol/L；在MERS-CoV感染的人外周血单核原代细胞(PBMC)证实了化合物46的抗病毒活性[52]。2019年，Johnson等基于SPR和FRET技术，从含有30000种化合物的3种不同化合物库(Prestwick, Maybridge，Chembridge)中筛选出化合物47(图13)，对MERS-CoV PLpro酶具有明显抑制活性，IC50值为20.0 μmol/L；为了进一步改善其抑制活性，从352个小片段库得到一个片段48(ZT626+47)，48是由47和ZT626之间形成氢键作用结合在一起(图13)，IC50值为6.6 μmol/L，比47提高了2倍，后续将通过分子对接研究47和ZT626的具体结合模式[53]。
图 13 化合物45~48的化学结构
前面提到的多个SARS-CoV 3CLpro对MERS-CoV也具有明显的抑制活性。例如，2014年De Wilde等对348个药物进行了抗MERS-CoV活性的筛选。研究表明化合物31(氯喹，图10)在体外感染MERS-CoV的Vero E6细胞中测得EC50值为3.0 μmol/L，CC50值为58.1 μmol/L，SI值为19.4[37]。2015年，Simmons等筛选含有2100个化合物的库，发现化合物11(图5)在酶水平上对MERS-CoV 3CLpro的活性最好，IC50值为46.12 μmol/L[20]。2016年，Liang等通过老药新用的方法筛选NA抑制剂对SARS-CoV的作用，发现该类化合物中24在酶水平(图8)对MERS-CoV 3CLpro IC50为12.2 μmol/L[31]。2017年，Kao等对50240种化合物进行筛选MERS-CoV小分子抑制剂，鉴定出化合物32(图10)，其在感染MERS-CoV的FRHK4细胞中测得的EC50值为10.1 μmol/L[38]。2018年，Denison等发现核苷类似物44(图13)(GS-5734，remdesivir)，研究人员选择在人气道上皮细胞(HAE)原代培养物中评估44对MERS-CoV的抗病毒活性，显示44对MERS-CoV的EC50值为0.074 μmol/L[49]。
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在当前SARS-CoV-2疫情下，运用“老药新用，一药多用”策略开展科技攻关研发可治疗COVID-19的药物，可大大缩短药物研发时间，进而可以解决新药研发周期长、难以满足当前疫情控制急需用药的难题。多个药物或候选药物(图14)被发现具有显著的抗SARS-CoV-2病毒效能，包括化合物49(利巴韦林，EC50= 109.50 μmol/L、CC50>400 μmol/L、SI>3.65)，化合物50(喷昔洛韦，EC50= 95.96 μmol/L、CC50>400 μmol/L、SI> 4.17)、化合物51(硝唑尼特，EC50= 2.12 μmol/L、CC50> 35.53 μmol/L、SI> 16.76)、化合物52(萘莫司他，EC50= 22.50 μmol/L、CC50> 100 μmol/L、SI> 4.44)、化合物31(图10)(氯喹，EC50= 2.71 μmol/L、CC50> 211.70 μmol/L、SI> 100.81)、化合物44(图12)(瑞德西韦，GS-5734)、化合物53(法匹拉韦，T-705，EC50= 61.88 μmol/L、CC50> 400 μmol/L、SI> 6.46)、化合物54(羟氯喹，EC50= 4.51 μmol/L、CC50> 249.49 μmol/L、SI> 55.32)等[54-55]。
图 14 化合物49~56的化学结构
Gao等报道了一项多中心临床试验研究氯喹治疗100多例SARS-CoV-2感染的肺炎患者的效果。结果表明，化合物31在抑制肺炎恶化、改善肺部影像及缩短病程方面均优于对照组，且上述患者未见严重的不良反应，且毒性可以接受[56]。
Wang等在体外用非洲绿猴肾Vero E6细胞(ATCC-1586)测试羟氯喹的细胞毒性，结果显示，化合物54在体外可以有效抑制SARS-CoV-2感染，54是一种已知安全有效的抗炎药，预测该药物对COVID-19患者具有良好的抗炎潜力，这种可能性有待临床试验的证实[56]。Patel等2020年5月22日在《柳叶刀》上发表论文指出：COVID-19住院患者单独使用氯喹或羟氯喹或与大环内酯类抗生素联用在治疗新冠肺炎患者时，并未观察到益处；且有可能造成患者生存率降低和室性心律失常的频率增加[57]，世卫组织随即宣布暂停相关临床试验，而该文数据的真实性被广泛质疑且未提供原始数据，该文章已被撤稿。世卫组织宣布重启相关临床实验。
化合物44作用于病毒进入细胞的后期阶段，与核苷类药物的作用机制一致。对感染Vero E6细胞的EC90= 1.76 μmol/L，具有较低不良反应，由同情用药过渡到随机双盲的严格III期临床试验(NCT04257656)，治疗轻、中和重度感染COVID-19患者。报告显示，在针对237名病患的试验中，158人服用了瑞德西韦，另97人没有服用该药，结果服药患者的病死率为13.9%，没服药者的病死率为12.8%。此外，服用瑞德西韦的患者还出现了明显的副作用，病毒数量及症状却没有明显改善。王辰、曹彬团队得出的结论是：未观察到瑞德西韦联合标准疗法与标准疗法相比有统计学意义上显著的临床获益[58]。另外一项是由美国国立卫生研究院领衔的临床研究，从2020年2月21日开始，共招募1063名患者，随机分为试验组和安慰剂组，评价指标为康复时间。研究结果显示，接受瑞德西韦治疗的试验组患者痊愈中位时间为11 d、安慰剂组为15 d，与安慰剂组相比，接受瑞德西韦的试验组患者痊愈时间缩短31%，P<0.001，结果有显著统计学差异。但是，试验组患者病死率为8.0%，安慰剂组为11.6%，P= 0.059，病死率无显著的统计学差异[59]。
Zhou等发现，SARS-CoV-2与SARS-CoV基因组有79.5%的相似性[60]。基于二者序列同源性高，通过与相同受体ACE2(angiotensin converting enzyme 2)结合后进入细胞，且已有文献报道证实[61]，55(洛匹那韦/利托那韦, lopinavir/ritonavir)在SARS的治疗中显示出良好的效果，提示可能对SARS-CoV-2的治疗有效。在重症COVID-19成人住院患者中，与常规治疗相比，未观察到化合物55对治疗有益 (临床试验注册号：ChiCTR2000029308)。试验结果表明，使用洛匹那韦/利托那韦组合与标准护理相比，并没有使严重COVID-19成人患者症状得到显著改善[62]。
化合物56(阿比多尔, arbidol)是一种具有免疫增强的非核苷类广谱抗病毒药物，用于治疗甲、乙型流感病毒等引起的上呼吸道感染。体外细胞实验显示：与药物未处理的对照组相比，阿比多尔在10～30 μmol/L浓度下，有效抑制SARS-CoV-2达60倍，并能显著抑制病毒对细胞的病变效应。目前已注册有盐酸阿比多尔片治疗COVID-19的临床研究(ChiCTR2000029621)。
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到目前为止，冠状病毒没有特效的抗病毒药物或疫苗。新药研发通常需要大量的人力、物力、财力和时间；在当前COVID-19疫情急需药物的情况下，按照常规研发思路开展药物研发，显然“远水解不了近渴”。“老药新用”策略的优势就是可以节约资源和时间,化合物的安全性已经过验证，可直接进入临床药效研究。从战略药物储备角度长远考虑，我们还可以利用计算机辅助药物设计技术开展药物设计及化合物库筛选，发现新骨架、结构多样的苗头化合物，进而通过构效关系研究、结构优化及成药性评价，发现先导化合物、候选药物及临床有效药物，可丰富抗病毒药物的“储备库”。
Research progress on small molecule inhibitors of coronaviruses
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摘要: 冠状病毒感染严重威胁着人类健康，目前尚无特异性治疗药物或疫苗。近年来，针对SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2这3种高致病性冠状病毒的配体S蛋白、RdRp、PLpro和3CLpro等靶点，国内外研究者已经开发了多种小分子抑制剂。综述这些冠状病毒的特点、作用靶点、小分子抑制剂及其构效关系。
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关键词:
- 冠状病毒 /
- 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒 /
- 中东呼吸综合征冠状病毒 /
- 新型冠状病毒 /
- 靶点 /
- 抑制剂
Abstract: Coronavirus infection seriously threatens human health. There is no specific medication or vaccine so far. In recent years, domestic and foreign researchers have developed a variety of small-molecule inhibitors against the ligand S protein, RdRp, PLpro and 3CLpro of three highly pathogenic coronavirus, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2. This article reviews the characteristics of these coronaviruses, action targets, small molecule inhibitors, and structure-activity relationships.-
Key words:
- coronavirus /
- SARS-CoV /
- MERS-CoV /
- SARS-CoV-2 /
- targets /
- inhibitors
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1. 电离辐射的危害
随着全球经济的高速发展和科技的不断进步，核工业在军事、医疗等领域得到全面发展，但伴随而来的是对从业人员和附近居民造成严重的辐射危害。
辐射是指能量以电磁波或粒子的形式向外传播的现象，可分为电离辐射和非电离辐射。拥有足够高能量而使原子电离的辐射为电离辐射，它包括X射线、α射线、β射线、γ射线等，具有潜在的致癌性。非电离辐射能量较低，不会电离物质而会使物质内粒子运动，包括红外线、紫外线和微波等[1]。
辐射可引起全身性的放射病，几乎所有系统、器官均可发生病理性改变，其中以神经系统、消化系统和造血器官的改变最为明显，会诱发心血管疾病、糖尿病甚至癌突变。辐射对机体的损伤可分为急性和慢性放射性损伤。短时间内接受高剂量的照射，可引起机体的急性损伤，常见于核事故和放射治疗患者。剂量低于1 Gy时少数会出现轻微症状，剂量在1~10 Gy时，会出现造血型急性放射病；剂量超过10 Gy，会出现高致死率[2]。而长期接受超剂量的全身或局部照射，可引起慢性放射病，如皮肤损伤、造血障碍、白细胞减少、生育功能受损等。此外，辐射还能直接导致视力下降、视网膜脱落，诱发孕妇流产、不育、畸胎、儿童发育不足等[3]。
2 抗辐射天然产物的作用机制[4]
抗辐射药物是指在辐射前或后给予药物预防或治疗，可减轻或修复辐射损伤的药物。现有的抗辐射化学合成药物主要包括细胞因子、含硫化合物和激素类药物[5]，因其毒副作用较大而应用受限，近年来天然产物因其毒副作用小、多成分多靶点的独特优势受到广泛的关注。目前认为抗辐射天然产物的作用机制主要有以下4个方面。
2.1 防护DNA损伤
辐射损伤可破坏DNA分子的结构与功能，导致DNA碱基破坏、DNA分子间交联、DNA双链或单链断裂、糖基破坏等。此外，辐射还可导致细胞周期改变以及DNA合成抑制，直接影响细胞增殖。抗辐射天然产物可通过减轻或抑制辐射致细胞周期的缩短，避免或修复DNA损伤而起辐射防护作用。
2.2 清除自由基
人体产生的80%自由基是由水分子组成的。辐射可引起水分子生成强活性的氧化自由基，主要包括·OH、
${\rm{O}}^-_2 $ 、H2O2、·NO等，其中，·OH氧化性最强，可导致组织细胞产生脂质过氧化物[6]。人体由于自由基的产生造成的破坏主要有3个方面：破坏细胞膜；使血清抗蛋白酶失去活性；损伤基因导致细胞变异，如自由基和生物大分子的结合，导致DNA主链断裂或碱基破坏，通过氧化性降解使得多糖链断裂，形成脱氢自由基，破坏细胞膜上的多糖结构[7]。现代研究表明，大多数抗辐射天然产物具有清除多种自由基作用，能降低氧化酶活性，抑制细胞过氧化物的产生。2.3 保护免疫系统
辐射主要损伤骨髓、胸腺和脾脏等免疫器官以及淋巴细胞等。崔玉芳等[8]发现辐射对免疫系统的损伤主要表现为两个特点——早期损伤严重和后期恢复缓慢。在辐射早期脾脏T、B淋巴细胞数量迅速减少，丝裂原反应明显降低，而在受照射1年后，小鼠的免疫组织和外周血淋巴细胞凋亡率与正常水平相比仍较高，小鼠T淋巴细胞免疫功能仍未恢复。促进淋巴细胞增殖，抑制胸腺和脾脏细胞凋亡等是抗辐射损伤的有效途径。
2.4 保护造血系统
造血组织是辐射的敏感组织，机体受到辐射后，造血细胞会出现功能低下甚至死亡现象，其中，造血干细胞、粒系祖细胞、红系祖细胞是辐射攻击的主要靶细胞，外周血细胞的数量随着照射剂量的增加而减少，其形态和功能也会随之发生改变[1]。因此，改善造血微环境，促进白细胞增殖，修复骨髓造血功能等有助于保护造血系统，修复辐射损伤。
3. 抗辐射天然产物
3.1 多糖类化合物
天然多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。它们是一类具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗炎、抗疲劳、抗衰老作用的生物大分子[9]。关于多糖的抗辐射作用的机制尚不清楚，一般认为与多糖的抗氧化，对造血系统的保护，引起免疫系统的效应增强以及诱导产生某些细胞因子等作用有关。
3.1.1 植物多糖
研究表明，大多数植物多糖有较为显著的抗辐射作用，能提高辐射诱导损伤的防护能力，改善辐射诱导的氧化损伤。其辅助保护辐射损伤的作用机制复杂，一般推测与其修复DNA损伤、消除自由基、增强免疫功能等有关[10]。张乃珣等[11]研究发现，酸性黑木耳多糖(AAP)和红松球果多酚的联合使用可以有效地清除体内自由基，降低自由基对体内DNA造成的损伤，显著提高对60Co γ射线诱导氧化损伤的防护能力。此外，白海娜等[12]发现原花青素与黑木耳多糖（AAP-4）同样有协同防护辐射诱导氧化损伤的作用。徐俊杰等[13]研究山药多糖对低强度连续微波辐射致小鼠免疫系统功能损伤的保护作用，发现正常动物组与辐射损伤组相比，不同剂量(200、400、800 mg/kg)的山药多糖可提高巨噬细胞的吞噬指数、T淋巴细胞的增殖刺激指数和血清IgG水平，并降低血清IL-4水平。表明山药多糖能明显改善低强度连续微波辐射对小鼠免疫系统的损害。胡淼等[14]报道，预先给药黑大蒜多糖（150~600 mg/kg）可减轻X射线辐射对小鼠免疫器官和全血白细胞、血小板的影响，提高脾脏的代偿性造血增殖能力，提高抗氧化酶水平，具有较好的辐射防护作用。Zhang等[15]发现大黄多糖(RTP)通过调控Nrf2及其下游蛋白HO-1，显著降低细胞凋亡和炎症因子，从而显著改善辐射诱导的肠道损伤。
3.1.2 动物多糖
国内外学者从动物体内提取出不同种类的多糖，尤其是海洋动物，如虾蟹动物的甲壳质、河蚌多糖、鲍鱼多糖等，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗辐射等生物活性[16]。
3.1.3 微生物多糖
研究发现微生物中，尤其生活在高压、高辐射环境中的藻类，其多糖有着较为特殊的结构与生理特性，大多有较好的抗辐射效果。Kim等[17]在探讨低分子量岩藻多糖（LMF）对中波紫外线诱导的光老化的保护作用时发现，持续15周的中高剂量（2.0、1.0 mg/cm2）LMF治疗可对受到中波紫外线照射的小鼠光老化起到明显的保护作用，可抑制皱纹形成，皮肤水肿以及中性粒细胞在光老化病灶上的聚集。杨凯业等[18]报道称铁皮石斛多糖、褐藻多糖、灵芝多糖、竹荪多糖在50 mg/L的质量浓度下的复合作用可抑制紫外线辐射诱导的皮肤细胞光老化作用。
3.2 多酚类化合物
植物多酚是广泛存在于植物体内的一类次生代谢产物，包括黄酮类、花色苷类和酚酸类。研究表明，多酚类化合物含有多个酚羟基，具有显著的清除自由基能力，能减轻自由基对机体的伤害，从而起到辐射防护作用[19]。
Lekmine[20]等评价用阿尔及利亚南部特有植物Astragalus gombiformis Pomel地上部分制备的丁醇提取物的药理活性，采用防晒系数(SPF)等评价Astragalus gombiformis Pomel的光保护作用和抗氧化能力，结果表明提取物（SPF=37.78±0.85，SPF值>30的皮肤保护产品被认为是有效的紫外线辐射过滤器）具有良好的紫外线吸收能力，推测主要与其中的黄酮类和酚酸类化合物（主要为水飞蓟素、迷迭香酸、槲皮苷和山柰酚）的紫外吸收能力和抗氧化防御能力有关，具有潜在的辐射防护能力。
3.2.1 黄酮类化合物
黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物是一类从中草药中提取的天然产物，被认为是一种有效的抗氧化剂，可以调控炎症介质的调节酶或转录因子，通过与DNA的相互作用影响氧化应激，增强基因组稳定，具有神经保护和辐射保护作用[21]。
金银花素(5,7-二羟基黄酮)是从蜂胶、蜂蜜和几种植物中提取的一种黄酮类化合物。Mansour等[22]发现给药金银花素(50 mg/kg）可提高受5 Gy红外线照射雄性Wister大鼠大脑中丙二醛(MDA)水平和半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性，这提示金银花素具有辐射致脑损伤的神经保护作用。Kale等[23]通过组织病理评估，显示槲皮素可显著减少辐射诱导的神经元变性和炎症浸润，揭示了槲皮素对辐射致脑损伤的神经保护作用。
Li等[24]证实芹菜素（4′,5,7-三羟基黄酮）能够一定程度上修复UVB诱导的人表皮角质形成细胞(HEKs)的毛细血管扩张性共济失调的异常突变，从而抑制HEKs细胞凋亡和坏死，表明芹菜素对中波紫外线损伤的HEKs具有新型的保护作用。Prasad等[25]报道水飞蓟宾（silibinin）可以防止中波紫外线诱导的胸腺嘧啶二聚体的形成，通过增加抑癌基因p53水平进而促进DNA修复和（或）启动受损细胞的凋亡。
曲克芦丁（TRX）是一种黄酮类化合物，广泛存在于茶叶、咖啡、谷类食品、各种水果和蔬菜中，具有抗辐射作用，Panat[26]对其清除自由基的能力和抗细胞凋亡活性进行了系统的研究。TRX能清除超氧物、NO和其他模型稳定的自由基，从而保护受辐照的细胞。
有些英国科学家研究发现，每天喝两杯绿茶、吃一个橘子，就可以帮助“电脑族”们抵御计算机辐射[27]。而儿茶素类化合物作为茶叶中的主要功能成分，具有显著的抗辐射作用。茶树中儿茶素类化合物主要包括，儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯及表没食子儿茶素没食子酸酯8种单体。其中，表没食子儿茶素没食子酸酯生理活性较为突出，具有抗氧化性和抗细胞凋亡活性，可预防不同刺激对组织的损伤。Korystova等[28]研究发现在对辐射诱导的大鼠主动脉损伤的预防作用中，发现红茶比绿茶更加有效，即使浓度低于1 g/100 ml的红茶也能够有效预防红外线对主动脉造成的损伤。红茶中的儿茶素含量明显低于绿茶，但两种茶中的黄酮醇含量几乎相等。儿茶素、表没食子儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯可增加大鼠主动脉的氧化应激，而黄酮醇可降低辐射诱导的氧化应激。因此，红茶药效的提高是由于儿茶素含量的降低使黄酮醇的正向调节作用更大程度地得到发挥所致。
3.2.2 酚酸类化合物
酚酸类化合物系指具有多羟基的芳香羧酸类化合物，主要以糖、酯以及有机酸的形式存在于植物中，现代研究表明酚酸类化合物能够清除体内多种自由基，具有良好的抗氧化活性和潜在的辐射防护作用。
Milton等[29]报道，鱼腥草细胞培养物的甲醇提取物因细胞产生酚类次生代谢物而具有潜在的光保护作用，结果显示鱼腥草细胞的甲醇提取物(310～2500 g/ml)能够显著提高受紫外线照射的3T3-Swiss白化成纤维细胞活力。提取物的LC-MS化学分析表明，其总酚和总酚酸含量（主要为没食子酸和毛蕊花苷）较高，具有特征的紫外吸收峰(第一和第二波段的峰值分别为294和330 nm)，能够抵消紫外线对皮肤的有害影响。
Abozaid等[30]报道肉桂酸纳米颗粒可作为一种辐射诱导胰腺炎的氧化还原信号通路的调节剂，首先用I-精氨酸和γ射线诱导大鼠患急性胰腺炎，口服肉桂酸纳米颗粒(CA-NPs)后，急性胰腺炎的严重程度及血清淀粉酶和脂肪酶水平均降低。同时，胰腺组织的MDA水平显著降低，谷胱甘肽的消耗显著恢复，caspase-3水平降低，可明显改善胰腺组织损伤或凋亡。因此，肉桂酸纳米颗粒对辐射诱导的急性胰腺炎具有较好的治疗潜力。Liu等[31]研究发现姜黄素（Cur）对长波紫外线辐射诱导的人皮肤成纤维细胞（HDFs）光老化具有一定的保护作用。Zhang等[32]发现白藜芦醇通过激活Sirtuin1 (Sirt1，组蛋白去乙酰化酶家族成员之一，可减轻炎症损伤)减轻辐射诱导的小鼠肠道损伤。周瑞芳等[33]研究表明，丹酚酸B可减轻γ射线辐射诱导的造血系统损伤和骨髓细胞的DNA及蛋白质的减少，恢复小鼠免疫系统的辐射损伤，具有显著的抗γ射线辐射作用。
3.2.3 花色苷
花色苷是花青素和糖以糖苷键结合而成的一种化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，起到保护植物抗氧化的作用。其抗氧化和消除自由基能力可防护不同射线辐射，能够发挥独特的生理效应。
Fernandes等[34]发现花色苷家族成员（矢车菊色苷、锦葵色苷及其衍生色素）具有促进皮肤维持健康的活性，研究表明大部分化合物能够抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌菌株的生长繁殖，减少HEKs和HDF活性氧的产生，抑制皮肤降解酶的活性且无细胞毒性作用，具有一定的紫外线过滤作用。
Targhi等[35]研究黑桑花色苷对大鼠肝组织和骨髓细胞的辐射防护作用，以 60Co γ射线远距放射（3 Gy和6 Gy）建立大鼠辐射损伤模型，随后腹腔注射200 mg/kg的黑桑花色苷，结果显示黑桑花色苷可降低大鼠肝脏MDA和SOD的水平，降低γ射线照射对大鼠骨髓细胞和肝脏的遗传毒性和细胞毒性，有潜在的辐射保护作用。
3.3 皂苷类化合物
皂苷（saponin）类化合物是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，存在于人参、桔梗、刺五加等许多中草药中，在增强免疫、抗肿瘤、抗炎等方面具有显著的生物活性。研究表明人参皂苷的抗辐射机制与清除自由基、抗氧化活性，与其对心血管系统、免疫系统的保护作用以及对细胞凋亡的抑制作用有关[36]。
Wen[37]等研究黄芪甲苷对中波紫外线诱导的大鼠真皮成纤维细胞早衰的抗光老化作用，结果显示黄芪甲苷不仅能通过激活细胞外调解蛋白激酶ERK和丝裂原活化蛋白激酶p38信号抑制中波紫外线诱导的胶原-I的降解，还通过激活细胞自噬增加胶原-I的积累，从而保护中波紫外线诱导的光老化细胞，表明黄芪甲苷在抗光老化治疗中的潜在优势。
Wang等[38]分析柴胡皂苷-d (SSd)对肝癌细胞自噬活性和放射敏感性的影响，SSd通过抑制mTOR磷酸化促进肝癌细胞自噬，增加辐射诱导的肝癌细胞凋亡并且抑制肝癌细胞的增殖，为肝癌的放射增敏治疗提供了一种可能的途径。
Kim等[39]研究知母皂苷A-III（TA-III）对中波紫外线诱导的HEKs和HDF侵袭效应的保护作用时发现，TA-III在非细胞毒性剂量下（50 nmol/L）以剂量依赖的方式抑制中波紫外线诱导的环氧合酶-2（COX-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）转录和蛋白表达水平，降低中波紫外线诱导的原代皮肤细胞的侵袭，组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和COX-2在HEKs中的过度表达，表明其具有光保护剂的开发潜力。
3.4 其他
除了上述多糖类、多酚类以及皂苷类化合物，天然产物中的许多其他化合物同样具有良好的辐射防护作用，包括维生素类、蛋白类、无机成分、稀有元素等。
Rostami等[40]研究发现预先摄入硒和维生素E能够对X射线辐射引起的遗传损害起到一定的防护作用。段一凡等[41]报道茶叶籽不饱和脂肪酸对中波紫外线诱导的HEKs损伤具有保护作用。Jaisin等[42]研究发现胡椒碱（10～40 µmol/L）预处理可抑制中波紫外线诱导的炎症信号通路，减弱HEKs的细胞毒性并且抑制其凋亡。这提示胡椒碱的抗炎作用能保护HEKs免受中波紫外线辐射的损伤，可作为一种紫外线辐射诱导皮肤炎症的有效治疗手段。
4. 结语
近年来，国内外越来越重视辐射损伤的防护，抗辐射药物的寻找也变得十分紧迫。而与传统的化学合成药物相比，天然来源的药物具有活性高、选择性强、毒副作用小等优点，作为抗辐射药物有着广阔的开发前景。但是抗辐射天然产物的筛选方法耗时耗力，因此建立高通量、高专属性的抗辐射天然产物筛选方法意义重大。此外，对已有的天然产物进行结构改造，以期获得抗辐射活性更高或毒副作用更小的衍生物以及提高抗辐射天然产物的提取纯化效率等皆是未来抗辐射天然产物研究的重点和难点。
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