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脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤类型之一，占所有原发性脑肿瘤的近30%，所有恶性脑肿瘤的80%，中位生存时间约为12.5~15.0个月，手术切除、放疗、烷化剂化疗或靶向治疗是脑胶质瘤治疗主要手段[1-2]。尽管近年来脑胶质瘤的生物学研究取得了很多进展，但并没有显著改善患者的治疗效果[3]。目前，多数研究采用传统的细胞模型、肿瘤球体模型、以啮齿类动物为代表的体内模型评估药物的有效性，但这些模型不能真实预测药物在临床治疗的疗效，候选药物在Ⅰ期临床试验中的成功概率仅为3.4%，由于有效性不足和安全性差，最终阶段的失败率为54%[4]。因此，迫切需要能够真实反映人类脑胶质瘤疾病特征、微环境及其对治疗药物的反应等特点的临床前模型。
微流控芯片技术能实现在特定形状的通道中精确操纵各种流体和化学参数，例如，营养物质、流速、压力、氧气和pH值，提供可控的培养条件，从而仿真模拟人体组织和器官的微观结构和功能特征[5]，在脑胶质瘤相关研究如循环分离肿瘤细胞、药物筛选、胶质母细胞瘤进展和细胞定位、模拟肿瘤与血流、缺氧和血管生成之间的相互作用等具有广泛的应用[6]。笔者应用脑胶质瘤细胞构建了一种模拟肿瘤微环境的脑胶质瘤微流控芯片模型，用两种抗肿瘤药物进行药效验证和模型评价，并进一步探究中药半枝莲提取液抗脑胶质瘤的疗效，以期为寻找治疗脑胶质瘤中药及其活性成分筛选提供技术支撑。
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SC-1B匀胶机、BP-2B型烘胶台（北京创世威纳科技有限公司）；JKG-2A光刻机（上海学泽光学机械有限公司）；ZWF-334多功能摇床（上海智诚）；PDC-32G-2型等离子清洗机（美国Harrick公司）；Harris Uni-Corel 15072型打孔器（美国Harris公司）；Synergy 4多功能酶标仪（美国Bio-TEK公司）；Olympus IX-71倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；XW-80A型涡旋混悬仪（上海医大仪器厂）；milli-q advantage超纯水系统（美国Millipore公司）；无菌注射器（江苏恒康公司）；Harvard蠕动泵p-70（美国Harvard仪器公司）；十万分之一电子分析天平（日本A&D公司）；超低温冰箱（−80℃）、生物安全柜、CO2细胞培养箱、离心机（美国Thermo Fisher公司）。
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替莫唑胺（TMZ，批号：131966，上海陶素生化科技有限公司）；多西他赛（DOC，批号：S0904AS，大连美仑生物有限公司）；半枝莲（批号：2021031203，上海雷允上有限公司），经海军军医大学药学系蒋益萍副教授鉴定为唇形科植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥全草；DMEM高糖培养基（南京森贝伽生物技术有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，武汉塞维尔生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS，加拿大Multi Cell公司）；青霉素-链霉素溶液、0.25 %胰蛋白酶（美国Gibco公司）；T25培养瓶（美国Corning公司）；96孔培养板、10 cm细胞培养皿（上海秦尼实业有限公司）；SU-8 2075光刻胶（美国Microchem公司）；硅单面抛光片和显影液（苏州汶颢芯片科技有限公司）；聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚体和固化剂（美国Dow Corning公司）；10×多聚赖氨酸（北京索莱宝科技有限公司）；Calcein-AM/PI染色试剂盒（东仁化学科技有限公司）；DAPI染色液、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、Tween-20溶液（碧云天生物技术公司）；基质胶（美国R&D Systems公司）；缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、抗兔IgG（H+L）（英国Abcam公司）；75%乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。
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人神经胶质细胞瘤细胞（U251）购自于美国ATCC公司细胞库，用含有10% FBS和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM高糖培养基培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。
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使用Auto CAD软件设计、标准光刻法制作了3个并列平行微流控通道结构的U251微流控芯片模型，各通道间由微梯形柱结构隔开，中间通道为脑胶质细胞瘤通道，两侧为培养基或含药物培养基通道，如图1A所示。将密度为2×107 cells/ml的U251细胞混悬液加入脑胶质瘤通道中，两侧通道加入培养基或含药培养基，构成2D培养的脑胶质瘤模型；3D培养的脑胶质瘤模型则与等体积的基质胶（4℃）进行混合后，迅速将混合液加入脑胶质瘤通道中，并将芯片置于培养箱中孵育30 min后，分别取20 μl预热后的培养基加入两侧的微通道中。24 h后模型内2D和3D培养的细胞状态如图1B所示，模型内2D培养的细胞在芯片通道的底部贴壁生长，而3D培养的细胞则嵌在3D基质中不规则地生长。
图 1 神经胶质细胞瘤细胞（U251）微流控芯片模型
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采用Calcein AM/PI染色试剂盒评价芯片模型内细胞的活力。首先，向介质通道中加入PBS溶液，洗涤3次，每次持续5 min，以去除模型内潜在的干扰物质。在避光条件下，按照1 000∶2∶3（V/V/V）的比例将PBS、Calcein-AM和PI混合，制备成Calcein AM/PI染色工作液。取20 μl的染色工作液加入通道内，将芯片放入温度为37℃的恒温箱中，孵育2 h。孵育结束后，使用PBS溶液轻柔冲洗通道，去除未与细胞结合的染色剂，重复3次，每次持续5 min。将处理好的芯片放置在荧光显微镜下进行观察并拍照记录（在490 nm的激发波长下观察呈现绿色荧光的活细胞，545 nm的激发波长下观察呈现红色荧光的死细胞）。
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室温下用PBS轻柔冲洗芯片模型内的细胞5 min，重复3次；加入4%的多聚甲醛固定细胞，静置10 min。用PBS轻柔冲洗通道内的多聚甲醛5 min，重复3次；使用0.1% Triton X-100对细胞通透处理5 min，PBS洗涤细胞3次，每次5 min。室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭细胞内非特异性结构1 h，使用重组HIF-1α抗体（1∶500）4℃孵育过夜，孵育完成后，使用PBS去除芯片模型内残留一抗。采用含Alexa Fluor 488荧光基团的二抗（稀释比1∶1 000）室温避光孵育1 h，用PBS冲洗残留的二抗后，加入DAPI避光孵育3 min，再用PBS冲洗通道3次，置于荧光显微镜观察并拍照记录。
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分别取适量阳性药储备液，使用完全培养基分别稀释成浓度为2.5、5、10、20 μmol/L的DOC工作液和100、200、300、400 μmol/L的TMZ工作液。在芯片两侧培养基通道中分别加入20 μl药物工作液，24 h后采用Calcein AM/PI染色试剂盒评价阳性药在2D培养和3D培养条件下对芯片内细胞活力的影响，具体步骤详见“2.3”项。
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采用线粒体膜电位检测试剂盒考察不同浓度的阳性药物对芯片模型内细胞凋亡的影响。取20 μl的PBS加入培养基微通道，轻柔洗涤3次，每次间隔5 min。在避光条件下，将超纯水、JC-1、JC-1染色液以160∶1∶40（V/V/V）的比例配制JC-1染色工作液。向介质通道侧加入20 μl染色工作液，将芯片放入细胞培养箱中，孵育2 h。孵育结束后，使用PBS溶液冲洗通道，去除未结合的JC-1染料，重复3次，每次间隔5 min。将芯片放置在荧光显微镜下进行观察并拍照记录，在490 nm的激发波长下，可以观察到JC-1单体的荧光信号；525 nm的激发波长下，可以观察到JC-1聚合物的荧光信号。
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精密称取半枝莲药材细粉25 g（过5号筛），将其置于500 ml 75%乙醇中浸泡30 min，90℃加热回流2次，分别提取2 h和1 h。合并2次的提取液，减压浓缩，使用50%乙醇将浓缩液转移至50 ml的容量瓶中，定容至刻度，即得浓度为500 mg/ml（药材质量/ml）的提取物浓缩液，备用。
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取200 μl过滤后的半枝莲提取浓缩液（500 mg/ml），加入DMEM完全培养基，混匀得10 mg/ml含药培养基溶液，依次稀释得8、6、4、2、1、0.5、0.25 mg/ml含药培养基溶液。
将细胞悬液按5 000个/孔接种到96孔板中，空白组不加细胞，置于培养箱孵育24 h，弃去各孔中的旧培养基，实验组各孔中分别加入含有不同浓度的半枝莲溶液0.25、0.5、1、2、4、6、8 mg/ml，每孔100 μl；对照组各孔中均只加入细胞培养液，每孔100 μl，每个组5个平行。培养箱孵育24 h后，向各组每孔中加入10 μl的CCK-8试剂，于培养箱中避光孵育1 h，酶标仪检测450 nm波长处各孔的A值。
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模型内细胞活力评价：采用“2.7.2”项下毒性实验得到的浓度，模型内加入2 mg/ml半枝莲提取液培养24 h后，采用Calcein AM/PI染色试剂盒考察2D培养和3D培养条件下半枝莲提取液对模型内细胞活力的影响，实验步骤详见“2.3”项。
模型内细胞凋亡评价：模型内加入2 mg/ml半枝莲提取液培养24 h后，采用线粒体膜电位检测试剂盒考察2D培养和3D培养条件下半枝莲提取液对模型内细胞凋亡的影响，实验步骤详见“2.6”项。
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采用Image J软件计算荧光强度，GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，当P<0.05时，表示差异具有统计学意义。
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通过分析U251芯片模型中培养的细胞的表型和活力，评估该模型内脑胶质细胞瘤细胞的活性。在不改变培养条件的情况下，以1×107个/ml细胞密度接种构建芯片模型，培养48 h后进行活力和表型分析。图2A为明场下细胞形态，图2B为模型内的细胞形态，U251细胞在芯片内呈不规则的3D结构生长。图2C为培养48 h后U251细胞活/死评估的荧光图像，绝大多数为呈现绿色荧光的活细胞，表明模型内大部分细胞存活。与0 h芯片内U251细胞活力相比，U251细胞在芯片中培养48 h后仍显示出较高的活力水平（>91%），说明细胞在芯片内培养48 h后生长状态良好，可以用于后续的药效评价研究（图2D）。
图 2 U251多细胞生长状态图
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在肿瘤细胞高速生长与增殖的过程中，往往会伴随缺氧环境的形成。为确定芯片模型中U251细胞是否处于低氧环境，通过免疫荧光染色，对2D培养和3D培养模型中的U251细胞进行HIF-1α的表征。如图3所示，在3D培养的芯片模型中，缺氧状态标记物HIF-1α的荧光强度高于2D细胞培养模型，说明在3D培养条件形成的立体环境中，部分区域细胞处于相对缺氧状态，可能产生更强的缺氧反应；而在2D培养条件下，细胞间相互作用和信号传导较为简单，氧气分布比较均匀，细胞的缺氧反应相对较弱。
图 3 不同培养条件的脑胶质瘤模型微环境表征图
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为了评估该芯片模型在研究药物抗脑胶质瘤活性的适用性，分别考察了两种抗脑胶质瘤阳性药物，即TMZ和DOC，在2D培养和3D培养条件下对细胞活力的影响，结果如图4所示。阳性药TMZ和DOC对U251细胞具有一定程度的杀伤作用，随着浓度的升高，细胞存活率逐渐降低；与2D培养相比，3D培养芯片模型内的U251细胞在暴露于不同浓度TMZ（100、200、300、400 µmol/L）和DOC（2.5、5、10、20 μmol/L）的细胞活力均较高，其中，200 μmol/L和400 μmol/L的TMZ组（图4A）和20 μmol/L的DOC组（图4B）细胞活力均显著高于相应的2D培养组（P<0.05）。表明在相同浓度条件下，3D条件培养的芯片内缺氧微环境或细胞外基质能为细胞生长提供更稳定的条件，促进肿瘤细胞生长，从而表现出模型内细胞活力更高。
图 4 阳性药在2D培养和3D培养的U251芯片中细胞毒性结果（Mean±SD，n=3）
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通过JC-1荧光探针监测细胞线粒体膜电位，评估芯片模型内细胞凋亡情况，以细胞活力更高的3D培养芯片模型作为研究平台，并选择阳性药TMZ和DOC评价该芯片模型用于研究药物抗脑胶质瘤活性的可行性，结果如图5所示。通常在健康细胞的线粒体内，JC-1以高膜电位的红色荧光聚集体形态存在；在不健康或发生凋亡的细胞线粒体中，JC-1则以绿色荧光的单体形式呈现。分别使用TMZ和DOC处理后，3D芯片模型内U251细胞的红/绿荧光强度比率随着药物浓度的增加而降低，说明细胞内线粒体膜电位随着阳性药浓度的升高而下降，其中，400 μmol/L的TMZ组（图5A）、10 μmol/L和20 μmol/L的DOC组（图5B）与对照组相比，对U251细胞凋亡的影响有显著性差异，说明这两种阳性药均可通过诱导细胞凋亡杀伤U251细胞。以上结果表明本研究所构建的U251细胞微流控芯片模型具有评价药物抗肿瘤药效的能力，可以应用于胶质瘤细胞的毒性评价和凋亡评价，为后续应用于中药抗脑胶质瘤药效评价奠定基础。
图 5 使用阳性药后U251芯片中细胞凋亡结果（Mean±SD，n=3）
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采用CCK-8法考察不同浓度的半枝莲提取液对U251细胞的毒性，确定适宜的给药浓度。结果如图6所示，在0.5～8 mg/ml的浓度范围内，U251细胞的存活率随着半枝莲提取液浓度的增加而降低。为确保所选药物浓度能够有效杀伤U251细胞，同时避免浓度过高导致的非特异性毒性，本研究选择2 mg/ml的半枝莲提取液进行后续实验。
图 6 不同浓度半枝莲提取液对U251细胞活力的影响（Mean±SD，n=3）
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在所建立的U251芯片模型上考察半枝莲提取液对U251细胞的杀伤作用，通过活/死细胞染色和凋亡实验评价半枝莲提取液的药效，结果如图7所示。2 mg/ml的半枝莲提取液能在一定程度上降低细胞活力，与2D培养（平均细胞活力为64.82%）相比，3D培养的芯片上细胞活力更高（平均细胞活力为90.52%），提示在3D培养条件下可能需要更大剂量的半枝莲提取液才能对脑胶质瘤细胞产生杀伤效果。此外，凋亡实验结果显示，2D培养条件下有更多的细胞出现了线粒体膜电位降低的情况，而3D培养条件下呈绿色荧光的JC-1单体较少，说明3D培养的细胞发生凋亡的较少。综上表明半枝莲提取液在一定程度上可以杀伤U251细胞，诱导细胞凋亡，同时提示基于传统2D培养模型的药物筛选或药效评价结果与更接近体内肿瘤微环境的3D培养系统之间存在一定差距。
图 7 半枝莲提取液对2D和3D培养方式条件下U251细胞活力的影响
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神经胶质瘤的侵袭性和肿瘤细胞对化疗药物的耐受性使治疗面临重大的挑战。尽管医学科学研究取得了重大进步，但神经胶质瘤的预后仍然较差，手术、放疗和化疗等传统治疗方法效果不佳[7]。目前，体外研究采用的细胞模型仅提供微观层面的信息，无法模拟脑和脑肿瘤的解剖、功能和微环境状况[8]。因此，近年来的研究专注于开发更先进的细胞培养模型，能够更好地模拟肿瘤细胞与复杂微环境之间的相互作用，以肿瘤球体、类器官、3D打印和微流控芯片模型等为代表的3D培养方式可构建较为理想的模拟肿瘤微环境的模型，为肿瘤细胞的增殖提供了合适的环境，并可作为体内肿瘤诱导的载体，从而可以研究肿瘤生长、侵袭以及与免疫系统的相互作用[9]。
肿瘤微环境的细胞和非细胞成分都有助于神经胶质瘤的发生，肿瘤微环境的改变可以促进神经胶质瘤的发生、进展、侵袭和治疗耐药性[10]。基质胶作为一种用于体外培养和模拟生物组织环境的生物材料，其物理性质和功能上高度模拟天然细胞外基质的关键特征，为肿瘤细胞提供支撑和3D结构，有助于细胞黏附、生长和分化，可以更完整地在体外模拟肿瘤微环境[11]。PDMS具有透气性、透光性、生物相容性以及易加工和成本低等特征[12]，本研究使用的微流控芯片模型集PDMS应用优势和微流控在时空间维度精确控制的特点，实现模拟体内肿瘤微环境的细胞培养，为脑胶质瘤体外模型构建、药效评价和药物筛选提供灵活可控的研究平台。
脑胶质瘤动物模型因其存在基因和分子水平特征、肿瘤微环境等与人类存在差异、低通量、耗时长以及伦理问题等问题，细胞模型仅由肿瘤细胞组成，易发生遗传变异和缺乏肿瘤微环境等缺点，导致脑胶质瘤候选治疗药物在临床前试验评估的失败率极高[6]。与动物模型和传统的贴壁培养的细胞模型相比较，本研究采用人源的U251细胞构建的脑胶质瘤微流控芯片模型在形态、结构以及缺氧微环境的表达等方面更接近真实的肿瘤生长环境。作为体外研究模型，肿瘤细胞在该微流控芯片模型内的存活率、凋亡和对治疗的反应等方面表现出更接近体内的行为，更真实地评估模型内肿瘤细胞对药物或其他外界刺激产生的反应。因此，本研究中建立的微流控芯片模型在研究肿瘤生长、侵袭、药物评价和筛选具有一定优势。
脑胶质瘤的标准治疗包括最大限度的手术切除、随后的放疗和TMZ同步化疗[13]，但许多小分子抑制剂和免疫治疗策略都未能改善预后[14]。中医药治疗脑胶质瘤具有一定优势，包括改善临床症状、减轻放疗和化疗的不良反应、提高患者生存质量等[15]。目前认为中医药防治脑胶质瘤的作用机制主要与改善脑胶质瘤免疫抑制微环境，促进脑胶质瘤细胞凋亡及抑制其增殖、侵袭、迁徙，抑制脑胶质瘤组织内血管生成，调节BBB通透性，促进氧化应激相关，同时还能够提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性，减轻其不良反应，降低肿瘤耐药性和复发的风险[16-17]。中药半枝莲具有清热解毒，化瘀利尿的功效[18]，现代药理研究表明半枝莲具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、消炎等作用[19]，可通过抑制血管内皮生长因子、缺氧诱导因子、基质金属蛋白酶的表达等，调控相关信号通路的相互作用，抑制脑胶质瘤血管生成网络机制的形成，发挥抗胶质瘤发生和发展的作用[20]。有研究发现半枝莲80%乙醇提取物对人胶质瘤细胞具有明显的抑制迁移、侵袭作用，并具有浓度相关的抑制细胞存活率、促凋亡活性[21]。He等[22-23]研究发现半枝莲活性成分野黄芩苷对人胶质瘤细胞U251和LN229的增殖、迁移和凋亡均有抑制作用，其作用机制可能与抑制PSEN 1/PI 3 K-AKT信号通路有关。相比之下，本研究利用所构建的更具生理相关性的脑胶质瘤微流控芯片模型评价半枝莲抗脑胶质瘤作用。结果显示，2 mg/ml的半枝莲提取液能降低U251细胞的活力，通过降低线粒体膜电位诱导细胞凋亡，为进一步探究半枝莲治疗脑胶质瘤及其作用机制提供实验基础。
综上，本研究采用2D和3D培养方式构建了模拟肿瘤微环境的脑胶质瘤微流控芯片模型。综合芯片上细胞活力评价、肿瘤微环境表征以及两种抗肿瘤阳性药物对该模型进行表征并验证。该模型成功应用于中药半枝莲的抗脑胶质瘤药效评价，阐释了半枝莲通过诱导脑胶质瘤细胞的凋亡发挥抗脑胶质瘤作用，为中药抗脑胶质瘤药效评价、机制研究以及活性成分快速筛选提供研究平台。
Construction of glioma microfluidic chip model and its application research on evaluation the medicinal efficacy of the Chinese medicine Scutellaria barbata
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摘要:
目的 构建一种脑胶质瘤微流控芯片模型，模拟肿瘤微环境，用于抗脑胶质瘤中药药效评价。 方法 将神经胶质细胞瘤细胞U251接种于不同培养方式的微流控芯片内，对所构建的模型内细胞的活力和肿瘤微环境进行表征，采用荧光染色法评价阳性药替莫唑胺（TMZ）和多西他赛（DOC）对模型内细胞活性和凋亡的影响，将该模型应用于中药半枝莲提取液抗脑胶质瘤的药效评价。 结果 所构建的U251微流控芯片模型中细胞具有较高活力，并能够在一定程度上模拟肿瘤缺氧的微环境；芯片中U251细胞的活力随着阳性药浓度的升高而降低，3D培养的U251细胞活力高于2D培养（P<0.05）；细胞内线粒体膜电位随着阳性药浓度的升高而下降；2 mg/ml半枝莲提取液可以一定程度上杀伤U251细胞，并可以降低模型内细胞的线粒体膜电位。 结论 成功构建了能有效模拟肿瘤微环境和快速评估抗肿瘤药效的脑胶质瘤微流控芯片模型，为抗脑胶质瘤中药的药效评价和活性成分筛选提供了新策略。 Abstract:Objective To construct a glioma microfluidic chip model to simulate tumor microenvironment for evaluating the medicinal efficacy of anti-glioma traditional Chinese medicines. Methods Glioblastoma cells U251 were seeded into microfluidic chips with different culture modes, and the cell viability and tumour microenvironment within the constructed model were characterized. Fluorescence staining was used to evaluate the effects of the positive drugs temozolomide （TMZ） and docetaxel （DOC） on the cell activity and apoptosis within the model, which was applied to evaluate the medicinal efficacy of the extracts of the herb Scutellaria barbata on gliomas. Results The cells in the constructed U251 microfluidic chip model displayed high viability and were able to mimic the hypoxic microenvironment of tumor to a certain extent. The viability of the U251 cells in the microfluidic chips decreased with the increasing of the concentration of the positive drug, and the viability of the 3D cultured U251 cells was higher than that in the 2D condition （P<0.05）. The intracellular mitochondrial membrane potential decreased with the increasing of the concentration of the positive drug. And the 2 mg/ml Scutellaria barbata extract killed U251 cells to a certain extent and reduced the mitochondrial membrane potential of the cells in the model. Conclusion This study successfully constructed a microfluidic chip model of glioma that could effectively simulate the tumor microenvironment and rapidly evaluate the anti-tumor medicinal efficacy, which provided a new strategy for the medicinal efficacy evaluation and active components screening of anti-glioma traditional Chinese medicines. -
阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性记忆功能和神经行为障碍为表现的中枢神经系统退行性疾病。目前全球约有AD患者
5000 余万人，随着人口老龄化的进展，这一数字还将持续增加，给全球发展带来巨大的健康和经济负担[1] 。到目前为止，临床尚缺乏有效的AD治疗手段。胆碱酯酶抑制剂、NMDA拮抗剂等传统AD治疗药物效果有限，FDA新批准上市的Aβ单克隆抗体仑卡奈单抗等疗效尚存争议，且治疗费用昂贵[2] 。因此，开发经济、有效的AD治疗药物仍是当前研究热点。中药因其多靶点系统作用和低毒副作用的优势，近年来在AD等复杂疾病治疗药物发掘中发挥重要作用[3] 。中药葛根和知母临床应用历史悠久，葛根解肌退热、生津止渴，知母清热泻火、滋阴润燥，二者配伍可清热生津、滋阴润燥，改善代谢紊乱，对热邪灼津、痰浊阻窍所致的健忘呆钝、消渴等症具有治疗作用，主要代表方剂为玉液汤[4-6] 。近年来研究发现该药对的一些成分如葛根素[7] 、芒果苷[8] 、知母皂苷BⅡ[9] 等对AD具有药效作用。作为一种复杂的异质性疾病，AD的发生与糖尿病存在紧密的因果关联，也被称为脑型糖尿病（3型糖尿病）[10] 。但是目前鲜见葛根与知母配伍后在AD治疗中作用效果的报道。因此，本研究拟通过建立AD大鼠模型考察葛根和知母配伍防治AD的效果，同时运用代谢组学策略探究葛根与知母作为药对配伍后防治AD潜在的作用机制，为中药防治AD研究提供参考借鉴。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent
1290 Infinity液相色谱仪和6538 UHD Accurate-Mass 四级杆飞行时间串联高分辨质谱仪（美国安捷伦公司）；HERAEUS FRESCO 17高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；ANALOG 涡旋振荡器（美国奥豪斯公司）；Milli-Q Integral超纯水机（美国Millipore公司）；十万分之一电子分析天平（日本A&D公司）；Digbehav动物行为学分析系统-水迷宫（上海吉量软件科技有限公司）。1.2 药物与试剂
葛根（批号：A220901）与知母药材饮片（批号：
20220201 ）购自上海市白鹿堂中药店，经海军军医大学药学系蒋益萍副教授鉴定为豆科植物野葛P. lobate（Willd.）Ohwi的干燥根和百合科植物知母A. asphodeloides Bge.的干燥根茎；乙醇（分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司）； 乙腈、甲酸（均为LC-MS级，赛默飞世尔科技中国有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，北京迪马科技有限公司）；乌拉坦（批号：P2091859）、D-gal（批号：P1616089）和AlCl3（批号：P2391168）购自上海泰坦科技股份有限公司；生理氯化钠溶液（四川科伦药业股份有限公司）；L-2-氯苯丙氨酸（98%，上海麦克林生化有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）试剂盒购自上海源桔生物科技中心。1.3 实验动物
健康雄性清洁级SD大鼠，体重（200±20）g，购自浙江省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。大鼠饲养于海军军医大学药学系实验动物中心，笼饲条件为：温度恒定为（22±2）℃，湿度区间为40%～60%，昼夜循环时间为12 h。
2. 实验方法
2.1 中药提取液制备
分别取葛根、知母和葛根-知母药对（15∶12）粉末适量，以10倍体积70%乙醇浸泡，在85 ℃下加热回流提取90 min，滤过，滤渣以同等条件重复提取2次。合并3次滤液，60 ℃减压浓缩至无乙醇味，制备得到用于灌胃的提取液，密封保存于−20 ℃待用。
2.2 AD模型建立与药效评价
2.2.1 分组与给药
40只SD大鼠适应性喂养1周后按照体重随机分为空白对照组、AD模型组、葛根组、知母组和葛根-知母药对组共5组（n=8）。除对照组外，其余4组大鼠每日给予D-gal 300 mg/kg腹腔注射和AlCl3 200 mg/kg灌胃，连续给药21周建立AD动物模型。对照组每日给予等量的生理盐水（灌胃+腹腔注射）。自第14周起，3个中药干预组分别给予葛根、知母和葛根-知母药对提取液灌胃（相当于生药量：葛根6.25 g/（kg·d），知母5 g/（kg·d），药对11.25 g/（kg·d）。对照组和模型组大鼠灌胃等量纯水。
2.2.2 Morris 水迷宫实验
采用Morris水迷宫行为学实验评价大鼠的学习和记忆能力。水迷宫实验全程共6 d，其中包括5 d的定位航行训练和1 d的空间探索试验。利用动物行为学分析系统记录大鼠在定位航行训练期间每日的逃避潜伏时间和空间探索训练中的运动轨迹、穿越站台次数、各象限的运动距离和停留时间等参数，供分析评价使用。
2.2.3 样本获取与前处理
行为学实验结束后，大鼠腹腔注射乌拉坦麻醉，经腹主动脉取血，静置后，在4 ℃、
4 000 r/min转速下离心10 min，取上清液分装冻存于−80 ℃，供后续分析用。2.2.4 血清MDA、SOD和NO检测
使用ELISA试剂盒，按照说明书步骤检测大鼠血清中的SOD、MDA、NO等氧化应激和脂质过氧化相关指标。
2.3 代谢组学实验
2.3.1 含内标的甲醇溶液配制
精密称取L-2-氯苯丙氨酸适量，加入甲醇溶解得浓度为5 mg/ml的内标母液，随后用甲醇稀释得到浓度为2 μg/ml的内标溶液。
2.3.2 分析样本制备
各取200 μl解冻后的血清样本置于1.5 ml的离心管中，加入600 μl预冷的含内标的甲醇溶液，涡旋2 min后，在4 ℃、
12 500 r/min转速下离心15 min，取上清液供UPLC-Q/TOF-MS分析用。取各样本20 μl，混合得到质控（QC）样本。2.3.3 色谱与质谱条件
色谱条件：反相色谱柱为Waters X Select HSS T3柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm），亲水作用色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH HILIC柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；进样量：2 μl；柱温：40 ℃；流动相为0.1%甲酸-水（A ）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B）；T3柱梯度洗脱模式：0~2 min，2%B；2~17 min，2%~98% B；17~19 min，98%B。HILIC柱梯度洗脱模式：0~2 min，95%B；2~4 min，95%~89% B；4~10 min， 89% B；10~12 min， 89%~66% B；12~15 min， 66% B。流速：0.4 ml/min；色谱柱平衡时间：5 min。
质谱条件：采用 ESI 离子源，正、负离子检测模式；干燥气温度，350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；毛细管电压：正离子模式为
4 000 V，负离子模式为3 500 V；碎裂电压：120 V；质谱扫描范围：50～1 500 m/z。2.3.4 数据预处理与分析
质谱数据用XCMS程序包进行预处理，按80%原则过滤无效数据并进行内标归一化处理。使用SIMCA 14.1（Umetrics公司，瑞典）进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交矫正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）并进行模型验证，结合R2X、R2Y和Q2判断模型的拟合效果和预测效果。以变量权重值（VIP）>1、P<0.05且差异倍数（fold change，FC）>1.2或<0.8作为筛选标准，获得AD疾病关联生物标志物。借助HMDB数据库（https://hmdb.ca/）等在线代谢物质谱数据库对筛选得到的差异代谢物进行比对和注释。借助MetaboAnalyst 6.0（https://www.metaboanalyst.ca/）网站进行代谢通路分析。
2.4 统计分析
使用SPSS Statistics 23（IBM公司，美国）和GraphPad Prism 8（Graphpad软件公司，美国）进行统计分析与绘图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为组间差异具有统计学意义。
3. 实验结果
3.1 AD大鼠模型建立与药效评价
3.1.1 学习和记忆能力评价
以水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期、穿越站台所在位置次数以及站台所在象限的停留时间作为评价指标，考察大鼠的学习和记忆水平。结果如图1所示，定位航行训练期间，各组大鼠的逃避潜伏期随训练时间增加均呈下降趋势，其中模型组逃避潜伏期下降趋势较为平缓，对照组和3个中药干预组下降趋势均较模型组显著，对照组和葛根-知母药对组第5日逃避潜伏期较模型组均有极显著差异（P<0.01）。同样，空间探索实验中，模型组大鼠穿越站台次数以及站台所在象限的停留时间较对照组均显著减少，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。中药干预后各组大鼠穿越站台次数及目标象限停留时间均有所增加，其中，葛根-知母药对组与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，造模后大鼠的学习和记忆能力出现下降，给予葛根、知母和葛根-知母药对干预均可不同程度改善大鼠的学习和记忆能力，以葛根-知母药对最为显著，效果优于单药。
图 1 不同组别大鼠水迷宫实验结果A.逃避潜伏期；B.目标象限停留时间百分比；C.各组大鼠水迷宫代表轨迹图；D.穿越站台次数 *P<0.05, **P<0.01, 与模型组比较#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, 与对照组比较。3.1.2 血清生化指标测定
与对照组相比，模型组大鼠血清NO水平相对升高，MDA水平显著升高（P<0.05），SOD含量极显著降低（P<0.01）。中药干预后，各给药组血清NO和MDA水平出现不同程度降低，其中葛根-知母药对组降低效果最为明显，与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。葛根、知母和葛根-知母药对给药组血清SOD含量较模型组均有所回调，组间差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。
图 2 不同组别大鼠血清SOD（A）、MDA（B）和NO（C）水平*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较； #P<0.05, ##P<0.01，与对照组比较。3.2 血清代谢组学
3.2.1 血清代谢轮廓和多元统计分析
血清样本经UHPLC-Q/TOF-MS分析后得到各组大鼠血清代谢图谱，不同色谱柱分析条件下各组大鼠血清代谢轮廓存在一定差异。多元统计分析结果表明（图3），在PLS-DA多组分析模型中，空白对照组、AD模型组和3个中药干预组组间区分度较好，组内差异相对较小。PLS-DA模型200次置换检验结果显示，Q2回归线与Y轴截距小于0，R2和Q2曲线斜率始终为正值，且Q2<R2，表明模型未出现过拟合，具有相对可靠的解释和预测能力。在OPLS-DA模型中，不同分析条件下，AD模型组与空白对照组间完全分离，表明模型组与对照组间具有显著组间差异，CV-ANOVA验证结果证实所建立的OPLS-DA模型未出现过拟合，具备解释和预测能力。
图 3 UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA与OPLS-DA得分图A-D. UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA得分图；E-H. 模型组与对照组间OPLS-DA得分图3.2.2 差异代谢物筛选与鉴定
对T3柱和HILIC柱正、负离子模式下的代谢物信息进行差异化分析，以VIP值>1、P<0.05和FC>1.2或FC<0.8作为筛选标准，对不同模式下空白对照组与AD模型组的差异代谢物进行筛选，并以火山图形式呈现（图4）。图中橙色标记点为显著上调代谢物，蓝色标记点为显著下调代谢物。
利用HMDB数据库对差异代谢物质谱信息进行匹配和鉴定，在AD模型组与对照组间鉴定出70个AD相关的潜在生物标志物，其中由HILIC柱鉴定得到31个代谢物，T3柱鉴定得到45个代谢物，T3和HILIC柱共同鉴定得到的代谢物6个，具体如表1所示。
表 1 差异代谢物鉴定、趋势和相关通路分析结果序号 代谢物 色谱柱 分子质量（m/z） 化学式 加合离子 趋势 相关通路 P 值 1 2-羟基丁酸 T3 127.0362 C4H8O3 M+Na ↑ 丙酸代谢 1.22E-03 2 肌酸 T3 132.0781 C4H9N3O2 M+H ↑# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 6.98E-03 3 脯氨酸 T3、HILIC 138.0553 C5H9NO2 M+Na ↓#* 精氨酸和脯氨酸代谢 4.20E-03 4 L-天冬氨酸 T3 133.0606 C4H8N2O3 M+H ↑# 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢2.36E-02 5 L-乙酰基肉碱 T3 204.1218 C9H17NO4 M+H ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.26E-03 6 棕榈酰肉碱 T3 400.3424 C23H45NO4 M+H ↑#* 脂肪酸降解 2.38E-04 7 喹啉酸 T3 168.0271 C7H5NO4 M+H ↑ 烟酸和烟酰胺代谢 4.97E-04 8 焦谷氨酸 T3 128.0329 C5H7NO3 M-H ↓# 谷胱甘肽代谢 2.89E-02 9 3b-羟基-5-胆酸 T3 357.2789 C24H38O3 M+H-H2O ↑ − 1.01E-02 10 香草酸 T3 151.0361 C8H8O4 M+H-H2O ↑ − 3.05E-03 11 肌酸酐 T3 136.0491 C4H7N3O M+Na ↑# − 1.89E-04 12 戊烯二酸 T3 153.0198 C5H6O4 M+Na ↑ − 8.96E-03 13 亚油酸 T3 303.2327 C18H32O2 M+Na ↑# 亚油酸代谢 2.45E-02 14 4-羟基丁酸 T3 103.0382 C4H8O3 M-H ↑# − 4.49E-03 15 糖原 T3 689.2111 C24H42O21 M+Na ↑ 淀粉和蔗糖代谢 2.24E-02 16 肉豆蔻酸 T3 211.2038 C14H28O2 M+H-H2O ↑# 脂肪酸生物合成 4.15E-02 17 丙酰肉碱 T3 218.1383 C10H19NO4 M+H ↓# 支链脂肪酸的氧化 1.97E-02 18 硬脂酰肉碱 T3 428.3734 C25H50NO4 M+H ↑#* 长链饱和脂肪酸的
线粒体β氧化2.84E-04 19 花生四烯酸 T3 327.232 C20H32O2 M+Na ↑#* 花生四烯酸代谢 1.53E-02 20 N1乙酰精胺 T3 267.208 C12H28N4O M+Na ↑# 赖氨酸降解 3.71E-02 21 N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸 T3 189.16 C9H20N2O2 M+H ↑# α-亚麻酸代谢 4.44E-02 22 α-亚麻酸 T3 279.2316 C18H30O2 M+H ↑#* 初级胆汁酸生物合成 2.80E-02 23 24羟基胆固醇 T3 425.343 C27H46O2 M+Na ↑# 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 8.17E-04 24 2-氧代-4-甲硫基丁酸 T3 131.0189 C5H8O3S M+H-H2O ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.14E-02 25 二十碳五烯酸 T3 285.2212 C20H30O2 M+H-H2O ↑# − 2.45E-02 26 油酰乙醇酰胺 T3 348.2891 C20H39NO2 M+Na ↑# − 8.42E-03 27 吲哚-3-丙酸 T3 190.0858 C11H11NO2 M+H ↓# − 4.79E-04 28 棕榈油酸 T3 237.2193 C16H30O2 M+H-H2O ↑#* − 5.79E-03 29 15（S）-羟基二十碳三烯酸 T3 345.2341 C20H34O3 M+Na ↑# − 9.83E-03 30 十四酰肉碱 T3、HILIC 372.3103 C21H41NO4 M+H ↑# − 1.15E-02 31 3-羟基马尿酸 T3 178.0501 C9H9NO4 M+H-H2O ↓#* − 9.53E-03 32 18-羟基花生四烯酸 T3 343.225 C20H32O3 M+Na ↑# − 3.91E-02 33 亚麻酰基肉碱 T3 424.3414 C25H46NO4 M+H ↑# − 4.25E-04 34 LysoPC（15:0/0:0） T3 526.3057 C23H48NO7P M+FA-H ↓#* − 2.55E-02 35 PC（18:1（9Z）e/2:0） T3 550.3872 C28H56NO7P M+H ↑#* − 2.11E-03 36 7-酮胆固醇 T3 401.3455 C27H44O2 M+H ↑#* − 1.08E-04 37 9-十六碳烯酰肉碱 T3 398.3152 C23H43NO4 M+H ↑# − 9.43E-05 38 16（17）-EpDPE T3 343.2219 C22H32O3 M-H ↑#* − 3.33E-02 39 十八烯酰肉碱 T3 426.3578 C25H47NO4 M+H ↑# − 1.84E-04 40 肉豆蔻酰肉碱 T3 370.2951 C21H39NO4 M+H ↑ − 4.25E-03 41 DL-乙酰肉碱 T3 204.1227 C9H17NO4 M+H ↑ 嘧啶代谢 1.85E-03 42 胞苷一磷酸 HILIC 368.0407 C9H14N3O8P M+FA-H ↓# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 2.74E-02 43 胆碱 HILIC 86.0963 C5H14NO M+H-H2O ↑ 初级胆汁酸生物合成 1.20E-02 44 甘胆酸 HILIC 466.33 C26H43NO6 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.43E-04 45 L-酪氨酸 HILIC 182.0812 C9H11NO3 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.89E-03 46 苯丙氨酸 HILIC 166.0862 C9H11NO2 M+H ↑ 嘌呤代谢 1.68E-03 47 肌苷酸 HILIC 383.0262 C10H13N4O8P M+Cl ↓#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢9.85E-04 48 L-天门冬氨酸 HILIC 134.0433 C4H7NO4 M+H ↑ 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 5.14E-04 49 苯丙酮酸 HILIC 165.0546 C9H8O3 M+H ↑#* 嘧啶代谢 6.25E-03 50 乳清酸 HILIC、T3 179.0029 C5H4N2O4 M+Na ↓#* 鞘脂代谢 3.04E-02 51 鞘氨醇 HILIC 302.3059 C18H39NO2 M+H ↑# 酪氨酸代谢 6.59E-04 52 香草扁桃酸 HILIC 233.0192 C9H10O5 M+Cl ↑#* 酪氨酸代谢 6.72E-05 53 酪胺 HILIC 120.079 C8H11NO M+H-H2O ↑ − 2.50E-03 54 3-氧代-4, 6 -胆二烯酸 HILIC 393.2315 C24H34O3 M+Na ↑# 初级胆汁酸生物合成 1.46E-02 55 鹅去氧胆酸 HILIC 437.2877 C24H40O4 M+FA-H ↑#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢7.30E-04 56 谷氨酰胺 HILIC 169.0584 C5H10N2O3 M+Na ↑# − 5.06E-04 57 亮氨酸 HILIC 133.0855 C6H12O3 M+H ↑ − 5.18E-03 58 高-L-精氨酸 HILIC 189.1292 C7H16N4O2 M+H ↑#* − 1.22E-02 59 马尿酸 HILIC、T3 178.0516 C9H9NO3 M-H ↓# − 2.94E-02 60 牛磺胆酸3-硫酸盐 HILIC 596.2653 C26H45NO10S2 M+H ↑ − 1.78E-05 61 鹅去氧胆酸3-硫酸盐 HILIC 455.2515 C24H40O7S M+H-H2O ↑ 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 2.76E-03 62 硫代半胱氨酸 HILIC 187.9645 C3H7NO2S2 M+Cl ↓# 亚油酸代谢 8.23E-05 63 13-L-过氧化氢亚油酸 HILIC 311.2187 C18H32O4 M-H ↓# − 4.63E-03 64 S-亚硝基谷胱甘肽 HILIC 381.0763 C10H16N4O7S M+FA-H ↓#* 鞘脂代谢 8.86E-05 65 LacCer（d18:1/12:0） HILIC 806.5705 C42H79NO13 M+H ↑ 花生四烯酸代谢 1.30E-04 66 LysoPC（14:0/0:0） HILIC、T3 512.3009 C22H46NO7P M+FA-H ↓ − 3.34E-02 67 2-（14,15-环氧二十碳三烯酰基）甘油 HILIC 395.2749 C23H38O5 M+H ↑ − 1.41E-03 68 赖氨酰苯丙氨酸 HILIC 294.1891 C15H23N3O3 M+H ↑ 醚脂代谢 2.52E-04 69 二十四碳四烯酸肉碱 HILIC、T3 526.3786 C31H53NO4 M+Na ↑ − 2.98E-05 70 1-（11Z二十二碳烯酰基）-3-磷酸甘油酯 HILIC 515.3163 C25H49O7P M+Na ↑ − 8.91E-07 注：↑表示模型组较对照组相对升高趋势，↓表示模型组较对照组相对下降趋势，P值为模型组与对照组间代谢物水平的t检验计算结果；
#表示代谢物经葛根-知母药对干预后具有回调趋势（共47个），*表示代谢物（共20个）经葛根-知母药对干预后回调差异具有统计学意义（P<0.05）。3.2.3 药物的干预效果
利用各组间的FC值变化情况判断药对干预后的回调代谢物。对于具有回调趋势的代谢物多组间变化情况进行单因素方差分析，P<0.05的代谢物确定为药对干预后显著回调的差异代谢物。结果显示，葛根-知母药对干预后出现回调的差异代谢物共计47个，其中，显著回调代谢物20个（表1和图5）。
图 5 20个显著回调代谢物在不同组间的相对信号强度*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较; #P<0.05, ##P<0.01，###P<0.001，与对照组比较。对70个AD相关的差异代谢物和葛根-知母药对干预后显著回调的20个差异代谢物分别进行通路富集分析后发现（图6），AD模型大鼠潜在疾病生物标志物涉及通路主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、酪氨酸代谢、嘧啶代谢等。葛根-知母药对干预可对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢和初级胆汁酸生物合成等通路产生回调影响。
图 6 血清差异代谢物KEGG通路富集分析A.模型组与对照组；B.葛根-知母药对干预后回调通路（1.苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；2.苯丙氨酸代谢；3.亚油酸代谢；4.不饱和脂肪酸的生物合成；5.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；6.精氨酸生物合成；7.烟酸和烟酰胺代谢；8.嘧啶代谢；9.酪氨酸代谢；10.初级胆汁酸生物合成）4. 讨论
AD是一种复杂的中枢神经系统异质性疾病，具体病因尚不明确。目前已知可导致AD的因素包括基因突变、氧化应激、神经炎症以及多种环境和疾病因素[11] 。衰老被认为是AD最相关的危险因素[12] ，啮齿类动物长期摄入D-gal可产生包括氧化应激、炎症反应在内的多种与人类相似的衰老相关变化[13] 。铝元素可通过促进中枢神经系统炎症反应、降低脑中SOD活性，影响胆碱能神经传递、促进Tau蛋白磷酸化等形式诱导神经毒性，过量铝暴露与AD等中枢神经系统退行性疾病进展相关[14] 。研究表明，D-gal与AlCl3联合应用可产生类似于自然衰老的变化及AD相关特征[15] 。因此，本研究选取D-gal与AlCl3联合造模，通过大鼠长程给药模拟和还原AD相关的病程和病理变化，力求更加精准地反映AD患者体内代谢分子水平变化。药效学实验表明，D-gal和AlCl3联合给药后大鼠学习和记忆能力明显下降，体内氧化应激和炎症相关因子水平发生变化，表明该模型成功模拟AD相关的病理变化和特征。而葛根-知母药对干预可显著改善AD模型大鼠的学习和记忆能力，并回调SOD、NO和MDA等相关生化指标，改善和回调效果优于单药，表明葛根和知母配伍后在AD防治中具有一定的增效作用，具备进一步研究的价值。
代谢组学结果表明，葛根-知母药对可以显著回调血清中20种代谢物，主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢等途径。酪氨酸是一些神经递质或者神经调节剂的前体。Liu[16]等对尸源样本进行非靶向和靶向代谢组学分析发现，AD患者海马中苯丙酮酸含量普遍上调，表明苯丙氨酸代谢失调可能是AD病理形成的重要机制。本研究同样发现AD模型大鼠血清中苯丙酮酸水平较对照组显著升高，葛根-知母药对可以显著回调苯丙酮酸至生理水平。脯氨酸是一种非必需氨基酸，参与氧化还原调控和细胞凋亡，既是活性氧（ROS）清除剂，也是ROS生产者，因此，平衡脯氨酸水平和脯氨酸相关代谢酶活性对维系细胞生理功能至关重要。脯氨酸代谢可能会通过ROS、细胞衰老和细胞免疫等机制影响神经元功能[17] 。Xu等[18]整合代谢组学与蛋白质组学结果发现，脱脂核桃粉可以通过升高小鼠脑组织中脯氨酸等多种氨基酸水平发挥对东莨菪碱诱导的AD小鼠神经保护机制。这与本实验结果相似，葛根-知母药对可以通过回调脯氨酸水平发挥AD防治作用。
此外，本研究发现多种回调代谢物与脂质代谢密切相关。花生四烯酸和α-亚麻酸是由多不饱和脂肪酸氧化产生的脂氧化物，广泛参与机体炎症、免疫等多种生理病理进程。花生四烯酸升高可进一步提高氧化应激水平，与AD等疾病进程紧密相关[19] 。AD与胆汁酸代谢异常之间存在紧密关联，这可能与肠-肝-脑轴机制相关。有研究表明AD患者血浆中胆汁酸水平升高[20] 。磷脂是保持细胞膜完整性的主要物质，溶血磷脂酰胆碱是磷脂的降解产物，与磷脂代谢密切相关，磷脂代谢异常可导致溶血磷脂酰胆碱下调，表现为细胞凋亡及信号转导异常，是AD的潜在诱因之一[21] 。本研究表明，葛根-知母药对的AD防治作用效果可能与显著回调血清中花生四烯酸、α-亚麻酸、甘胆酸、鹅去氧胆酸和溶血磷脂酰胆碱水平相关。
ROS产生与消除之间的不平衡被称为氧化应激，氧化应激是AD等疾病的关键因素和共同点。NO是ROS的一种，也是神经传递和炎症相关的重要因素。高水平ROS会触发不饱和脂肪酸的脂质过氧化，导致MDA等高反应性化合物的产生，因此MDA是脂质过氧化和氧化应激的标志。SOD是抵消ROS有害影响最有效的一线防御机制。SOD可以通过去除超氧自由基防止更具破坏力的过氧亚硝酸盐生成，并维持体内NO在生理相关水平[22, 23] 。代谢组学结果提示，葛根-知母药对回调干预的多种途径与氧化应激和脂质过氧化相关。ELISA实验结果进一步表明，葛根-知母药对干预可提高AD大鼠体内SOD水平，回调NO和MDA至生理水平，提示葛根-知母药对可以通过调节氧化应激和脂质过氧化，维持体内NO的生理水平对AD产生防治作用。
综上，本文通过建立AD大鼠模型考察了葛根-知母药对防治AD的作用效果，药对药效优于单药；运用代谢组学策略揭示其改善AD大鼠学习和记忆能力相关的潜在代谢物和代谢路径，其作用机制可能与调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等代谢通路、改善氧化应激和脂质过氧化水平等相关，为中药药对防治AD的临床应用和进一步开发提供了科学依据。
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图 2 U251多细胞生长状态图
A. 培养皿内U251细胞明场图；B. 芯片内U251多细胞球体明场图；C. 芯片内U251多细胞球体48 h 活/死细胞染色图（绿色：活细胞，红色：死细胞）；D. 芯片内U251多细胞球体活/死细胞染色结果分析图（n=6）
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