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透明质酸钠（图1）又称玻璃酸钠，是由交替的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和葡糖醛酸（GlcA）单元组成[1]的聚合物，聚合度最大的相对分子质量（Mr）可以达到107。具有高度黏弹性、可塑性、渗透性、独特的流变学特性以及良好的生物相容性等特点[2]。透明质酸钠广泛存在于人体，是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内具有保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复等重要生理功能[3]。医用透明质酸钠凝胶（HA）为无色透明黏稠液体，主要成分为透明质酸钠。HA常用于肿瘤患者术后的抗粘连，其广泛的生理学活性有可能使得肿瘤细胞易于扩增和转移，文献报道内源性的透明质酸能促进肿瘤增殖[4-6]。因此，本研究考察外源性HA是否会促进肿瘤的生长和转移，以明确HA是否可用于肿瘤患者的术后防粘连。为HA用于肿瘤患者腹、盆腔手术术后防粘连提供实验依据。
图 1 透明质酸钠的结构式
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医用透明质酸钠凝胶（HA，10 mg/ml，上海昊海生物科技股份有限公司，批号：18052122，Mr≥1.0×106），氟尿嘧啶注射液（5-Fu，上海旭东海普药业有限公司，批号：FA1800416），胎牛血清（FBS，Gibco，批号：1932595），McCoy’s 5A Medium（Gibco，批号：1967679），RPMI Medium 1640（Gibco，批号：1967664），MEM（Minimum Eagle’s Medium，HyClone，批号：AD20532472），胰酶（Trypsin，上海博光生物科技有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS，上海博光生物科技有限公司），MTT（上海博光生物科技有限公司），无水甲醇、二甲基亚砜（DMSO，国药集团化学试剂有限公司），生物胶（批号：217201N2）、小鼠结肠癌细胞（CT26，上海中西医结合医院），人宫颈癌细胞（Hela）、人结肠癌细胞（HCT116，中国科学院上海生命科学研究院）。
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裸鼠：88只，上海斯莱克实验动物有限公司，SPF级，SCXK（沪）2017-0005；64只，上海灵畅生物科技有限公司，SPF级，SCXK（沪）2018-0003），动物饲养于同济大学沪北校区（SYXK（沪）2018-0034）。所有动物实验过程均符合实验动物伦理学要求。
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酶标仪1510-00411C（Thermo），坤宏BMB224分析天平（南京伯尼塔科学仪器有限公司），ECLIPSE TE100 显微镜（Nikon），细胞培养箱（Thermo）。
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将状态良好的肿瘤细胞用胰酶消化后离心，弃上清液，分别用对应培养液重悬成单个肿瘤细胞悬液，显微镜下计数，然后分别稀释成以下浓度：Hela（2×104个/ml），CT26（5×103个/ml），HCT116（104个/ml）。取96孔板，空白对照孔接入100 μl培养液，其余各孔接入肿瘤细胞混悬液，每孔100 μl，将96孔板置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。24 h后吸弃培养液，空白对照和阴性对照孔分别加入200 μl培养液，测试孔分别加入100%HA、50%HA+50%培养液、25%HA+75%培养液、12.5%HA+87.5%培养液、6.25%HA+93.75%培养液，每孔200 μl；阳性对照孔分别加入5-Fu浓度为 16、8、4、2、1 μg/ml培养液，每孔200 μl，将加药96孔板放回培养箱培养。分别培养3、5和7 d 后，吸弃上层液体，加入含0.5 mg/ml MTT的培养液100 μl，培养4 h。避光处吸弃上层液体，每孔加入100 μl DMSO，避光反应10 min，振荡1 min，在酶标仪波长570 nm处（630 nm校准）测量各孔的吸光值。细胞存活率=（实验孔吸光值—空白对照孔吸光值）/（阴性对照孔吸光值—空白对照孔吸光值）×100%。
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将状态良好的肿瘤细胞胰酶消化、离心后，分别用对应空白培养液重悬成单个肿瘤细胞悬液，显微镜下计数，然后分别稀释成以下浓度：Hela（1.5×105 个/ml），HCT116（5×105个/ml）。分别将肿瘤细胞混悬液和HA混匀，配成50%HA+50%肿瘤细胞悬液、25%HA+50%肿瘤细胞悬液+25%空白培养液、12.5%HA+50%肿瘤细胞悬液+37.5%空白培养液、50%肿瘤细胞悬液+50%空白培养液。将肿瘤细胞和HA混合液加入Transwell上层小室中，每个小室200 μl，Transwell下层腔室分别加入含10% FBS 对应培养液 600 μl。将Transwell培养板放入培养箱，培养24 h。取出Transwell小室，轻轻吸弃小室内培养液，用PBS洗1遍，甲醇固定15 min。用棉签轻轻擦去小室内层细胞，PBS洗2遍，加入结晶紫（0.1%）染色，室温放置20 min，PBS洗3遍。显微镜10倍物镜下观察、拍照和记数。
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PBS重悬HCT116细胞，调浓度至107个/ml，将细胞接种于裸鼠皮下，每只动物0.2 ml，共12只，作为供瘤体。视肿瘤生长情况将裸鼠处死，取出瘤块，选取瘤块实质性部分，用生理盐水冲洗干净，剪成约1 mm×1 mm×1 mm 瘤块备用。
实验动物腹腔麻醉，取腹部正中切口，逐层开腹，找到盲肠位置。假手术组：将盲肠拉出后放回腹腔，逐层缝合伤口。其余组：轻轻划破结肠浆膜，用生物胶将瘤块固定在浆膜破损处。模型组和阳性对照组在瘤块接种处涂抹生理盐水0.07 ml，HA组涂抹HA 0.02 ml。逐层缝合伤口，观察记录裸鼠状态，5-Fu组腹腔注5-Fu 20 mg/kg，隔天给药，持续3周。
瘤块接种4周后将裸鼠处死，打开腹腔，用游标卡尺测量瘤块的长短径，按公式（V=ab2/2，a：瘤体最长直径；b：瘤体最短直径）计算体积，剥离瘤块，瘤块称重。
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建立裸鼠结肠原位种植结肠癌CT26模型，方法同“2.3”项。瘤块接种4 d后，5-Fu组腹腔注射氟尿嘧啶注射液50 mg/kg，隔3 d给药一次，共4次。
瘤块接种3周后将裸鼠脱颈处死，打开腹腔，观察肿瘤转移情况，取肺和肝脏，4%多聚甲醛固定、切片、HE染色，统计肿瘤转移率和转移病灶数。
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实验数据用（
${\overline x}\pm s $ ）表示，应用SPSS 21.0软件，数据进行正态性检验。符合正态分布采用one-way ANOVA统计方法进行显著性检验；不符合正态分布采用Friedman M 统计方法进行显著性检验。肿瘤转移率采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 -
在体外实验中，肿瘤细胞Hela、HCT116和CT26在100% HA中均不能生长（图2）。Hela细胞在培养3 d和5 d时不同含量HA均不影响细胞的生长，7 d时25%HA和50%HA细胞生长率低于阴性对照组（P<0.001）。HCT116细胞培养7 d时，50%HA细胞生长率低于阴性对照组（P<0.01）。CT26细胞培养3 d时12.5%HA、25% HA和50%HA细胞生长率低于阴性对照组（P<0.001）；培养5 d和7 d时，50%HA细胞生长率低于阴性对照组（P<0.001）。不同浓度5-Fu，培养3 d、5 d和7 d均抑制肿瘤细胞Hela、HCT116和CT26的生长，呈剂量相关性。
图 2 MTT法考察不同浓度HA体外对肿瘤细胞Hela、CT26和HCT116生长的影响
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Transwell实验结果显示，高浓度HA体外抑制肿瘤细胞迁移。50%HA、25%HA和12.5%HA组Hela细胞穿透数均低于阴性对照组（P<0.01），HA含量越高，Hela细胞穿透数越少；50%HA和12.5%HA组HCT116细胞穿透数均低于阴性对照组（P<0.05），25%HA组HCT116细胞穿透数低于阴性对照组，无统计学差异（图3）。
图 3 Transwell法考察对肿瘤细胞迁移的影响（100×）
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裸鼠结肠原位接种HCT116瘤块后，HA组与模型组成瘤率均为100%，结果无差异。模型组裸鼠的瘤体体积达（339.1±258.0）mm3，5-Fu组裸鼠的瘤体体积为（128.5±111.9）mm3，小于模型组（P<0.01），HA组裸鼠的瘤体体积为（293.2±190.6）mm3，与模型组比较，差异无统计学意义；模型组裸鼠的瘤重为（0.359±0.219）g，5-Fu组裸鼠的瘤重为（0.149±0.105）g，小于模型组（P<0.001），HA组裸鼠的瘤重为（0.330±0.187）g，与模型组比较，差异无统计学意义。使用一定剂量的HA在裸鼠体内不影响HCT116的成瘤率，同时也不影响HCT116肿瘤的生长（表1）。
表 1 HA在裸鼠体内对HCT116肿瘤生长的影响(
$\bar{ x}\pm { s}$ )组别 动物数（只） 成瘤数（只） 成瘤率（%） 瘤体积（V/mm3） 瘤重（m/g） 假手术组 16 0 0 0.0 ± 0.0 0.000 ± 0.000 模型组 16 16 100 339.1 ± 258.0 0.359 ± 0.219 HA组 16 16 100 293.2 ± 190.6 0.330 ± 0.187 5-Fu组 16 14 87.5 128.5 ± 111.9** 0.149 ± 0.105*** **P<0.01、***P<0.001，与模型组比较 -
裸鼠结肠原位接种CT26瘤块，观察16 d后出现动物死亡，第18天处死存活裸鼠。模型组存活率为62.5%，HA组存活率68.8%，5-Fu组存活率100%，体内使用一定剂量的HA不影响裸鼠的存活率。模型组肝脏转移率90%，平均病灶数（2.2±1.7）；5-Fu组肝脏转移率0.0%，低于模型组（P<0.001）；平均病灶数（0.0±0.0），低于模型组（P<0.001）。HA组肝脏转移率36.4%，低于模型组（P<0.05）；平均病灶数（0.6±1.0），低于模型组（P<0.01）。模型组肺转移率为40%，平均病灶数（0.5±0.7）；5-Fu肺转移率6.3%，低于模型组（P<0.05）；平均病灶数（0.1±0.3），低于模型组（P<0.05）。HA组肺转移率为18.2%，平均病灶数（0.2±0.4），与模型组均无统计学差异，见表2、图4和图5。
表 2 HA在裸鼠体内对CT26肿瘤转移的影响(
$\bar{ x}\pm { s}$ )组别 动物数（只） 成活率（%） 肝转移 肺转移 转移率（%） 病灶数 转移率（%） 病灶数 假手术组 15 100.0 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 0.0 ± 0.0 模型组 16 62.5 90.0 2.2 ± 1.7 40.0 0.5 ± 0.7 HA 组 16 68.8 36.4* 0.6 ± 1.0** 18.2 0.2 ± 0.4 5-Fu 16 100.0 0.0*** 0.0 ± 0.0*** 6.3* 0.1 ± 0.3* *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，与模型组比较 
图 4 HA体内对CT26肿瘤细胞肺转移的影响（40×）
图 5 HA体内对CT26肿瘤细胞肝转移的影响（40×）
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很多胚胎迁移和增殖速率与胚胎组织中高浓度的透明质酸有关，而肿瘤组织和胚胎发育很相似，几十年前已经提出透明质酸可能对肿瘤生长很重要[7-9]。然而，本研究的HA为外源性高分子量HA，结果与内源性透明质酸结果不一致。在体外实验中，Hela、CT26和HCT116的细胞无法在100% HA中生长，表明HA不能作为肿瘤细胞培养基。此外，细胞生长速率随着HA的增加而不同程度的降低，说明高浓度HA可以抑制肿瘤生长，在低浓度时虽然没有明显的抑制作用，但也未促进肿瘤的增殖。体内结果证明，外源性HA对肿瘤细胞的生长无促进作用。
内源性低分子质量透明质酸（low molecular weight hyaluronan，LMWHA）可诱导细胞运动[10-11]，促进血管生成，增加炎症免疫刺激和诱导高尔基体应激的能力[12]，从而能促进肿瘤的迁移。而Aikaterini等[13-14]研究显示，透明质酸酶2(Hyal-2)低表达同时透明质酸合成酶（HAS1和HAS2）表达增高，导致产生高分子量透明质酸（high molecular weight hyaluronan，HMWHA）并在HT1080细胞的周围基质中沉积蓄积，结果HT1080细胞迁移能力显著降低，同时外源性HMWHA显著抑制HT1080细胞的迁移，当加入透明质酸酶后，HT1080细胞运动性显著增加。外源性透明质酸会促进透明质酸合成酶高表达[15]，促进内源性HA合成作用，使机体合成HMWHA。本研究建立裸鼠原位种植瘤转移模型，结果HA组结肠癌的肝转移率在体内低于模型组（P<0.05）。HA在体内能抑制肿瘤的转移，可能与外源性HA能促使机体合成HMWHA有关。
本研究的主要目的是探讨HA是否会对腹部和盆腔肿瘤患者产生不良影响。结果表明，外源性HA未见对上述肿瘤的增殖有促进作用，在转移模型中HA表现出一定的抑制肿瘤迁移的作用，符合HA在肿瘤患者中应用的要求,但其机制还需进一步研究。
The effects of medical sodium hyaluronate gel on the tumor proliferation and metastasis
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摘要:
目的 考察医用透明质酸钠凝胶（medical sodium hyaluronate gel，HA）在体外和裸鼠体内对腹、盆腔相关肿瘤生长和转移的影响。 方法 利用Hela、CT26和HCT116等3株肿瘤细胞，通过MTT法和Transwell实验分别考察不同浓度HA体外对肿瘤细胞生长和迁移的影响；建立裸鼠结肠原位种植瘤模型，比较瘤块接种4周后不同实验组的瘤块体积和瘤重，考察HA体内对结肠癌HCT116增殖的影响；通过比较接种3周后不同实验组裸鼠的肺和肝脏的肿瘤转移率和转移病灶数，考察HA对结肠癌CT26体内转移的影响。 结果 不同浓度HA在体外均未促进Hela、CT26和HCT116细胞的生长和转移，且在5 mg/ml HA浓度下，显示出一定的抑制作用。体内结果显示，HA未促进结肠癌HCT116肿瘤的生长，却显示出明显抑制CT26肿瘤的转移。 结论 在本实验条件下，HA在体内、外均未促进腹、盆腔相关肿瘤细胞Hela、CT26和HCT116的生长、迁移和转移。 Abstract:Objective To investigate the effect of medical sodium hyaluronate gel (HA) on the growth and metastasis of abdominal and pelvic tumor cells in vitro and in nude mice. Methods Three tumor cells, Hela, CT26 and HCT116, were used to investigate the effects of different HA concentrations on the growth and migration of tumor cells in vitro by MTT assay and Transwell assay. An orthotopic transplantation model of colonic tumor in nude mice was established to investigate the effect on the proliferation of cell HCT116 by comparing the tumor volume and tumor mass 4 weeks after inoculation. The effects on the metastasis of cell CT26 were investigated by comparing the tumor metastasis rate and the number of metastatic lesions of lung and liver in nude mice among the different experimental groups 3 weeks after inoculation. Results HA did not promote the growth and metastasis of Hela, CT26 and HCT116 cells in vitro at different concentrations. Actually, HA exhibited a certain inhibitory activity at the concentration of 5 mg/ml. In the orthotopic transplantation model of colonic tumor-HCT116, HA did not promote the growth of cell HCT116. In the orthotopic transplantation model of colonic tumor-CT26, HA inhibited CT26 tumor metastasis. Conclusion Under the experimental conditions, HA did not promote the growth, migration or metastasis of abdominal and pelvic related tumor cells including Hela, CT26 and HCT116 in vitro and in vivo. -
生脉注射液临床上常用于辅助治疗心肌梗塞、心源性休克、脓毒症和感染性休克。心肌梗塞引起组织产生大量氧自由基，直接损伤心肌细胞并触发细胞凋亡，免疫介导的炎症损伤会加大心梗范围和心梗损伤[1]。心源性休克激活的炎症反应可诱导产生大量NO，促进细胞凋亡[2]。脓毒血症是由细菌引起的全身性炎症，大量致炎因子破坏机体的免疫平衡，从而导致机体代谢紊乱[3]，严重者可能引起感染性休克。本研究特选择抗氧化及抗炎能力作为生物效应指标，考察生脉注射液质量与生物效应之间的相关性。
课题组前期对生脉注射液中11种成分[4]进行了指认并进行了定量，均符合药典标准。药理学实验表明，生脉注射液中人参皂苷、木质素和麦冬皂苷等多种化学成分均在细胞及动物模型上表现出良好的抗炎效果[5-8]，且临床研究表明其可以通过抗炎通路发挥对器官损伤的保护作用[9-10]。现今生物效应评价在中药材和中成药质量控制研究中有所应用[11-12]，2015版《中国药典》收录了生物活性测定法作为质量控制标准，如洋地黄生物测定法和黄体生成素生物测定法，说明通过生物效应控制药品质量是可行的。
抗炎和抗氧化损伤是生脉注射液产生药理作用的重要机制，但现今的质量标准仅对化学成分进行定性定量分析，不能全面体现其整体的药效活性，为此，本研究尝试通过评价其抗氧化能力以及抗炎活性，建立有效的生脉注射液生物学质量控制方法。
1. 材料
1.1 试剂与药品
二苯基苦基苯肼（DPPH，质量分数≥97%，含10%～20%苯，批号：PRPDE-JO，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；水溶性维生素E (Trolox)、DMEM培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自北京Solarbio公司；胎牛血清（FBS，德国PAN Seratech公司）；N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；无水乙醇（北京化工厂）；水（屈臣氏）。
9批次生脉注射液分别由5个不同厂家生产，样品详细情况见表1。
表 1 生脉注射液样品来源、批号及有效成分含量(μg/ml)[4]编号 生产厂家 批号 规格 人参皂苷Rb1 人参皂苷Re 人参皂苷Rg1 五味子醇甲 麦冬皂苷D S1 A 16120401005 10 ml/支 61.16 51.39 84.69 51.43 1.48 S2 B 160502 10 ml/支 101.69 55.61 88.99 73.09 3.42 S3 C 17071014 10 ml/支 56.99 44.87 80.42 36.78 1.68 S4 C 17040423 20 ml/支 63.12 44.51 81.54 39.63 1.28 S5 D 1704252 20 ml/支 77.15 62.10 86.11 29.05 3.62 S6 E 17091302 10 ml/支 85.52 57.74 88.45 33.55 1.40 S7 E 17092903 10 ml/支 80.43 41.52 86.36 37.30 1.33 S8 E 17061103 20 ml/支 74.88 61.06 80.00 35.18 1.72 S9 E 17053005 20 ml/支 79.97 48.54 80.34 44.83 1.59 1.2 主要仪器及设备
电子分析天平（AB265-S，梅托勒-托利多有限公司）；超声波清洗仪（B25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）；TS-2000A脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；96孔板、多功能连续波长酶标仪（InfiniteM1000，TECAN公司）；低速离心机（SC-3610，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（MCO-15AC，三洋电机株式会社）。
1.3 细胞培养
RAW264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。培养条件：完全培养基为含10%FBS的DMEM培养基，在37℃含5% CO2的培养箱中培养。每天换液，细胞生长达对数生长期时，传代（传代比例为1:6）并开展实验，实验用细胞控制在10代以内。
2. 方法与结果
2.1 DPPH法评价生脉注射液质量
2.1.1 实验过程
取96孔板，每孔依次加入100 μl初浓度2.0%的受试液、100 μl 0.5 mmol/L DPPH溶液，震荡均匀后避光反应20 min。
测定方法：每孔依次加入100 μl受试液和DPPH溶液，在摇床上振荡均匀，避光反应20 min后，用酶标仪测定波长在517 nm处的吸光度。
2.1.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：分别吸取样品编号为S9的药液，用纯水定容得到浓度为8%的生脉注射液受试液。逐级稀释，测定其吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到的线性关系方程为Y=-0.2081X+1.2209（r=0.9996）（图1-A），表明生脉注射液具有较强的DPPH自由基清除能力且具有浓度依赖性，体积浓度和平均吸光度具有良好的线性关系，在0%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为2.25%（见表2），表明该方法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照"2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.21%（见表2），表明该方法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S9，分别于0、4、8、24、48和72 h，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.47%（见表3），表明该方法在72 h内稳定性良好。
图 1 生脉注射液抗氧化生物活性评价A. 生脉注射液对DPPH清除作用的标准曲线；B. Trolox对DPPH清除作用的标准曲线；C. 1.0%各批次生脉注射液相当于Trolox的量（mmol/L）表 2 1.0%生脉注射液对DPPH清除作用的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 1.063 4 1.087 9 2.25 1.138 9 1.135 6 2.22 2 1.115 6 1.175 6 3 1.098 3 1.135 7 4 1.114 3 1.096 7 5 1.064 9 1.129 2 6 1.070 9 1.137 7 表 3 1.0%生脉注射液对DPPH的清除作用的稳定性时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 1.038 5 1.078 8 2.47 4 1.105 7 8 1.072 2 24 1.080 5 48 1.065 7 72 1.110 0 2.1.3 生脉注射液抗氧化生物活性的质量评价
精密称定Trolox，加入100 μl无水乙醇溶解，纯水定容，得到初浓度为15.46 mmol/L的Trolox溶液。将其逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到的线性关系方程为Y=–0.0789X+1.1674（r=0.9951）（见图1-B），表明Trolox清除DPPH能力在作用浓度0.43~5.56 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液清除DPPH自由基的结果与Trolox比较，折算得到各批次生脉注射液相当于水溶性Trolox的作用浓度（见图1-C）。结果表明，终浓度1.0%的各批次生脉注射液清除自由基能力相对于Trolox作用浓度范围为1.2~1.9 mmol/L，在清除自由基即抗氧化能力方各批次不存在较大差异。
2.2 Griess试剂盒评价生脉注射液的抗炎活性
2.2.1 Griess试剂盒测定生脉注射液抑制NO释放能力
使用完全培养基配制为1.2%的生脉注射液样品溶液，及初浓度100μg/ml的LPS样品溶液。
取对数生长期的RAW264.7细胞，制备成2×106个/ml的细胞悬液，以每孔100 μl注入96孔板。培养24 h后，弃去培养基，每孔加入100 μl样品溶液和100 μl的LPS溶液，孵育24 h后吸取50 μl上清液，按照Griess试剂盒说明书操作，用酶标仪测定波长540 nm处的吸光度。
2.2.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：精密吸取样品编号为S6的药液，用完全培养基制成浓度为4.0%的溶液。逐级稀释，测定吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性方程为Y=–0.033ln(X)+0.243（r=0.9961）（见图2-A），表明生脉注射液具有良好的NO分泌抑制能力并具有浓度依赖性，终浓度和平均吸光度之间具有良好的线性关系，在0.2%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为1.71%（见表4），表明该法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.79%（见表4），表明该法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S6，分别于0、4、8、24和48 h时，配制得到浓度1.2%的溶液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.66%（见表5），表明该方法在48 h内稳定性良好。
图 2 生脉注射液抗炎活性评价A. 生脉注射液对RAW264.7细胞分泌NO的标准曲线；B. L-NAME对RAW 264.7细胞分泌NO的标准曲线；C. 0.60%各批次生脉注射液相当于L-NAME的量（mmol/L）表 4 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 0.276 0 0.272 9 1.71 0.272 9 0.285 0 2.79 2 0.272 3 0.281 1 3 0.265 0 0.289 0 4 0.276 1 0.291 6 5 0.275 0 0.290 6 表 5 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的稳定性考察时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 0.264 5 0.262 3 2.66 2 0.273 6 4 0.257 4 24 0.257 4 48 0.258 6 2.2.3 生脉注射液抗炎生物活性的质量评价
精密称定eNOS抑制剂L-NAME，逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作，测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性关系方程为Y=–0.052ln(X)+0.152（r=0.9957）（见图2-B），表明L-NAME抑制NO分泌能力在0.05~0.55 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液抑制NO分泌能力的结果与L-NAME比较，折算得到各批次生脉注射液相对于L-NAME的作用浓度（见图2-C）。
结果显示，除S2和S8样品外，终浓度0.6%的各批次生脉注射液对应的L-NAME浓度范围均在0.06~0.16 mmol/L范围内，表明在抑制NO分泌能力即抗炎能力方面S2和S8与其他样品存在较大差异。其中S2对应的L-NAME浓度远高于其他样品，其抗炎活性远高于其他样品组，推测这可能与化学成分含量差异有关，需要后续的实验加以证实。
3. 讨论
3.1 实验方法及阳性对照药的选择
测定抗氧化活性常用的方法有氧化自由基吸收能力（ORAC）、二苯基苦基苯肼（DPPH）法和总抗氧化能力检测（ABTS）法等，本实验首先采用DPPH法测定抗氧化能力，该方法操作简便，常用于体外评价化合物的抗氧化活性，其中Trolox和维生素C是常用的抗氧化剂对照药[13-14]，但相较之下，Trolox可通过清除自由基产生抗氧化机制，且具有剂量依赖性[15]，而维生素C稳定性较Trolox差，所以该方法选择了该药作为阳性对照。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）诱导产生NO是NO产生的重要途径[16]，L-NAME作为eNOS抑制剂，选择其作为对照药可以更加直观地评价药物对细胞产生NO的抑制能力。
3.2 结果分析
参考2015版药典生物测定方法，该试验通过测定生脉注射液的抗炎和抗氧化能力，初步建立了生脉注射液的生物效应质量控制方法，该方法不仅能满足方法学要求，而且可以克服现行质量控制方法的局限性，还可以有效的评价中药复方制剂在治疗过程中产生的效应强度，实现“质-量-效”的有效结合[17]。
4. 展望
中药复方是一个组分复杂，不仅化学成分复杂，未知组分众多，而且其可能通过不同成分的配伍产生作用机制，即其药理机制不是单一化学成分能够阐明的，因此，仅对中药复方的化学成分进行评价难以对其成分及作用进行全面阐述。生物效应质量控制方法能对中药复方的整体组分药效进行把控，从药理活性方面评价中药复方质量，弥补现有质控方法的不足。在生物效应质控方法建立过程中，应注意以下问题：①质控方法应根据药效及药理机制研究选择合适的生物效应指标，充分反映该药的药理活性特征；②选择的对照药应具有足够的专属性、关联性和可测性，能够充分准确地反映药物的生物效应[18-20]。参考已有的生物质量控制研究[11，21]并对生脉注射液可能的药理活性进行筛选，对此进行考察。重点考察其方法学验证，结果显示该方法可行性高，方法学符合生物效应评价要求，可以反映生脉注射液的整体生物效应。但抗炎活性的测定实验要求较高的实验操作，且该方法对中药复方的整体生物活性进行测定，并未对可能产生药理活性的化学组分和含量进行探究和测定，可能产生药理活性的化学成分及作用机制尚不明确，值得后续的探讨。
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图 2 MTT法考察不同浓度HA体外对肿瘤细胞Hela、CT26和HCT116生长的影响
A. Hela（2×103个/孔）；B. HCT116（1×103个/孔）；C. CT26（5×102个/孔）；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，与阴性对照组比较
表 1 HA在裸鼠体内对HCT116肿瘤生长的影响(
$\bar{ x}\pm { s}$ )组别 动物数（只） 成瘤数（只） 成瘤率（%） 瘤体积（V/mm3） 瘤重（m/g） 假手术组 16 0 0 0.0 ± 0.0 0.000 ± 0.000 模型组 16 16 100 339.1 ± 258.0 0.359 ± 0.219 HA组 16 16 100 293.2 ± 190.6 0.330 ± 0.187 5-Fu组 16 14 87.5 128.5 ± 111.9** 0.149 ± 0.105*** **P<0.01、***P<0.001，与模型组比较 
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表 2 HA在裸鼠体内对CT26肿瘤转移的影响(
$\bar{ x}\pm { s}$ )组别 动物数（只） 成活率（%） 肝转移 肺转移 转移率（%） 病灶数 转移率（%） 病灶数 假手术组 15 100.0 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 0.0 ± 0.0 模型组 16 62.5 90.0 2.2 ± 1.7 40.0 0.5 ± 0.7 HA 组 16 68.8 36.4* 0.6 ± 1.0** 18.2 0.2 ± 0.4 5-Fu 16 100.0 0.0*** 0.0 ± 0.0*** 6.3* 0.1 ± 0.3* *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，与模型组比较
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