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脂质体是包封药物纳米载体的理想选择[1]，它可以提高被包载物质溶解度，增强物质的稳定性，减少外周不良反应发生，且自身无毒。在肿瘤疾病治疗中，依赖高渗透长滞留(EPR)效应的假设，基于病变区域的组织结构、生理功能和正常组织间的差异，脂质体可使药物输送至肿瘤组织富集，更好地发挥治疗作用[2]。但是，基于EPR效应的纳米制剂在实体瘤内转运的靶向效率仍面临很多质疑[3]，所有纳米颗粒(包括脂质体在内)仅有0.7％(中位数)的注射剂量被递送至实体瘤，面临脱颗粒困难、药物释放缓慢等问题[4]。因此在脂质体载体的研究中，针对内源性刺激因素pH[5]、氧化还原反应[6]和酶等[7]，外源性刺激因素温度变化[8]、磁场[9]、光等[10]，研究者开发出基于刺激响应以及具有主动运输功能的靶向脂质体，以期在目标部位高效、可控地释放运载药物，提高脂质体的靶向性并增强细胞毒性[11]。
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活性氧自由基(ROS)包括自由基、离子或分子，因在它们的最外层电子中具有单个未配对的电子，所以ROS具有很高的反应活性[12]。ROS的形式有：①游离氧自由基：超氧化物(O 2·–)，羟基自由基(·OH)，一氧化氮(NO·)，有机自由基(R·)，过氧自由基(ROO·)，烷氧基自由基(RO·)，噻吩基自由基( RS·)，磺酰基(ROS·)，巯基过氧自由基(RSOO·)和二硫化物(RSSR)；②非自由基ROS：过氧化氢(H2O2)，单态氧(1O2)，臭氧/三氧(O3)，有机氢过氧化物(ROOH)，次氯酸盐(HOCl)等。内源性ROS主要来自于线粒体有氧呼吸中的电子传递链和黄嘌呤氧化酶、脂氧合酶、细胞色素P450、NADP氧化酶等[13]。
一方面，ROS通过直接与蛋白质、转录因子和基因反应并修饰其结构来调节其功能，从而调节许多信号转导途径。同时ROS还参与信号细胞的生长和分化，调节酶(如核糖核苷酸还原酶)的活性，通过刺激细胞因子的产生来介导炎症反应，并消除病原体和异物。另一方面，ROS与生物分子(包括DNA，蛋白质和脂质)具有高度反应性，可能导致这些生物分子的氧化修饰并改变功能。 ROS水平的轻度升高可能会导致细胞瞬时改变，而细胞中ROS的严重升高则可能导致不可逆的氧化损伤，从而导致细胞死亡[7]。ROS具有广泛的致病作用，癌症、心血管疾病和神经系统疾病均显示出ROS参与的有力证据[14]。针对肿瘤的化学治疗、放射治疗大多是通过促进ROS的产生及聚集，进而对肿瘤细胞产生杀伤作用[15]。而肿瘤组织为了规避过度氧化应激对自身造成伤害，会“战略性”地调整多种抗氧化酶并广泛利用代谢途径提供的抗氧化分子(如GSH和NADPH)来中和并清除ROS[16]。
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有研究显示，癌细胞的ROS浓度(100 μmol/L)大约比正常细胞(20 nmol/L)高2个数量级[17]。ROS响应型脂质体是基于ROS 在肿瘤微环境中高表达的特点而制备。研究者通过化学合成方法在磷脂上键合硫醚[19]、硼酸酯类[20]、二茂铁[21]等特殊结构对磷脂进行修饰，当制备的脂质体到达肿瘤部位后，在ROS的氧化作用下其脂质膜结构发生变化，实现包载药物的释放。此外，也可在脂质体处方中直接加入适量含不饱和碳碳键的磷脂[10，24-25]，如L-α- 卵磷脂 (Egg PC)、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:2 (Cis) PC)等，不饱和碳碳键可与ROS发生反应引发脂质膜结构的改变，达到释放药物的目的。
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与其他ROS响应型化学结构相比，硫醚显得最简单有效，且具有更高的应用潜力。在ROS氧化作用下，硫醚结构将转变成亚砜和其他砜类[18]。Du等[19]通过化学合成方法开发出新型的硫醚磷脂酰胆碱(S-Pcs)，再与DSPE-PEG2000和胆固醇混合，制备出ROS响应型隐形脂质体(S-LPs)。采用硫酸铵梯度法将模型药物阿霉素(DOX)包入脂质体，得到载药脂质体(DOX/S-LPs)。在考察ROS敏感性和DOX响应释放时，S-LPs表现出很好的ROS敏感性反应。当H2O2浓度在1～10 mmol/L范围内，包封DOX能够得到有效释放。在细胞毒性和体外抗肿瘤作用研究中，空白脂质体未表现出对L929细胞的毒性；以MCF-7和A549为靶细胞，DOX/S-LPs表现出比DOX/LPs更显著的抗癌效果。再以荷瘤4T1小鼠为模型考察体内的抗癌作用，通过测量小鼠体重及肿瘤体积、重量进行分析，DOX/S-LPs具有比传统隐形脂质体更高的抗癌效果。ROS响应型硫醚脂质体作为新型的药物载体具有很强的应用潜力。
Lou等[20]利用硼酸酯类化合物开发出包含合成脂质1的H2O2响应型脂质体。他们先将对H2O2敏感的芳基硼酸酯头基团与DOPE相连得到合成脂质1，再将脂质1与PC混合制备脂质体。当脂质体与H2O2接触后，一个氧原子将插入芳基硼酸酯头基团的碳硼键中间，经预先设计的自毁连接键反应即可释放出DOPE。由于自身结构的特异性，DOPE具有不同大小的头尾体积，无法维持脂质体双层膜稳定性，脂质体结构遭到破坏，使包载的药物释放。该实验选择脂溶性荧光染料尼罗红来考察脂质体响应释放特性。尼罗红可在脂质体双分子层中溶解并发出荧光，而当其释放到水相或析出时，荧光即被淬灭。因此，尼罗红不但可以用来模拟非极性药物的性质，还可以根据荧光强度的下降跟踪药物释放过程。在分析实验中，当加入H2O2后，荧光强度出现即时下降。且在脂质体中，荧光强度下降表现出对合成脂质1含量依赖性。当脂质1含量为25%时，荧光强度下降约5%；当脂质1含量升至50%时，荧光强度下降增至约25%；当脂质1含量达到75%时，荧光强度急剧下降至约40%。进一步检测发现，不同脂质1含量的脂质体可在5 min内得到完全释放，为脂质体可作为刺激响应性药物释放载体提供了有力证据。
Tomer等[21]利用二茂铁修饰的磷脂制备了一种载药脂质体，不仅可以表现出H2O2响应释放特性，而且能够将化疗药物靶向输送至肿瘤部位。二茂铁是一种性质稳定且无毒的金属有机络合物，具有明确的外球面电子传递机制[22]。首先将DSPE与二茂铁乙酸经直接偶合反应得到氧化还原活性磷脂，再加入其他原料制备出包含模型药物阿霉素的氧化还原活性脂质体，同时制备了不含二茂铁结构的非氧化还原脂质体作对照。作者将脂质体与HeLa细胞共培养5 h后，清洗细胞，成像。在590 nm处观察细胞内阿霉素荧光信号，荧光信号强弱能够反映出阿霉素经脂质体氧化还原响应释放后被细胞摄取的程度。结果显示，氧化还原活性组光信号强烈，而非氧化还原活性组信号几乎可以忽略，证明了新建释放载体的氧化还原释放机制。通过流式细胞技术检测两种脂质体对癌细胞响应的特异性，他们发现用氧化还原活性脂质体处理的癌细胞(HeLa)显示的荧光信号比非癌细胞(MRC-5)高整整一个数量级。
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光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是利用光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种新技术。当特定波长的激光照射时，被组织吸收的光敏剂受到激发把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧(1O2)，后者和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。
考虑到肿瘤微环境中ROS水平的不确定性，结合PDT疗法中外界光刺激在空间和时间上的灵活性优势，研究者开发出光触发ROS脂质体。将光敏剂、化疗药物包载于处方中含不饱和磷脂的脂质体中，这种同时包载光敏剂与化疗药物的光触发ROS脂质体[23]通过EPR效应到达肿瘤病变组织。于肿瘤部位给予外界光刺激，光敏剂激发产生大量1O2，氧化不饱和磷脂，破坏脂质膜稳定，实现化疗药物可控释放。
Fuse等[24]以DSPC、DOPE等为膜材制备出包载水溶性光敏剂他拉泊芬钠和模型药物钙黄绿素的光响应脂质体。作者发现当给予脂质体近红外光照射后，模型药物在短时间会从脂质体内部大量释放，5 min就达60%左右。进一步研究显示，药物释放量与不饱和磷脂DOPE的量呈正相关性，缺乏DOPE的脂质体(DOPE 0%)在近红外光照射下释放较少，10 min达 (18.7±1.0)%，，30 min达(25.7±0.4)%。而更多的药物可从含有5%或10% DOPE的脂质体释放，5 min 达(61.1±3.1)%，DOPE 5%；5 min 达(84.3±1.8)%，DOPE 10%。再将钙黄绿素换成抗癌药物吉西他滨制成类似脂质体，在被近红外光照射后，吉西他滨5 min可从脂质体中释放(65.6±16.2)%，10 min释放(81.2±11.4)%。作者利用EMT6/P乳腺癌细胞系评估含吉西他滨和他拉泊芬钠的近红外光响应脂质体的细胞毒性作用，光照组细胞分别存活率< 5%和(1.7±2.5)%；无光照组细胞分别存活率<90%和(94.9±23.1)%。
Luo等[10]以卟啉磷脂(porphyrin-phospholipid，PoP)、不饱和磷脂DOPC、DSPC、胆固醇等为原料制备的一种NIR响应脂质体，以DOX为模型药物。在665 nm近红外光照射下研究脂质体的响应释放，当DOPC摩尔含量为2%时，DOX释放50%所需要时间仅为61 s，比不含DOPC的脂质体快11.6倍。增加DOPC含量可促使DOX更快释放，当DOPC含量达到5%，DOX释放出50%仅需43 s。磷脂的饱和度越高越能更快的促进释放，在近红外光下，分别含18∶2(cis)PC(4个不饱和键)、 18∶1(cis)PC(2个不饱和键)的不同脂质体释放50% DOX所需时间依次为31、46 s。作者采用双肿瘤模型评估光疗诱导DOX积累，经近红外光照射后，DOX在光照组肿瘤部位积累量是非光照组的5.6倍。作者利用载MIA PaCa-2荷瘤小鼠评价脂质体抗肿瘤效果，在给予6 mg/kg注射剂量后，光照组(DOX-POP+laser)明显优于无光照组(DOX-PoP alone)，两组小鼠的中位存活天数分别为80.5、22.5 d，P<0.001。
Zhao等[25]报道了一种由近红外(NIR)激活，同时包载奥沙利铂羧酸(HOC)和Fe3O4的1O2响应型脂质体(RALP @HOC @ Fe3O4)。在该脂质体处方中，甲基菁染料(cypate)作为NIR响应光敏剂，其与聚乙二醇通过对酮缩硫醇基团接合形成聚合物mPEG-TK-Cy，在808 nm激光照射下可促进1O2的产生。蛋黄L-α磷脂酰胆碱(egg-yolk L-a-phosphatidylcholine，EPC)的脂链中包含的不饱和碳碳双键可被1O2氧化裂解。当脂质体通过EPR效应进入肿瘤组织后，给予外界近红外光照射，光敏剂激发产生的单态氧(1O)使EPC中不饱和双键氧化，脂质体双层膜结构通透性改变，释放出奥沙利铂羧酸和Fe3O4纳米粒。奥沙利铂羧酸能与谷胱甘肽(GSH)反应，转化为奥沙利铂，同时促进H2O2生成。Fe3O4纳米粒中Fe2+与H2O2发生芬顿反应生成羟基自由基(·OH)，这是一种在肿瘤治疗中发挥关键作用的ROS，它不仅可以促进脂质体裂解，还可对肿瘤细胞DNA造成严重损伤，使抗肿瘤效果得到增强。
此外，当光响应ROS脂质体处方中没有加入不饱和磷脂时，由光敏剂激发产生的1O2可通过氧化胆固醇改变脂质膜的通透性，促进包封药物的释放[10]。Carter等[26]制备了一种以鞘磷脂(SPM)、pyro-lipid(卟啉磷脂的一种，化学键合pyropheophorbide-a)、胆固醇为原料的光响应ROS脂质体，包载药物为伊立替康(IRT)。作者在血清液中研究其药物释放特性，结果表明经665 nm近红外光照射后，脂质体在60 s内就可释放出大部分IRT。当给予激光照射时释放开始，照射停止时释放终止。进一步的裸鼠单耳荧光成像也证明了IRT的快速释放与激光照射处理有关。在随后进行以荷PaCa-2异种移植瘤裸鼠为模型的抗肿瘤研究中，他们发现实验组(IRT-PoP+laser)治愈率可达80%，其余各组中位存活天数分别为29(IRT-PoP alone)、42(empty PoP+laser)、18(free IRT)、17(Saline)d。
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脂质体因能提高包载药物的溶解度，减少不良反应等诸多优点，在众多领域得到广泛的应用。在治疗实体瘤的药物研究中，因为EPR效应的存在，脂质体可以作为良好的药物载体，促进药物在肿瘤部位积聚。尤其是结合肿瘤特殊微环境和外界刺激而进行的刺激响应型脂质体的研究，可获得更加安全、高效的治疗效果，实现肿瘤治疗的精准可控释放。ROS响应型脂质体可实现药物在肿瘤部位的集聚，并对肿瘤组织内部ROS高水平表达做出响应，使药物在发病局部释放。与光动力疗法结合后，可以进一步克服微环境中ROS表达水平不可控的特性，结合光具有的时空灵活性，可以快速高效的实现精准治疗。尽管如此，脂质体并不会因为EPR效应而完全进入肿瘤组织发挥作用，循环至人体其他部位的脂质体可能存在潜在的风险。不饱和磷脂在空气中容易被氧化，因而对制备所得脂质体的保存条件要求较高。光敏剂在高剂量时在激光照射下具有光毒性，如果不能快速清除，当暴露在阳光下时，光毒性还可能长时间存在，因此光敏剂的剂量调整也是需要关注的重要环节。
Application progress of ROS-responsive liposomes in anti-tumor research
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摘要: 活性氧自由基响应型脂质体是基于肿瘤微环境中活性氧自由基（ROS）高水平表达的特点而制备，可使包载药物在肿瘤部位精准释放。在外加光敏剂后，能进一步增强脂质体中药物的可控性。Abstract: Reactive oxygen species（ROS） responsive liposomes are prepared based on the high level of ROS expression in the tumor microenvironment, enabling precise drug delivery to the tumor site. With the addition of photosensitizer, the controllability of drugs in liposomes can be further enhanced.
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Key words:
- reactive oxygen species /
- liposomes /
- tumor /
- photosensitizer
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阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性记忆功能和神经行为障碍为表现的中枢神经系统退行性疾病。目前全球约有AD患者
5000 余万人，随着人口老龄化的进展，这一数字还将持续增加，给全球发展带来巨大的健康和经济负担[1] 。到目前为止，临床尚缺乏有效的AD治疗手段。胆碱酯酶抑制剂、NMDA拮抗剂等传统AD治疗药物效果有限，FDA新批准上市的Aβ单克隆抗体仑卡奈单抗等疗效尚存争议，且治疗费用昂贵[2] 。因此，开发经济、有效的AD治疗药物仍是当前研究热点。中药因其多靶点系统作用和低毒副作用的优势，近年来在AD等复杂疾病治疗药物发掘中发挥重要作用[3] 。中药葛根和知母临床应用历史悠久，葛根解肌退热、生津止渴，知母清热泻火、滋阴润燥，二者配伍可清热生津、滋阴润燥，改善代谢紊乱，对热邪灼津、痰浊阻窍所致的健忘呆钝、消渴等症具有治疗作用，主要代表方剂为玉液汤[4-6] 。近年来研究发现该药对的一些成分如葛根素[7] 、芒果苷[8] 、知母皂苷BⅡ[9] 等对AD具有药效作用。作为一种复杂的异质性疾病，AD的发生与糖尿病存在紧密的因果关联，也被称为脑型糖尿病（3型糖尿病）[10] 。但是目前鲜见葛根与知母配伍后在AD治疗中作用效果的报道。因此，本研究拟通过建立AD大鼠模型考察葛根和知母配伍防治AD的效果，同时运用代谢组学策略探究葛根与知母作为药对配伍后防治AD潜在的作用机制，为中药防治AD研究提供参考借鉴。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent
1290 Infinity液相色谱仪和6538 UHD Accurate-Mass 四级杆飞行时间串联高分辨质谱仪（美国安捷伦公司）；HERAEUS FRESCO 17高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；ANALOG 涡旋振荡器（美国奥豪斯公司）；Milli-Q Integral超纯水机（美国Millipore公司）；十万分之一电子分析天平（日本A&D公司）；Digbehav动物行为学分析系统-水迷宫（上海吉量软件科技有限公司）。1.2 药物与试剂
葛根（批号：A220901）与知母药材饮片（批号：
20220201 ）购自上海市白鹿堂中药店，经海军军医大学药学系蒋益萍副教授鉴定为豆科植物野葛P. lobate（Willd.）Ohwi的干燥根和百合科植物知母A. asphodeloides Bge.的干燥根茎；乙醇（分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司）； 乙腈、甲酸（均为LC-MS级，赛默飞世尔科技中国有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，北京迪马科技有限公司）；乌拉坦（批号：P2091859）、D-gal（批号：P1616089）和AlCl3（批号：P2391168）购自上海泰坦科技股份有限公司；生理氯化钠溶液（四川科伦药业股份有限公司）；L-2-氯苯丙氨酸（98%，上海麦克林生化有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）试剂盒购自上海源桔生物科技中心。1.3 实验动物
健康雄性清洁级SD大鼠，体重（200±20）g，购自浙江省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。大鼠饲养于海军军医大学药学系实验动物中心，笼饲条件为：温度恒定为（22±2）℃，湿度区间为40%～60%，昼夜循环时间为12 h。
2. 实验方法
2.1 中药提取液制备
分别取葛根、知母和葛根-知母药对（15∶12）粉末适量，以10倍体积70%乙醇浸泡，在85 ℃下加热回流提取90 min，滤过，滤渣以同等条件重复提取2次。合并3次滤液，60 ℃减压浓缩至无乙醇味，制备得到用于灌胃的提取液，密封保存于−20 ℃待用。
2.2 AD模型建立与药效评价
2.2.1 分组与给药
40只SD大鼠适应性喂养1周后按照体重随机分为空白对照组、AD模型组、葛根组、知母组和葛根-知母药对组共5组（n=8）。除对照组外，其余4组大鼠每日给予D-gal 300 mg/kg腹腔注射和AlCl3 200 mg/kg灌胃，连续给药21周建立AD动物模型。对照组每日给予等量的生理盐水（灌胃+腹腔注射）。自第14周起，3个中药干预组分别给予葛根、知母和葛根-知母药对提取液灌胃（相当于生药量：葛根6.25 g/（kg·d），知母5 g/（kg·d），药对11.25 g/（kg·d）。对照组和模型组大鼠灌胃等量纯水。
2.2.2 Morris 水迷宫实验
采用Morris水迷宫行为学实验评价大鼠的学习和记忆能力。水迷宫实验全程共6 d，其中包括5 d的定位航行训练和1 d的空间探索试验。利用动物行为学分析系统记录大鼠在定位航行训练期间每日的逃避潜伏时间和空间探索训练中的运动轨迹、穿越站台次数、各象限的运动距离和停留时间等参数，供分析评价使用。
2.2.3 样本获取与前处理
行为学实验结束后，大鼠腹腔注射乌拉坦麻醉，经腹主动脉取血，静置后，在4 ℃、
4 000 r/min转速下离心10 min，取上清液分装冻存于−80 ℃，供后续分析用。2.2.4 血清MDA、SOD和NO检测
使用ELISA试剂盒，按照说明书步骤检测大鼠血清中的SOD、MDA、NO等氧化应激和脂质过氧化相关指标。
2.3 代谢组学实验
2.3.1 含内标的甲醇溶液配制
精密称取L-2-氯苯丙氨酸适量，加入甲醇溶解得浓度为5 mg/ml的内标母液，随后用甲醇稀释得到浓度为2 μg/ml的内标溶液。
2.3.2 分析样本制备
各取200 μl解冻后的血清样本置于1.5 ml的离心管中，加入600 μl预冷的含内标的甲醇溶液，涡旋2 min后，在4 ℃、
12 500 r/min转速下离心15 min，取上清液供UPLC-Q/TOF-MS分析用。取各样本20 μl，混合得到质控（QC）样本。2.3.3 色谱与质谱条件
色谱条件：反相色谱柱为Waters X Select HSS T3柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm），亲水作用色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH HILIC柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；进样量：2 μl；柱温：40 ℃；流动相为0.1%甲酸-水（A ）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B）；T3柱梯度洗脱模式：0~2 min，2%B；2~17 min，2%~98% B；17~19 min，98%B。HILIC柱梯度洗脱模式：0~2 min，95%B；2~4 min，95%~89% B；4~10 min， 89% B；10~12 min， 89%~66% B；12~15 min， 66% B。流速：0.4 ml/min；色谱柱平衡时间：5 min。
质谱条件：采用 ESI 离子源，正、负离子检测模式；干燥气温度，350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；毛细管电压：正离子模式为
4 000 V，负离子模式为3 500 V；碎裂电压：120 V；质谱扫描范围：50～1 500 m/z。2.3.4 数据预处理与分析
质谱数据用XCMS程序包进行预处理，按80%原则过滤无效数据并进行内标归一化处理。使用SIMCA 14.1（Umetrics公司，瑞典）进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交矫正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）并进行模型验证，结合R2X、R2Y和Q2判断模型的拟合效果和预测效果。以变量权重值（VIP）>1、P<0.05且差异倍数（fold change，FC）>1.2或<0.8作为筛选标准，获得AD疾病关联生物标志物。借助HMDB数据库（https://hmdb.ca/）等在线代谢物质谱数据库对筛选得到的差异代谢物进行比对和注释。借助MetaboAnalyst 6.0（https://www.metaboanalyst.ca/）网站进行代谢通路分析。
2.4 统计分析
使用SPSS Statistics 23（IBM公司，美国）和GraphPad Prism 8（Graphpad软件公司，美国）进行统计分析与绘图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为组间差异具有统计学意义。
3. 实验结果
3.1 AD大鼠模型建立与药效评价
3.1.1 学习和记忆能力评价
以水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期、穿越站台所在位置次数以及站台所在象限的停留时间作为评价指标，考察大鼠的学习和记忆水平。结果如图1所示，定位航行训练期间，各组大鼠的逃避潜伏期随训练时间增加均呈下降趋势，其中模型组逃避潜伏期下降趋势较为平缓，对照组和3个中药干预组下降趋势均较模型组显著，对照组和葛根-知母药对组第5日逃避潜伏期较模型组均有极显著差异（P<0.01）。同样，空间探索实验中，模型组大鼠穿越站台次数以及站台所在象限的停留时间较对照组均显著减少，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。中药干预后各组大鼠穿越站台次数及目标象限停留时间均有所增加，其中，葛根-知母药对组与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，造模后大鼠的学习和记忆能力出现下降，给予葛根、知母和葛根-知母药对干预均可不同程度改善大鼠的学习和记忆能力，以葛根-知母药对最为显著，效果优于单药。
图 1 不同组别大鼠水迷宫实验结果A.逃避潜伏期；B.目标象限停留时间百分比；C.各组大鼠水迷宫代表轨迹图；D.穿越站台次数 *P<0.05, **P<0.01, 与模型组比较#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, 与对照组比较。3.1.2 血清生化指标测定
与对照组相比，模型组大鼠血清NO水平相对升高，MDA水平显著升高（P<0.05），SOD含量极显著降低（P<0.01）。中药干预后，各给药组血清NO和MDA水平出现不同程度降低，其中葛根-知母药对组降低效果最为明显，与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。葛根、知母和葛根-知母药对给药组血清SOD含量较模型组均有所回调，组间差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。
图 2 不同组别大鼠血清SOD（A）、MDA（B）和NO（C）水平*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较； #P<0.05, ##P<0.01，与对照组比较。3.2 血清代谢组学
3.2.1 血清代谢轮廓和多元统计分析
血清样本经UHPLC-Q/TOF-MS分析后得到各组大鼠血清代谢图谱，不同色谱柱分析条件下各组大鼠血清代谢轮廓存在一定差异。多元统计分析结果表明（图3），在PLS-DA多组分析模型中，空白对照组、AD模型组和3个中药干预组组间区分度较好，组内差异相对较小。PLS-DA模型200次置换检验结果显示，Q2回归线与Y轴截距小于0，R2和Q2曲线斜率始终为正值，且Q2<R2，表明模型未出现过拟合，具有相对可靠的解释和预测能力。在OPLS-DA模型中，不同分析条件下，AD模型组与空白对照组间完全分离，表明模型组与对照组间具有显著组间差异，CV-ANOVA验证结果证实所建立的OPLS-DA模型未出现过拟合，具备解释和预测能力。
图 3 UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA与OPLS-DA得分图A-D. UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA得分图；E-H. 模型组与对照组间OPLS-DA得分图3.2.2 差异代谢物筛选与鉴定
对T3柱和HILIC柱正、负离子模式下的代谢物信息进行差异化分析，以VIP值>1、P<0.05和FC>1.2或FC<0.8作为筛选标准，对不同模式下空白对照组与AD模型组的差异代谢物进行筛选，并以火山图形式呈现（图4）。图中橙色标记点为显著上调代谢物，蓝色标记点为显著下调代谢物。
利用HMDB数据库对差异代谢物质谱信息进行匹配和鉴定，在AD模型组与对照组间鉴定出70个AD相关的潜在生物标志物，其中由HILIC柱鉴定得到31个代谢物，T3柱鉴定得到45个代谢物，T3和HILIC柱共同鉴定得到的代谢物6个，具体如表1所示。
表 1 差异代谢物鉴定、趋势和相关通路分析结果序号 代谢物 色谱柱 分子质量（m/z） 化学式 加合离子 趋势 相关通路 P 值 1 2-羟基丁酸 T3 127.0362 C4H8O3 M+Na ↑ 丙酸代谢 1.22E-03 2 肌酸 T3 132.0781 C4H9N3O2 M+H ↑# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 6.98E-03 3 脯氨酸 T3、HILIC 138.0553 C5H9NO2 M+Na ↓#* 精氨酸和脯氨酸代谢 4.20E-03 4 L-天冬氨酸 T3 133.0606 C4H8N2O3 M+H ↑# 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢2.36E-02 5 L-乙酰基肉碱 T3 204.1218 C9H17NO4 M+H ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.26E-03 6 棕榈酰肉碱 T3 400.3424 C23H45NO4 M+H ↑#* 脂肪酸降解 2.38E-04 7 喹啉酸 T3 168.0271 C7H5NO4 M+H ↑ 烟酸和烟酰胺代谢 4.97E-04 8 焦谷氨酸 T3 128.0329 C5H7NO3 M-H ↓# 谷胱甘肽代谢 2.89E-02 9 3b-羟基-5-胆酸 T3 357.2789 C24H38O3 M+H-H2O ↑ − 1.01E-02 10 香草酸 T3 151.0361 C8H8O4 M+H-H2O ↑ − 3.05E-03 11 肌酸酐 T3 136.0491 C4H7N3O M+Na ↑# − 1.89E-04 12 戊烯二酸 T3 153.0198 C5H6O4 M+Na ↑ − 8.96E-03 13 亚油酸 T3 303.2327 C18H32O2 M+Na ↑# 亚油酸代谢 2.45E-02 14 4-羟基丁酸 T3 103.0382 C4H8O3 M-H ↑# − 4.49E-03 15 糖原 T3 689.2111 C24H42O21 M+Na ↑ 淀粉和蔗糖代谢 2.24E-02 16 肉豆蔻酸 T3 211.2038 C14H28O2 M+H-H2O ↑# 脂肪酸生物合成 4.15E-02 17 丙酰肉碱 T3 218.1383 C10H19NO4 M+H ↓# 支链脂肪酸的氧化 1.97E-02 18 硬脂酰肉碱 T3 428.3734 C25H50NO4 M+H ↑#* 长链饱和脂肪酸的
线粒体β氧化2.84E-04 19 花生四烯酸 T3 327.232 C20H32O2 M+Na ↑#* 花生四烯酸代谢 1.53E-02 20 N1乙酰精胺 T3 267.208 C12H28N4O M+Na ↑# 赖氨酸降解 3.71E-02 21 N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸 T3 189.16 C9H20N2O2 M+H ↑# α-亚麻酸代谢 4.44E-02 22 α-亚麻酸 T3 279.2316 C18H30O2 M+H ↑#* 初级胆汁酸生物合成 2.80E-02 23 24羟基胆固醇 T3 425.343 C27H46O2 M+Na ↑# 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 8.17E-04 24 2-氧代-4-甲硫基丁酸 T3 131.0189 C5H8O3S M+H-H2O ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.14E-02 25 二十碳五烯酸 T3 285.2212 C20H30O2 M+H-H2O ↑# − 2.45E-02 26 油酰乙醇酰胺 T3 348.2891 C20H39NO2 M+Na ↑# − 8.42E-03 27 吲哚-3-丙酸 T3 190.0858 C11H11NO2 M+H ↓# − 4.79E-04 28 棕榈油酸 T3 237.2193 C16H30O2 M+H-H2O ↑#* − 5.79E-03 29 15（S）-羟基二十碳三烯酸 T3 345.2341 C20H34O3 M+Na ↑# − 9.83E-03 30 十四酰肉碱 T3、HILIC 372.3103 C21H41NO4 M+H ↑# − 1.15E-02 31 3-羟基马尿酸 T3 178.0501 C9H9NO4 M+H-H2O ↓#* − 9.53E-03 32 18-羟基花生四烯酸 T3 343.225 C20H32O3 M+Na ↑# − 3.91E-02 33 亚麻酰基肉碱 T3 424.3414 C25H46NO4 M+H ↑# − 4.25E-04 34 LysoPC（15:0/0:0） T3 526.3057 C23H48NO7P M+FA-H ↓#* − 2.55E-02 35 PC（18:1（9Z）e/2:0） T3 550.3872 C28H56NO7P M+H ↑#* − 2.11E-03 36 7-酮胆固醇 T3 401.3455 C27H44O2 M+H ↑#* − 1.08E-04 37 9-十六碳烯酰肉碱 T3 398.3152 C23H43NO4 M+H ↑# − 9.43E-05 38 16（17）-EpDPE T3 343.2219 C22H32O3 M-H ↑#* − 3.33E-02 39 十八烯酰肉碱 T3 426.3578 C25H47NO4 M+H ↑# − 1.84E-04 40 肉豆蔻酰肉碱 T3 370.2951 C21H39NO4 M+H ↑ − 4.25E-03 41 DL-乙酰肉碱 T3 204.1227 C9H17NO4 M+H ↑ 嘧啶代谢 1.85E-03 42 胞苷一磷酸 HILIC 368.0407 C9H14N3O8P M+FA-H ↓# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 2.74E-02 43 胆碱 HILIC 86.0963 C5H14NO M+H-H2O ↑ 初级胆汁酸生物合成 1.20E-02 44 甘胆酸 HILIC 466.33 C26H43NO6 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.43E-04 45 L-酪氨酸 HILIC 182.0812 C9H11NO3 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.89E-03 46 苯丙氨酸 HILIC 166.0862 C9H11NO2 M+H ↑ 嘌呤代谢 1.68E-03 47 肌苷酸 HILIC 383.0262 C10H13N4O8P M+Cl ↓#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢9.85E-04 48 L-天门冬氨酸 HILIC 134.0433 C4H7NO4 M+H ↑ 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 5.14E-04 49 苯丙酮酸 HILIC 165.0546 C9H8O3 M+H ↑#* 嘧啶代谢 6.25E-03 50 乳清酸 HILIC、T3 179.0029 C5H4N2O4 M+Na ↓#* 鞘脂代谢 3.04E-02 51 鞘氨醇 HILIC 302.3059 C18H39NO2 M+H ↑# 酪氨酸代谢 6.59E-04 52 香草扁桃酸 HILIC 233.0192 C9H10O5 M+Cl ↑#* 酪氨酸代谢 6.72E-05 53 酪胺 HILIC 120.079 C8H11NO M+H-H2O ↑ − 2.50E-03 54 3-氧代-4, 6 -胆二烯酸 HILIC 393.2315 C24H34O3 M+Na ↑# 初级胆汁酸生物合成 1.46E-02 55 鹅去氧胆酸 HILIC 437.2877 C24H40O4 M+FA-H ↑#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢7.30E-04 56 谷氨酰胺 HILIC 169.0584 C5H10N2O3 M+Na ↑# − 5.06E-04 57 亮氨酸 HILIC 133.0855 C6H12O3 M+H ↑ − 5.18E-03 58 高-L-精氨酸 HILIC 189.1292 C7H16N4O2 M+H ↑#* − 1.22E-02 59 马尿酸 HILIC、T3 178.0516 C9H9NO3 M-H ↓# − 2.94E-02 60 牛磺胆酸3-硫酸盐 HILIC 596.2653 C26H45NO10S2 M+H ↑ − 1.78E-05 61 鹅去氧胆酸3-硫酸盐 HILIC 455.2515 C24H40O7S M+H-H2O ↑ 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 2.76E-03 62 硫代半胱氨酸 HILIC 187.9645 C3H7NO2S2 M+Cl ↓# 亚油酸代谢 8.23E-05 63 13-L-过氧化氢亚油酸 HILIC 311.2187 C18H32O4 M-H ↓# − 4.63E-03 64 S-亚硝基谷胱甘肽 HILIC 381.0763 C10H16N4O7S M+FA-H ↓#* 鞘脂代谢 8.86E-05 65 LacCer（d18:1/12:0） HILIC 806.5705 C42H79NO13 M+H ↑ 花生四烯酸代谢 1.30E-04 66 LysoPC（14:0/0:0） HILIC、T3 512.3009 C22H46NO7P M+FA-H ↓ − 3.34E-02 67 2-（14,15-环氧二十碳三烯酰基）甘油 HILIC 395.2749 C23H38O5 M+H ↑ − 1.41E-03 68 赖氨酰苯丙氨酸 HILIC 294.1891 C15H23N3O3 M+H ↑ 醚脂代谢 2.52E-04 69 二十四碳四烯酸肉碱 HILIC、T3 526.3786 C31H53NO4 M+Na ↑ − 2.98E-05 70 1-（11Z二十二碳烯酰基）-3-磷酸甘油酯 HILIC 515.3163 C25H49O7P M+Na ↑ − 8.91E-07 注：↑表示模型组较对照组相对升高趋势，↓表示模型组较对照组相对下降趋势，P值为模型组与对照组间代谢物水平的t检验计算结果；
#表示代谢物经葛根-知母药对干预后具有回调趋势（共47个），*表示代谢物（共20个）经葛根-知母药对干预后回调差异具有统计学意义（P<0.05）。3.2.3 药物的干预效果
利用各组间的FC值变化情况判断药对干预后的回调代谢物。对于具有回调趋势的代谢物多组间变化情况进行单因素方差分析，P<0.05的代谢物确定为药对干预后显著回调的差异代谢物。结果显示，葛根-知母药对干预后出现回调的差异代谢物共计47个，其中，显著回调代谢物20个（表1和图5）。
图 5 20个显著回调代谢物在不同组间的相对信号强度*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较; #P<0.05, ##P<0.01，###P<0.001，与对照组比较。对70个AD相关的差异代谢物和葛根-知母药对干预后显著回调的20个差异代谢物分别进行通路富集分析后发现（图6），AD模型大鼠潜在疾病生物标志物涉及通路主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、酪氨酸代谢、嘧啶代谢等。葛根-知母药对干预可对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢和初级胆汁酸生物合成等通路产生回调影响。
图 6 血清差异代谢物KEGG通路富集分析A.模型组与对照组；B.葛根-知母药对干预后回调通路（1.苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；2.苯丙氨酸代谢；3.亚油酸代谢；4.不饱和脂肪酸的生物合成；5.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；6.精氨酸生物合成；7.烟酸和烟酰胺代谢；8.嘧啶代谢；9.酪氨酸代谢；10.初级胆汁酸生物合成）4. 讨论
AD是一种复杂的中枢神经系统异质性疾病，具体病因尚不明确。目前已知可导致AD的因素包括基因突变、氧化应激、神经炎症以及多种环境和疾病因素[11] 。衰老被认为是AD最相关的危险因素[12] ，啮齿类动物长期摄入D-gal可产生包括氧化应激、炎症反应在内的多种与人类相似的衰老相关变化[13] 。铝元素可通过促进中枢神经系统炎症反应、降低脑中SOD活性，影响胆碱能神经传递、促进Tau蛋白磷酸化等形式诱导神经毒性，过量铝暴露与AD等中枢神经系统退行性疾病进展相关[14] 。研究表明，D-gal与AlCl3联合应用可产生类似于自然衰老的变化及AD相关特征[15] 。因此，本研究选取D-gal与AlCl3联合造模，通过大鼠长程给药模拟和还原AD相关的病程和病理变化，力求更加精准地反映AD患者体内代谢分子水平变化。药效学实验表明，D-gal和AlCl3联合给药后大鼠学习和记忆能力明显下降，体内氧化应激和炎症相关因子水平发生变化，表明该模型成功模拟AD相关的病理变化和特征。而葛根-知母药对干预可显著改善AD模型大鼠的学习和记忆能力，并回调SOD、NO和MDA等相关生化指标，改善和回调效果优于单药，表明葛根和知母配伍后在AD防治中具有一定的增效作用，具备进一步研究的价值。
代谢组学结果表明，葛根-知母药对可以显著回调血清中20种代谢物，主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢等途径。酪氨酸是一些神经递质或者神经调节剂的前体。Liu[16]等对尸源样本进行非靶向和靶向代谢组学分析发现，AD患者海马中苯丙酮酸含量普遍上调，表明苯丙氨酸代谢失调可能是AD病理形成的重要机制。本研究同样发现AD模型大鼠血清中苯丙酮酸水平较对照组显著升高，葛根-知母药对可以显著回调苯丙酮酸至生理水平。脯氨酸是一种非必需氨基酸，参与氧化还原调控和细胞凋亡，既是活性氧（ROS）清除剂，也是ROS生产者，因此，平衡脯氨酸水平和脯氨酸相关代谢酶活性对维系细胞生理功能至关重要。脯氨酸代谢可能会通过ROS、细胞衰老和细胞免疫等机制影响神经元功能[17] 。Xu等[18]整合代谢组学与蛋白质组学结果发现，脱脂核桃粉可以通过升高小鼠脑组织中脯氨酸等多种氨基酸水平发挥对东莨菪碱诱导的AD小鼠神经保护机制。这与本实验结果相似，葛根-知母药对可以通过回调脯氨酸水平发挥AD防治作用。
此外，本研究发现多种回调代谢物与脂质代谢密切相关。花生四烯酸和α-亚麻酸是由多不饱和脂肪酸氧化产生的脂氧化物，广泛参与机体炎症、免疫等多种生理病理进程。花生四烯酸升高可进一步提高氧化应激水平，与AD等疾病进程紧密相关[19] 。AD与胆汁酸代谢异常之间存在紧密关联，这可能与肠-肝-脑轴机制相关。有研究表明AD患者血浆中胆汁酸水平升高[20] 。磷脂是保持细胞膜完整性的主要物质，溶血磷脂酰胆碱是磷脂的降解产物，与磷脂代谢密切相关，磷脂代谢异常可导致溶血磷脂酰胆碱下调，表现为细胞凋亡及信号转导异常，是AD的潜在诱因之一[21] 。本研究表明，葛根-知母药对的AD防治作用效果可能与显著回调血清中花生四烯酸、α-亚麻酸、甘胆酸、鹅去氧胆酸和溶血磷脂酰胆碱水平相关。
ROS产生与消除之间的不平衡被称为氧化应激，氧化应激是AD等疾病的关键因素和共同点。NO是ROS的一种，也是神经传递和炎症相关的重要因素。高水平ROS会触发不饱和脂肪酸的脂质过氧化，导致MDA等高反应性化合物的产生，因此MDA是脂质过氧化和氧化应激的标志。SOD是抵消ROS有害影响最有效的一线防御机制。SOD可以通过去除超氧自由基防止更具破坏力的过氧亚硝酸盐生成，并维持体内NO在生理相关水平[22, 23] 。代谢组学结果提示，葛根-知母药对回调干预的多种途径与氧化应激和脂质过氧化相关。ELISA实验结果进一步表明，葛根-知母药对干预可提高AD大鼠体内SOD水平，回调NO和MDA至生理水平，提示葛根-知母药对可以通过调节氧化应激和脂质过氧化，维持体内NO的生理水平对AD产生防治作用。
综上，本文通过建立AD大鼠模型考察了葛根-知母药对防治AD的作用效果，药对药效优于单药；运用代谢组学策略揭示其改善AD大鼠学习和记忆能力相关的潜在代谢物和代谢路径，其作用机制可能与调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等代谢通路、改善氧化应激和脂质过氧化水平等相关，为中药药对防治AD的临床应用和进一步开发提供了科学依据。
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