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七叶皂苷钠（sodium aescinate）是一种含酯键三萜皂苷的钠盐，呈白色或类白色结晶粉末，味苦而辛，提取自七叶树植物天师栗（Aesculus wilsonii Rehd.）的干燥成熟种子，主要有效成分为七叶皂苷A、B、C和D[1]（见图1和表1），具有消炎、抗渗出、增加静脉张力、改善血液循环以及纠正脑功能失常等作用[2]。七叶皂苷钠在药物类别上按化学类药品管理，制剂主要包括注射用七叶皂苷钠、七叶皂苷钠片、复方七叶皂苷钠凝胶和七叶皂苷钠搽剂。注射用七叶皂苷钠及原料药的质量标准收载于《国家药品西药标准（化学药品地标升国标第十六册）》[3]；复方七叶皂苷钠凝胶和七叶皂苷钠搽剂的质量标准为新药转正标准；七叶皂苷钠片质量标准执行国家食品药品监督管理局标准。
图 1 七叶皂苷钠的化学结构式(分子式：C55H85NaO24)
表 1 七叶皂苷钠化学式中的取代基结构
名 称 R1 R2 R3 R4 七叶皂苷钠A（β） —CH3 —H —COCH3 —H 七叶皂苷钠B（β） —H —CH3 —COCH3 —H 七叶皂苷钠C（α） —CH3 —H —H —COCH3 七叶皂苷钠D（α） —H —CH3 —H —COCH3 目前，七叶皂苷钠的测定方法主要有HPLC法、紫外分光光度法、薄层色谱法和酸碱滴定法[4]。其中，国家药品标准中规定的含量测定方法为酸碱滴定法，该法需要4 h以上的加热回流时间，且前处理过程复杂，而操作较简便的紫外分光光度法及薄层色谱法灵敏性和选择性又相对较差。因此，建立一种操作简便、选择性好的七叶皂苷钠快检方法，对于该药物的质量安全监管具有重要意义。近红外光谱分析法（near infrared spectrum，NIRS）是一种间接分析技术，通过建立目标物属性值与近红外光谱数据之间的关联模型，对待测样品进行定性或定量检测[5-6]。所建模型的质量常用决定系数（R2）和交叉验证均方根误差（RMSECV）等参数进行评价，R2值越接近1，说明样品测定值与预测值相关性越好；RMSECV则决定了预测样品的误差大小，应与实验室标准方法的精密度相当。与传统分析技术相比，具有分析速度快、成本低、效率高、重现性好等优点，可用于药品的在线无损分析[7-8]。
本文利用近红外光谱分析技术，建立了一种七叶皂苷钠的快检方法，用于注射用七叶皂苷钠药品的含量测定。本方法根据OPUS软件对采集光谱进行了优化处理，分别采用PLS算法和因子化算法，建立七叶皂苷钠的定量模型和定性模型。
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试验使用A药厂43批次注射用七叶皂苷钠样品；B药厂4批次注射用盐酸乌拉地尔样品；C药厂4批次注射用胸腺五肽样品；D药厂4批次注射用七叶皂苷钠样品；试验用试剂均为分析纯，购自国药集团。
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试验采用德国Bruker公司的MPA近红外光谱仪，装载OPUS软件；上海喆图公司的电热恒温水浴锅。
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取本品30支（10 mg取15支），加乙醇-水（10∶1）溶解，定量转移至25 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取10 ml至100 ml三角瓶中。加酚酞指示液2滴，用氢氧化钠溶液（0.01 mol/L）滴定至溶液显微红色后，精密加氢氧化钠滴定液（0.05 mol/L）5 ml，加热回流4 h，用乙醇-水（10∶1）2 ml洗涤冷凝管及瓶口，取出，放冷至室温，用盐酸滴定液（0.01 mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白实验校正。每1 ml的氢氧化钠滴定液（0.05 mol/L）相当于28.80 mg的七叶皂苷钠。
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近红外光谱检测采用光纤扫描方法，分辨率为8 cm−1，样品扫描时间为16 s，背景扫描时间为32 s，扫描范围为12500 cm−1~4000 cm−1。将光纤探头对准被测样品西林瓶底部（样品应均匀分布在西林瓶底部，保证探头扫面处样品均匀），测定3次，计算平均光谱。
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B药厂4批次注射用盐酸乌拉地尔的4张光谱；C药厂4批次注射用胸腺五肽的4张光谱；D药厂4批次注射用七叶皂苷钠的4张光谱。
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采集上述样品的近红外光谱，经一阶导数和矢量归一化法处理，平滑点数为9，采用因子化法，设定谱段为9037.3 cm−1。
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用胸腺五肽定性模型，鉴定B药厂注射用盐酸乌拉地尔、C药厂注射用胸腺五肽和D药厂注射用七叶皂苷钠样品，结果如表2。结果表明，该定性模型可准确区分未参与建模的3个品种样品，可用于A药厂生产的注射用七叶皂苷钠定性检测。
表 2 定性模型鉴定结果
样品名称 鉴定结果 鉴定结论 匹配数 匹配值 阈值 组名称 注射用乌拉地尔 1 0.01265 0.02330 注射用乌拉地尔 样品为注射用乌拉地尔 2 0.68066 0.01932 注射用七叶皂苷钠 3 1.23027 0.01235 注射用胸腺五肽 注射用胸腺五肽 1 0.00701 0.01235 注射用胸腺五肽 样品为注射用胸腺五肽 2 0.55662 0.01932 注射用七叶皂苷钠 3 1.24993 0.02330 注射用乌拉地尔 注射用七叶皂苷钠 1 0.00879 0.01932 注射用七叶皂苷钠 样品为注射用七叶皂苷钠 2 0.55840 0.01235 注射用胸腺五肽 3 0.68452 0.02330 注射用乌拉地尔 -
共采用A药厂的43批次注射用七叶皂苷钠样品。其中，38批次样品用于建立定量模型，5批样品用于模型验证。
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采集样品的近红外光谱，求出平均光谱，根据OPUS7.8软件提供的优化结果，选择一阶导数和矢量归一化，以消除样品的基线偏移，降低背景及噪声干扰，提高信噪比，增强光谱特征。采用PLS算法，利用软件的预处理选择合适的谱段建模，得到注射用七叶皂苷钠含量测定校正模型，最后采用内部交叉算法，对模型进行验证。
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注射用七叶皂苷钠定量模型的近红外光谱图详见图2，内部验证的校正曲线见图3，RMSECV/维数见图4，R2/维数走势见图5。结果显示，注射用七叶皂苷钠定量模型R2值达到0.9926，RMSECV为0.253。在预测试验中，样品的预测值与酸碱滴定法测定值偏差均小于5%（详见表3），表明该模型能够准确预测七叶皂苷钠的含量。
图 2 注射用七叶皂苷钠定量模型近红外光谱图
图 3 注射用七叶皂苷钠定量模型校正曲线
表 3 内部交叉验证法预测值与测定值的结果
样品编号 酸碱滴定法测定值(%) 预测值(%) 偏差(%) 样品编号 酸碱滴定法测定值(%) 预测值(%) 偏差(%) 1 93.2 95.4 2.2 20 95.8 95.9 0.1 2 95.8 96.8 1.0 21 97.6 96.6 −1 3 97.9 96.6 −1.3 22 97.5 98.4 0.9 4 96.2 96.1 −0.1 23 97.1 96.6 −0.5 5 96.9 95.8 −1.1 24 96.4 96.5 0.1 6 96.4 96.8 0.4 25 96.9 96.7 −0.2 7 95.9 96.2 0.3 26 97.3 97.0 −0.3 8 96.8 96.7 −0.1 27 96.7 97.0 0.3 9 97.1 97.3 0.2 28 97.2 97.1 −0.1 10 96.6 96.7 0.1 29 96.9 97.2 0.3 11 96.6 96.4 −0.2 30 94.4 94.5 0.1 12 97.1 97.3 0.2 31 96.5 96.2 −0.3 13 95.9 95.9 0 32 96.8 96.9 0.1 14 97.1 97.5 0.4 33 97.9 97.0 −0.9 15 96.8 96.8 0 34 97.5 96.8 −0.7 16 95.7 96.4 0.7 35 90.8 95.2 4.4 17 96.3 96.0 −0.3 36 90.1 95.0 4.9 18 96.4 96.4 0 37 96.1 96.5 0.4 19 97.5 96.6 −0.9 38 98.0 96.7 −1.3 
图 4 交叉验证均方根误差/维数
图 5 R2/维数走势
利用已建立的定量模型，对未参与建模的5批次样品进行外部交叉验证，并将结果转化为标示量百分比后与测定值比较，偏差均小于1.5%（详见表4），表明预测值和参考值相关性良好，所建定量模型稳定可靠，可用于样品中七叶皂苷钠含量的快速检测。
表 4 定量模型外部交叉验证结果
样品编号 酸碱滴定法测定值(%) 预测值(%) 偏差(%) 39 95.9 96.7 0.7 40 96.8 97.5 0.7 41 96.2 97.4 1.2 42 97.6 98.0 0.4 43 96.6 97.3 0.7 -
近红外定性分析主要用于物质的判别和归类，扫描收集系列样品的近红外光谱，可组成一个多维变量空间，同类物质在该空间内处于相近位置，以此完成建模。通过调用相应模型数据，与待测样品近红外光谱进行比较评估，即可判定待测样品类别。本试验采集图谱，经一阶导数和矢量归一化（SUV）处理，可有效消除样品的基线偏移，降低背景及噪声干扰，提高信噪比，增强光谱特征；建立的注射用七叶皂苷钠定量模型，可准确预测目标成分含量，为药品快检筛查提供数据参考；定性模型，可有效区分未参与建模的其他品种样品，可用于同厂家注射用七叶皂苷钠的定性检测。与七叶皂苷钠的其他含量测定方法相比，本研究建立近红外光谱分析法模型专属性较好，具有高效、无损、操作简单、结果准确等特点，能满足在药品质量安全监管工作中，开展批量样品现场快检的要求。在对不同厂家的注射用七叶皂苷钠进行的含量预测时发现，因不同厂家样品使用的辅料、西林瓶、填装样品厚度均存在较大差异，致使不同厂家预测结果与实际测量值偏差较大，预测值与容量分析法含量测定结果偏差可达47.0%。因此，本实验所建定量模型仅适用于同厂家样品含量预测，在实际应用中，可针对不同厂家建立系列定量模型，用于该药品的快速鉴定检测。
Application of near infrared spectroscopy analysis method in rapid detection of sodium aescinate
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摘要:
目的 利用近红外光谱分析技术建立一种七叶皂苷钠的快检方法，用于注射用七叶皂苷钠药品的含量测定。 方法 应用OPUS软件对采集光谱进行优化处理，分别采用PLS算法和因子化算法，建立定量模型和定性模型。 结果 定量模型相关系数达到0.9926，交叉验证均方根误差为0.253，在预测试验中，样品的预测值与真实测定值偏差均小于5%，能够准确预测七叶皂苷钠的含量。 结论 本研究建立的定性模型可有效区分未参与建模的其他品种样品，为该药品的快检筛查提供参考。 Abstract:Objective To establish a fast detection method of sodium aescinate by using near infrared (NIR) spectroscopy analysis method for the determination of the content of sodium aescinate for injection. Methods OPUS software was used to optimize the collected spectrum. PLS algorithm and factorization algorithm were used to establish quantitative model and qualitative model. Results The correlation coefficient of the quantitative model reached 0.9926, the RMSECV deviation was 0.253. The deviation between the predicted value of the sample and the true measured value was less than 5%, which could accurately predict the content of sodium aescinate. Conclution The qualitative model can effectively distinguish the samples of other varieties that have not participated in the modeling, and provide a reference for the rapid screening of the drug. -
Key words:
- sodium aescinate /
- near-infrared /
- quantitative model /
- qualitative model
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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表 1 七叶皂苷钠化学式中的取代基结构
名 称 R1 R2 R3 R4 七叶皂苷钠A（β） —CH3 —H —COCH3 —H 七叶皂苷钠B（β） —H —CH3 —COCH3 —H 七叶皂苷钠C（α） —CH3 —H —H —COCH3 七叶皂苷钠D（α） —H —CH3 —H —COCH3 
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表 2 定性模型鉴定结果
样品名称 鉴定结果 鉴定结论 匹配数 匹配值 阈值 组名称 注射用乌拉地尔 1 0.01265 0.02330 注射用乌拉地尔 样品为注射用乌拉地尔 2 0.68066 0.01932 注射用七叶皂苷钠 3 1.23027 0.01235 注射用胸腺五肽 注射用胸腺五肽 1 0.00701 0.01235 注射用胸腺五肽 样品为注射用胸腺五肽 2 0.55662 0.01932 注射用七叶皂苷钠 3 1.24993 0.02330 注射用乌拉地尔 注射用七叶皂苷钠 1 0.00879 0.01932 注射用七叶皂苷钠 样品为注射用七叶皂苷钠 2 0.55840 0.01235 注射用胸腺五肽 3 0.68452 0.02330 注射用乌拉地尔
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表 3 内部交叉验证法预测值与测定值的结果
样品编号 酸碱滴定法测定值(%) 预测值(%) 偏差(%) 样品编号 酸碱滴定法测定值(%) 预测值(%) 偏差(%) 1 93.2 95.4 2.2 20 95.8 95.9 0.1 2 95.8 96.8 1.0 21 97.6 96.6 −1 3 97.9 96.6 −1.3 22 97.5 98.4 0.9 4 96.2 96.1 −0.1 23 97.1 96.6 −0.5 5 96.9 95.8 −1.1 24 96.4 96.5 0.1 6 96.4 96.8 0.4 25 96.9 96.7 −0.2 7 95.9 96.2 0.3 26 97.3 97.0 −0.3 8 96.8 96.7 −0.1 27 96.7 97.0 0.3 9 97.1 97.3 0.2 28 97.2 97.1 −0.1 10 96.6 96.7 0.1 29 96.9 97.2 0.3 11 96.6 96.4 −0.2 30 94.4 94.5 0.1 12 97.1 97.3 0.2 31 96.5 96.2 −0.3 13 95.9 95.9 0 32 96.8 96.9 0.1 14 97.1 97.5 0.4 33 97.9 97.0 −0.9 15 96.8 96.8 0 34 97.5 96.8 −0.7 16 95.7 96.4 0.7 35 90.8 95.2 4.4 17 96.3 96.0 −0.3 36 90.1 95.0 4.9 18 96.4 96.4 0 37 96.1 96.5 0.4 19 97.5 96.6 −0.9 38 98.0 96.7 −1.3
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表 4 定量模型外部交叉验证结果
样品编号 酸碱滴定法测定值(%) 预测值(%) 偏差(%) 39 95.9 96.7 0.7 40 96.8 97.5 0.7 41 96.2 97.4 1.2 42 97.6 98.0 0.4 43 96.6 97.3 0.7
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