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聚醚类抗生素是一类重要的微生物次级代谢产物,其结构特征为分子中含有多个环醚单元,且分子一端有羧基,该类抗生素主要由链霉菌产生,具有离子载体性质,容易络合金属离子,常见的聚醚类抗生素有莫能菌素、南昌霉素、尼日利亚菌素等。聚醚类抗生素家族中含有一类特殊的天然产物,即茚满霉素类,该类化合物含有反式四氢茚满环和吡咯酮结构单元,其代表分子是茚满霉素(indanomycin,X-14547A),最早分离自链霉菌Streptomyces sp. NRRL 8167[1]。与其结构相似的化合物还有cafamycin[2]、16-deethylindanomycin[3]及其类似物[4]、homoindanomycin、stawamycin[5-6]和JBIR-11[7]等。茚满霉素类化合物均具有良好的抗菌、杀虫和抗原虫等活性,其特殊的化学结构和显著的生物活性引起了药物学家们的广泛兴趣,不少化学家对其进行全合成,生物学家也对含有该类特殊结构的天然产物的生物合成机制进行研究。
本文就茚满霉素类化合物的天然发现、生物活性、化学合成和生物合成进行总结,为开发该类天然产物的药用价值提供科学基础,为采用组合生物合成的方法对该类化合物进行结构改造提供新思路。
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在从土壤培养物中寻找新抗生素的过程中,Miller课题组从链霉菌Streptomyces sp. NRRL 8167的发酵液中分离得到了茚满霉素(1),为该家族第一例化合物。化合物1能够将1价和2价阳离子从水溶液中萃取到不相溶的有机溶剂中,另外,与一些只能运输特定单价阳离子(如K+或Na+)的离子载体抗生素不同,化合物1还能通过溶剂屏障(CHCl3)将Rb+和Ca2+从一个水相转移到另一个水相,具有介导跨生物膜转运2价阳离子的特殊能力[8],迄今为止,仅有少数离子载体抗生素(如拉沙里菌素和离子霉素等)具有相似的运输能力[1]。化合物1具有良好的抗菌、杀虫和抗原虫等活性[9-10],具有与其他离子载体抗生素类似的抗菌谱,在体外对G+菌Mycobacterium phlei、Streptomyces cellulosae、Staphylococcus aureus、Bacillus sp. E、Bacillus sp. TA、Sarcina lutea、Bacillus megate- rium、Bacillus subtilis的最低抑菌浓度(MIC)分别为3.1、0.8、0.2、0.2、0.2、0.1、0.1、0.1 μg/ml。研究显示,浓度为100 ppm的化合物1连续使用6 d可以使舞毒蛾和烟草天蛾幼虫的数量减少50%,使玉米穗虫的数量减少33%;浓度为20 ppm的化合物1可以使四龄的埃及伊蚊(Aedes aegypti)的死亡率达100%[1]。王继栋等人发现,化合物1对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和人肝腺癌细胞(HepG-2)具有一定程度的抑制作用,其IC50值分别为14.01和7.26 μg/ml[11]。
Kliuev等人从产生蒽环类抗生素galtamycin的链霉菌培养液中分离得到了一种新型类似物cafamycin(2)[2],其与化合物1的区别在于2位甲基被乙基取代,18位乙基被脱除。Occolowitz等人从美国蒙大拿州收集的土壤样品中分离出一种新的链霉菌Streptomyces setonii,并从中分离得到了一种新的类似物,即16-deethylindanomycin(3)[3],该化合物对Streptococcus pneumoniae Park I的MIC值为2 μg/ml,对Staphylococcus aureus X1.1、S. aureus V41、S. aureus V400、S. aureus S13E的MIC值为4 μg/ml。当化合物3的浓度为0.31μg/ml时,可以100%抑制柔嫩艾美耳球虫(Emeria tenella)的生长。Zhang等人从海洋链霉菌Streptomyces antibioticus PTZ0016中分离得到了化合物3的类似物,iso-16-deethylindanomycin(4)、16-deethylindanomycin 甲酯(5)和iso-16-deethylindanomycin 甲酯(6),这3种化合物在体外实验中都显示出对金黄色葡萄球菌的抑制活性,其MIC值为4.0~8.0 μg/ml[4]。有趣的是,化合物4和6分别为化合物3和5的C-7手性异构体,这一现象在其他茚满霉素类似物中并不多见,提示该菌株中负责呋喃环形成的酶的立体选择性低。Homoindanomycin (7)分离自菌株Streptomyces galbus,其与化合物1唯一的区别在于2位上的甲基被乙基取代。Miao等人从链霉菌菌株Strepto-myces sp.的液体培养物中分离出一种新的天然产物stawamycin(8),化合物8保留了与化合物1类似的吡咯和四氢茚满结构,但不具有呋喃环,并且双键位置和构型与其他化合物相比也有明显区别,另外,该化合物的绝对构型并没有完全确定。化合物8具有抗人类疱疹病毒EB病毒(epstein-barr virus,EBV)活性,可以抑制病毒转录因子BZLF1与其DNA靶标的结合[5]。Miho等人从绿色链霉菌Streptomyces viridochromogenes的菌丝体中分离得到了JBIR-11(9),是化合物8的衍生物,不同的是化合物9在末端羧基上结合了一分子色氨酸,而且化合物9具有抗肿瘤活性,对人纤维肉瘤HT1080细胞具有生长抑制作用,其IC50值为25 μmol/L[7]。茚满霉素及其天然类似物的结构式如图1所示。
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由于茚满霉素中不同寻常的结构,如反式四氢茚满环和吡咯酮,其全合成被多次报道[12-15]。Boeckman[16]等人对茚满霉素进行了逆合成分析,选择利用串联Wittig反应与分子内Diels-Alder环加成反应来合成反式四氢茚满环骨架。吡喃醛中间体(10)和磷叶立德(11)发生wittig反应得到中间体(20),随后由分子内[4+2] Diels-Alder环加成反应得到化合物1。
化合物10的构建以活泼醛(12)为原料,在二烷基铜锂的作用下发生羟醛缩合反应得到醇类中间体(13),化合物13在过量臭氧下双键发生断裂后,被硫醚还原得到化合物14。在二叔丁基联苯锂的存在下,化合物14发生锂盐化,最后经PPTS催化得到化合物10(图2)。
化合物11的合成以二醇化合物(15)为起始原料,在DMAP催化作用下,伯羟基发生硅基烷基化反应,随后与二异丁基氢化铝在−78 ℃发生Claisen重排,得到烯醇(16)。化合物16进行磺基化反应后,以氰化钾作为氰源,合成氰化物(17)。化合物17在四丁基氟化铵和重金属氧化剂PDC作用下,得到α, β不饱和醛(18)。最后将化合物18与格氏试剂乙烯基溴化镁在−78 ℃进行无水无氧反应,由此得到的化合物19再与三苯基膦溴化氢反应,生成化合物11(图3)。
最后,化合物10和11在叔丁醇钾的作用下,发生wittig反应得到中间体20。化合物20被i-Bu2AlH还原为醛,随后在1,2-二氯乙烷中与吡咯酮(21)反应,先后进行wittig反应与分子内Diels-Alder环加成反应,得到化合物22。化合物22在三甲基碘硅烷作用下脱保护,再与过量的三氧化铬发生氧化反应,得到目标化合物1(图4)。
该化合物的全合成历经21步,总体收率不高。反应过程需要使用锂化物、氢化铝、格氏试剂等危险品,还需要–78 ℃的低温无水反应,条件苛刻,并且使用到了剧毒化合物氰化钾、重金属试剂PDC及三氧化铬。因此,该方法对环境不友好,不符合绿色化学的理念,有待进一步的改善。
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化合物1是杂合了非核糖体肽合成酶-聚酮合酶(NRPS-PKS)装配线的天然产物,Roege等人用13C标记的前体喂养实验确定了其代谢起源,包括1个L-脯氨酸、6个丙二酰辅酶A、2个甲基丙二酰辅酶A和2个乙基丙二酰辅酶A[17-18]。Kelly课题组从抗生素链霉菌NRRL 8167中确认了化合物1的生物合成基因簇idm,其大小为80 kb左右(图5A)[19]。其中16个基因参与了化合物1的生物合成(idm A-P),包括吡咯合成[20](pyrrole biosyn-thesis,idmI-K),调控和抗性基因(idmC,D,G),聚酮合成酶基因(idm L-P),聚酮前体合成基因(idmB,E,F),后修饰基因(idmA,H),另外7个基因经基因敲除实验验证与化合物1的合成无关(orf 1-4,orf 21-23)。起始单元吡咯-2-甲酰CoA是由L-脯氨酸经过脯氨酰依赖的转移酶(idmJ),载体蛋白(idmK)和黄素依赖的L-脯氨酰CoA脱氢酶(idmI)3个酶催化形成的(图5C)。IdmJ基因缺失实验证实idmJ参与了化合物1的生物合成。编码PKS的基因位于idmI-K的下游,包含编码idmL-P 5个酶,根据生物信息分析划分成10个模块:idmL(模块1~3),idmM(模块4和5),idmN(模块6~8),idmO(模块9),idmP(模块10和11)。PKS模块的结构域由酮基合成酶(KS)、酰基转移酶(AT)、脱氢酶(DH)、烯酰还原酶(ER)、酮基还原酶(KR)和酰基载体蛋白(ACP)等结构域组成,根据模块中的结构域分析,推测化合物1的PKS骨架形成与延伸过程如图5B所示。
模块1~10完成了化合物1的PKS骨架搭建,模块11是化合物1生物合成中的特殊PKS模块,它不参与聚酮链的延伸,而且它的模块结构不完整,仅包含一个KS单元、一个AT单元和一个特殊的cyc11单元,其中,cyc11单元与盐霉素(salinomycin)生物合成中的吡喃合成酶(SalBIII)的同源性较高,序列比对显示,cyc11(Asp28和Asp94)含有SalBIII(Asp38和Asp104)活性必需的残基[21-22],因此cyc11可能具有与盐霉素中吡喃形成类似的催化机制[23],即负责催化化合物23的C-3羟基脱水生成α, β-不饱和酮,然后进行C-7羟基的Michael加成产生化合物24。根据生物信息学预测,茚满霉素PKS模块最终对应的产物为含19-OH的中间体,而不是化合物23,因为其PKS模块2中无DH结构域,不能直接产生Δ19(20)双键。但是,该位置上双键需要作为化合物24上的亲双烯体进行[4+2]环加成以产生茚满环,具体哪个酶负责催化形成Δ19(20)双键目前尚不明确。另外,序列比对表明idmH与环化酶SnoaL[24-25]存在很大的相似性,所以负责[4+2]环化形成茚满环结构的酶可能是idmH[19, 26],但目前尚无体外生化反应验证。根据生物信息学推测的茚满霉素后修饰合成路线如图5D所示。
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含反式四氢茚满环结构的化合物在天然产物中比较少见,自1979年茚满霉素首次报道以来,这类化合物就引起了药物化学家和生物学家的广泛兴趣,本综述总结了其在生物活性、化学全合成以及生物合成等方面获得的研究成果,为该类天然产物的药用价值开发提供科学依据。虽然茚满霉素的生物合成步骤尚未完全阐明,但随着其生物合成基因簇的发现,利用组合生物合成的方法对该类化合物进行结构改造将成为可能。
Research progress on indanomycin natural products
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摘要: 茚满霉素类天然产物是一类具有反式四氢茚满环(indan)结构的微生物次级代谢产物,该类化合物普遍具有良好的抗菌、杀虫以及抗肿瘤等生物活性,因而引起了药物化学家和生物学家的广泛兴趣。对1979年至今有关茚满霉素类化合物的天然发现、生物活性、化学合成以及生物合成等方面的研究进展进行综述,为该类抗生素的基础和应用研究提供科学参考。Abstract: Indanomycins are a class of secondary metabolites of microorganisms with a trans-tetrahydroindan (indane) ring. These compounds generally have good antibacterial, insecticidal and antitumor biological activities, which have caused wide interest for medicinal chemists and biologists. This review summarizes the research progress of the discovery, biological activity, chemical synthesis and biosynthesis of indanomycin compounds since 1979 and provides scientific reference for the research and development of indanomycin antibiotics.
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Key words:
- indanomycin /
- indane ring /
- biological activity /
- chemical synthesis /
- biosynthesis
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药品非无菌产品微生物限度检查中微生物计数法(后简称计数法)是药品检验的重要组成部分,是对能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的定量计数[1]。计数法检验流程概括为:取供试品根据其理化和生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。倍比稀释,选取1~3个合适的稀释级(根据样品特性和污染情况)用平皿法、薄膜过滤法或MPN法做供试品检查。供试样品的制备过程中使样品充分溶解或分散,并有效降低或消除药品本身的抑菌性在检验过程中尤为重要,是得到准确的微生物计数检验结论的关键点。过去的研究主要集中在对计数法检验有影响的菌株选择和保存、培养基质量控制、操作环境控制及被检样品方法适用性研究,而对药品的前处理(即供试液的制备方法)尤其是中成药的前处理法研究甚少。据佘凡等报道[2-7],影响微生物限度检验误差因素分析中因前处理所产生误差在各因素中占比重较高。李超美等[8]曾组织同省9个药检所对同厂家、同批号中成药“香莲丸”做微生物限度验证,发现验证方法并不完全相同,以致验证结果不同,影响实验结果一致性评价。分析其主要原因是选择了不同的前处理方法,样品经前处理后是否完全溶解或分散,供试液中颗粒大小和沉降速度,取供试液时是振摇混匀还是取上清液、样品抑菌性是否被中和等因素直接影响微生物的回收率,致使各实验室有的采用常规法,有的采用培养基稀释法,有的采用薄膜过滤法才能使回收率达到药典规定的要求。
鉴于中成药微生物限度计数法前处理工作对提高中成药的检验质量影响较大,本文就中成药前处理关键影响因素和优化方法进行了系统的分析和综述。
1. 影响计数法前处理的因素分析
1.1 中成药溶解性分类
《中国药典》2020版与欧美药典[1,9,10]在样品供试液制备时(前处理)都根据药品的理化特性和生物学特性将药品分类。一般口服制剂除肠溶、结肠溶和膜剂供试品外基本分为三类:水溶性供试品、水不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品。中成药配方复杂,成分多样,制法较西药特殊。如片剂中牛黄解毒片是由人工牛黄、雄黄、石膏、大黄、黄芩、桔梗、冰片、甘草8味药组成,制法是:以上八味,雄黄水飞成极细粉;大黄粉碎成细粉;人工牛黄、冰片研细;其余黄芩等四味加水煎煮二次,合并滤液浓缩成稠膏或干燥成干浸膏,加入大黄、雄黄粉末,制粒,干燥,再加入人工牛黄、冰片粉末,混匀,压制成片[11]。丸剂中防风通圣丸由防风、大黄、芒硝、栀子、滑石、白术、白芍、当归等17味中药组方。制法是以上十七味,滑石粉碎成极细粉;其余防风等十六味粉碎成细粉,过筛,混匀,用水制丸,干燥,用滑石粉包衣, 打光,干燥,即得。或以上十七味,粉碎成细粉,过筛,混匀,用水制丸,干燥,即得[11]。从以上两个中成药的配方、制法可以看出中成药是药材提取物与原粉的混合,雄黄、石膏是矿物质,冰片是植物提取物结晶,都不溶于水,其他生药原粉也不能完全溶于水。所以较难将其简单分成水溶性、不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品。这是影响各实验室选择前处理方法制备样品最直接的因素。
1.2 缓冲液pH值
《中国药典》2020版和欧洲药典的缓冲液pH值范围基本相同[1,10],为pH7.0、pH7.2、pH6.8、pH7.6,供试液制备时如需要,应调节pH值至6~8。中成药组方成分和制造工艺多样,决定产品的pH值范围较广,所需缓冲能力较大,缓冲范围涵盖pH值6~8的缓冲液。如麻仁丸配方为火麻仁、枳实(炒)、苦杏仁、大黄、炒白芍、姜厚朴。其制法为以上六味,除火麻仁、苦杏仁外,其余大黄等粉碎成细粉,再与火麻仁、苦杏仁掺研成细粉,过筛,混匀。粉末用炼蜜加适量的水制丸,干燥,制成水蜜丸;或加炼蜜制成小蜜丸或大蜜丸,即得[11]。这一制作过程没有对成品的酸碱度有特殊要求。又如一清胶囊的处方为黄连、大黄、黄芩。其制法是以上三味,分别加水煎煮两次,合并煎液,滤过,滤液分别减压浓缩,喷雾干燥,制得黄芩浸膏粉及大黄和黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒,干燥,粉碎,加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量,混匀,装入胶囊,制粒,即得。整个过程没有测定酸碱度[11]。再如乙肝益气解郁颗粒配方为柴胡(醋炙)、白芍、枳壳、橘叶、黄芪、丹参、党参、茯苓、桂枝、瓜蒌、刺五加、黄连、法半夏、山楂、决明子、五味子。其制法是以上16味,白芍、茯苓、法半夏分别粉碎,过筛,依次取细粉混匀,备用;剩余的粗粉备用。五味子粉碎后用80%乙醇回流提取两次,合并提取液,回收乙醇,备用。其余柴胡(醋炙)等12味及白芍等三味的粗粉加水煎煮两次,合并煎液,静置 12小时,取上清液,与上述五味子提取液合并,浓缩,加入上述细粉及适量糖粉混匀,制成颗粒[11]。从以上丸剂、胶囊剂、颗粒剂的举例中可以看出中成药的pH范围会比较宽泛,将被检样品的前处理液加入胰酪大豆胨琼脂做菌落总数的培养,或许会改变培养基的酸碱度进而影响菌落的生长繁殖,从而影响菌落计数结果的准确性。根据细菌适应酸碱度不同可将微生物分成:中性微生物、嗜酸性微生物、耐酸性生物、嗜碱性微生物、耐碱性微生物等。培养基酸碱环境的改变,必然影响微生物的生长繁殖。另有研究表明,药品的分散度也会影响供试液的pH值,进而影响微生物的生长造成实验结果的差异[12]。
1.3 非离子表面活性剂的添加浓度
增加被检样品的分散度和溶解度有利于样品中的微生物更均匀的分布于处理液中。取样均匀性的提升有助于提高微生物的检出率。吐温80为非离子型表面活性剂,亲水性强,是优良的O/W型乳化剂,对植物油、矿物油、动物油脂等均有良好的乳化作用。根据《中国药典》2020版四部通则1105,供试液前处理添加吐温80浓度为0.1%,如水不溶性非油脂类分散力较差的供试品,可在稀释液中加入无菌0.1%的聚山梨酯80。油脂类供试品可加入无菌十四烷酸异丙酯,或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀[1]。表面活性剂浓度过高会使细菌细胞膜中的脂类溶解而造成菌体死亡[13-16]。因此合适浓度的表面活性剂的使用尤为重要。王康[17]等增加吐温 80比例制备中药提取物穿心莲内酯固体分散体发现其能有效地提高穿心莲内酯的溶出速率。高飞[18]等在化妆品检测使用含1 g/L卵磷脂和7 g/L的吐温80生理盐水做缓冲液,可中和化妆品中防腐剂对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。张华光[19]等在缓冲液中添加3%吐温80和0.3%卵磷脂中和抑菌性较强的药品。中成药原料来源广泛,有动植物矿物等,所以表面活性剂对于中成药在计数法前处理中的最适用量仍有待研究。
1.4 中和剂或灭活方法
中成药种类多且成分复杂,难以归入药典列出的干扰物种类中。许多中成药对临床耐药细菌具有较好的抑制作用,临床上也常用抗菌中成药和抗生素联合应用以降低细菌的耐药性。深入研究中药抑菌作用和机制,大致可分为直接和间接抑制作用。直接抑制作用包括消除或逆转细菌耐药质粒、抑制细菌β-内酰胺酶活性和外排泵、改变细胞膜的通透性与消除生物膜等。间接抑制作用主要是:中药通过提高机体免疫力对抗耐药性细菌。据研究[20-22],许多中药有抑菌作用,如黄芩、黄连、连翘、五倍子、五味子、乌梅、金银花等57种,中成药包括黄连上清片、穿心莲内酯胶丸、妇必舒胶囊等。有些中药的抗菌作用机制不是单一的,而是能够在多个方面发挥作用,所以药典常见中和剂或灭活方法(详见表1)是否能满足、何种浓度能满足有抑菌成分中成药的计数法检验要求尚待研究。
表 1 《中国药典》2020版常见的中和剂或灭活方法[1]干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛、汞制剂 亚硫酸氢钠 酚类、乙醇、醛类、吸附物 稀释法 醛类 甘氨酸 季铵化合物、对羟基苯甲酸、
双胍类化合物卵磷脂 季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸 聚山梨酯 水银 巯基醋酸盐 水银、汞化物、醛类 硫代硫酸盐 EDTA、唆喏酮类抗生素 镁或钙离子 磺胺类 对氨基苯甲酸 β-内酰胺类抗生素 β-内酰胺酶 2. 优化中成药前处理的方法
陶明[23-24]等发现影响抑菌干混悬剂微生物限度方法适用性的因素主要是样品原料的分散性和中和剂的有效单位。对药品进行微生物限度计数法前处理的目的是:在生物样本安全的前提下通过前处理使被检样品成为均匀的溶液或悬浊液,以保证取样的均匀性。这样吸取供试液时,既可保证液体分散均匀,又可避免只吸取上清液或沉淀物,还可防止被检样品溶散不均造成制备液pH不同而形成结果偏离[4,7,25]。优化中成药前处理的方法有利于最终选取合适的检验方法(常规、稀释、中和、薄膜过滤法)消除样品的抑菌性,取得科学、准确的实验结果。
2.1 减小被检样品的粒度
中成药大致分为口服和外用两种使用方式,口服剂型大多为片剂、胶囊、丸剂等。无论中成药成分多复杂,减小被检样品的粒度从而增加样品的溶解度和分散度都是较佳选择。最直接减小被检样品的粒度方法就是提高匀浆效率。《中国药典》2020版对前处理匀浆的转速没有特别规定,而《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》(GB4789.2-2020)中规定检测样品的匀浆转数常规为8 000~10 000 r/min,持续1~2 min[26-27]。有研究[28]分别用匀浆仪和研磨法对9种丸剂和3种片剂进行前处理,从各组实验所得的细菌数平均值来看,匀浆法测定的细菌数大于研磨法,并呈显著性差异,如槐角丸、益肝丸、通窍鼻炎片在研磨时菌落数为4.0×102、2.7×103、2.9×102CFU/g,经均质器细匀后菌落数为8.7×102、3.4×104、6.4×102CFU/g,说明样品均质的细腻均匀可提高细菌检出率。庞云娟等[29]报道,供试液制备过程中被检样品分散度和溶解度不足是造成实验结果偏离的原因之一。以上研究表明适当提高匀浆效率可增加样品的分散度和溶解度,进而提高细菌检出率以达到提升检验准确度的目的。均质器转速和时间可参考食品菌落总数检测标准。
2.2 选择pH7.2的磷酸盐缓冲溶液体系
磷酸盐缓冲溶液可以通过H2PO4−和HPO42-在不同的pH下形成缓冲体系。当H2PO4−和HPO42-的浓度比为1∶1时,此时溶液的pH值为6.86,也被称为磷酸盐缓冲液的电中性点。在电中性点的pH值下,磷酸盐缓冲溶液的缓冲能力最弱。随着pH值的升高,H2PO4−的浓度逐渐降低,溶液的缓冲能力逐渐增强。当pH升到7.21时,H2PO4−和HPO42-的浓度比为1∶2,此时溶液的缓冲能力最强,称为磷酸盐缓冲溶液的最大缓冲范围。随着pH值的继续上升,HPO42-的浓度逐渐升高,H2PO4−的浓度逐渐降低,溶液的缓冲能力逐渐减弱。磷酸盐缓冲溶液的缓冲范围在pH值5.8~8.0之间,这个范围是根据H2PO4−和HPO42-的浓度比和pH值的关系所确定的,并且在pH值7.21左右具有最大的缓冲能力[30],所以pH7.2的磷酸盐缓冲溶液最适合中成药的前处理。
2.3 选取合适的表面活性剂浓度
许多中成药含抑菌成分,通过添加表面活性剂吐温80,可提高非水溶性成份在稀释剂中溶解度和分散度。研究[31,32]表明,添加表面活性剂效果优于调节pH值,因当药品含有抑菌性成分时,降低pH值会增加药品的抑菌性。为方便分析中成药的抑菌性,我们将中成药分为以下几类:①清热解毒类中成药常含有板蓝根、黄芩、金银花等有较强抑菌能力;②止咳平喘类的中成药若含有麻黄、川贝母、薄荷脑等成分的药物的抑菌性也比较强;③胃肠道类中成药如含有广藿香、紫苏叶等成分的药物也有较强的抑菌作用;④抗感冒类药大多含有较高金银花、甘草、柴胡等中药抑菌性较强;⑤妇科内服类中成药比外用药抑菌性弱;⑥镇痛抗炎抗风外用中成药如含有黄柏对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有抑制作用[33]。欧洲药典11.0对有抑菌作用药品选用的缓冲液其中含3%聚山梨脂80和0.3%蛋黄卵磷脂[10],既能增加被测样品的分散度和溶解度,又能中和药品本身的抑菌成分同时又可增加样品中细菌的检出率。[19]
2.4 选取合适的稀释液
既满足方法适应性菌株的回收率要求又提高样品溶解度和悬浊液的稳定性,是优化前处理过程的关键。稀释液在前处理的过程中起着重要的作用,一方面需要最大程度提供各类菌株的生存条件,另一方面要易于药品的溶解和分散。《中国药典》2015年版药品微生物限度检查方法实例中保济丸在微生物限度计数检验选用了两种稀释液,先用胰酪大豆液体培养基将被检样品制成1∶100的供试液,再取上清液薄膜过滤,并用含0.1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜[34]。前者可提高菌株回收率,后者可增加溶解和分散。另外有研究[35]表明,参考《中国药典》使用标准菌株进行化妆品微生物指标检验的供试液制备,研究不同的前处理方法的适用性结果显示:使用含中和剂的大豆酪蛋白葡萄糖卵磷酯吐温80(SCDLP)液体培养基、改良卵磷脂肉汤、戴伊恩格利中和肉汤(D/E中和肉汤)制备供试液,加菌计数回收试验结果及控制菌(耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌)阳性检出率,均优于按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)用生理盐水制备供试液,其中采用 D/E 中和肉汤进行样品制备,对样品中防腐剂的中和效果最好。
3. 小结与展望
《中国药典》2020年版要求生产厂家进行一厂、一品、一规的微生物限度标准制订和验证实验,验证报告要完整、可靠。作为药品检验机构由于检验周期所限,实际抽检工作中不可能像生产厂家去一一验证。因此,分析研究中成药这一大类非无菌药品计数法检验的特点,优化检验过程,特别是样品前处理是检验中成药的重要环节。中成药成分多为动植物和矿物,使计数法前处理时难以简单用溶解度分类,往往同一种药品各实验室选择不同检验方法,导致检验结果差异加大。且中药炮制工艺多样使中成药的酸碱度范围宽泛,如果药品前处理时稀释液的缓冲能力不强,会影响后续培养基的酸碱度,进而影响检验结果的准确性。有些中成药本身具有抑菌性,若不中和或去除会造成假阴性结果。
以上因素直接影响中成药计数法的检出率和准确度,寻找一种分散度和溶解度好,缓冲力强且能中和药品抑菌性,又对受损细菌有修复力的缓冲液显得尤为迫切。本文从影响中成药计数法检验因素入手,层层分析寻找解决方案。综合中国药典和美国药典以及相关文献内容归纳出解决的途径:首先在稀释液中加入适宜的非离子表面活性剂吐温80和卵磷脂(3%吐温80和0.3%卵磷脂)等中和剂,可以起到增加药品分散度和溶解度并中和部分抑菌性的作用;其次通过增加适宜浓度的磷酸盐缓冲离子对(Na2HPO4和KH2PO4),使缓冲液达到最大缓冲能力,用以降低中成药因偏酸或偏碱对培养基的影响;再则增加缓冲液中生长因子和维生素以利于受损细菌的快速恢复。最后选择合适的匀浆速度和时间,在适宜剪切力的作用下使缓冲液和被检样品充分混和均匀。
随着课题研究进一步深入,最终可创新出一款可加强分散度和溶解度、提高取样均匀性、降低中成药抑菌性、加强缓冲能力、加强短时间修复受损细菌能力的改良缓冲液。以提高中成药计数法检验结果的准确性、重复性及工作效率,解决中成药计数法检验中遇到的诸多问题。为监测中成药计数法这类非无菌制剂的安全性和有效性提供现实的应用价值。
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[1] LIU C M, HERMANN T E, LIU M, et al. X-14547A, a new ionophorous antibiotic produced by Streptomyces antibioticus NRRL 8167. Discovery, fermentation, biological properties and taxonomy of the producing culture[J]. J Antibiot,1979,32(2):95-99. doi: 10.7164/antibiotics.32.95 [2] MURENETS N V, KUDINOVA M K, KOROBKOVA T P, et al. Kafamycin: a new pyrrol ether antibiotic[J]. Antibiot Med Biotechnol,1987,32(11):811-814. [3] LARSEN S H, BOECK L D, MERTZ F P, et al. 16-Deethylindanomycin (A83094A), a novel pyrrole-ether antibiotic produced by a strain of Streptomyces setonii. Taxonomy, fermentation, isolation and characterization[J]. J Antibiot,1988,41(9):1170-1177. doi: 10.7164/antibiotics.41.1170 [4] LIAN X Y, ZHANG Z Z. Indanomycin-related antibiotics from marine Streptomyces antibioticus PTZ0016[J]. Nat Prod Res,2013,27(23):2161-2167. doi: 10.1080/14786419.2013.793688 [5] MIAO S. Stawamycin, A new pyrroloketoindane natural product from the cultures of Streptomyces sp[J]. Tetrahedron Lett,1995,36(32):5699-5702. doi: 10.1016/00404-0399(50)11274- [6] DIAS L C, JARDIM L S A, FERREIRA A A, et al. Towards the total synthesis of Stawamycin. Synthesis of C11-C21 fragment[J]. J Braz Chem Soc,2001,12(4):463-466. doi: 10.1590/S0103-50532001000400003 [7] IZUMIKAWA M, KOMAKI H, HASHIMOTO J, et al. Stawamycin analog, JBIR-11 from Streptomyces viridochromogenes subsp. sulfomycini NBRC 13830[J]. J Antibiot,2008,61(5):326-329. doi: 10.1038/ja.2008.47 [8] FAYE D, MBAYE M D, COUFOURIER S, et al. Zinc mediated straightforward access to diacylpyrroles[J]. Comptes Rendus Chimie,2017,20(5):492-499. doi: 10.1016/j.crci.2017.01.003 [9] GUMILA C, ANCELIN M L, JEMINET G, et al. Differential in vitro activities of ionophore compounds against Plasmodium falciparum and mammalian cells[J]. Antimicrob Agents Chemother,1996,40(3):602-608. doi: 10.1128/AAC.40.3.602 [10] ZHANG D, NAIR M G, MURRY M, et al. Insecticidal activity of indanomycin[J]. J Antibiot,1997,50(7):617-620. doi: 10.7164/antibiotics.50.617 [11] 张鑫, 姜南, 沈雪莉, 等. 土壤链霉菌HS-HY-197抗肿瘤代谢产物的研究[C]//2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集. 天津, 2010: 4394-4398. [12] AZZI N, GRIFFEN E, LIGHT M, et al. An enantioselective desymmetrisation approach to C9-substituted trans-hydrindene rings based on a diastereotopic group-selective intramolecular Diels-Alder reaction[J]. Chem Commun (Camb),2006(47):4909-4911. doi: 10.1039/B607488J [13] WHITNEY R A. Cyclic hydroboration of geraniol derivatives: a synthesis of the left-hand portion of X-14547A[J]. Can J Chem,1986,64(4):803-807. doi: 10.1139/v86-132 [14] CLARKE S L, MCSWEENEY C M, MCGLACKEN G P. Investigation of a novel diamine based chiral auxiliary in the asymmetric alkylation of ketones[J]. Tetrahedron: Asymmetry,2014,25(4):356-361. doi: 10.1016/j.tetasy.2014.01.006 [15] ROUSH W R, MYERS A G. Antibiotic X-14547A: total synthesis of the right-hand half[J]. J Org Chem,1981,46(7):1509-1511. doi: 10.1021/jo00320a060 [16] BOECKMAN R K, ENHOLM E J, DEMKO D M, et al. An efficient enantioselective total synthesis of (-)-X-14547A (indanomycin)[J]. J Org Chem,1986,51(24):4743-4745. doi: 10.1021/jo00374a054 [17] ROEGE K E, KELLY W L. Biosynthetic origins of the ionophore antibiotic indanomycin[J]. Org Lett,2009,11(2):297-300. doi: 10.1021/ol802422n [18] RAVINDRAN A, SUNDERRAJAN S, PENNATHUR G. Phylogenetic studies on the prodigiosin biosynthetic operon[J]. Curr Microbiol,2019,76(5):597-606. doi: 10.1007/s00284-019-01665-0 [19] LI C X, ROEGE K E, KELLY W L. Analysis of the indanomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces antibioticus NRRL 8167[J]. ChemBioChem,2009,10(6):1064-1072. doi: 10.1002/cbic.200800822 [20] NIEHS S P, DOSE B, SCHERLACH K, et al. Genome mining reveals endopyrroles from a nonribosomal peptide assembly line triggered in fungal-bacterial symbiosis[J]. ACS Chem Biol,2019,14(8):1811-1818. doi: 10.1021/acschembio.9b00406 [21] MIYANAGA A. Michael additions in polyketide biosyn-thesis[J]. Nat Prod Rep,2019,36(3):531-547. doi: 10.1039/C8NP00071A [22] LUHAVAYA H, DIAS M V B, WILLIAMS S R, et al. Enzymology of pyran Ring A formation in salinomycin biosynthesis[J]. Angew Chem Int Ed,2015,54(46):13622-13625. doi: 10.1002/anie.201507090 [23] KNIRSCHOVÁ R, NOVÁKOVÁ R, FECKOVÁ L, et al. Multiple regulatory genes in the salinomycin biosynthetic gene cluster of Streptomyces albus CCM 4719[J]. Folia Microbiol (Praha),2007,52(4):359-365. doi: 10.1007/BF02932090 [24] SULTANA A, KALLIO P, JANSSON A, et al. Structure of the polyketide cyclase SnoaL reveals a novel mechanism for enzymatic aldol condensation[J]. EMBO J,2004,23(9):1911-1921. doi: 10.1038/sj.emboj.7600201 [25] KLYMYSHIN D A, STEFANYSHYN O N, FEDORENKO V A. Role of genes snoaM, snoaL, and snoaE in the biosynthesis of nogalamycin in Streptomyces nogalater Lv65[J]. Cytol Genet,2015,49(3):152-157. doi: 10.3103/S0095452715030081 [26] ROMMEL K R, LI C X, KELLY W L. Identification of a tetraene-containing product of the indanomycin biosynthetic pathway[J]. Org Lett,2011,13(10):2536-2539. doi: 10.1021/ol200570u -