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基于正交试验和响应曲面法优化复方金钱草颗粒提取工艺

潘鹏超 陈啸飞 谌卫 郭志勇 柴逸峰

魏雨辰, 田家盛, 王道鑫, 凌期盛, 王治, 缪朝玉. 烟酰胺单核苷酸口服给药对高血压大鼠的影响[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202412006
引用本文: 潘鹏超, 陈啸飞, 谌卫, 郭志勇, 柴逸峰. 基于正交试验和响应曲面法优化复方金钱草颗粒提取工艺[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(1): 27-34. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201910001
WEI Yuchen, TIAN Jiasheng, WANG Daoxin, LING Qisheng, WANG Zhi, MIAO Chaoyu. The effects of nicotinamide mononucleotide on hypertensive rats[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202412006
Citation: PAN Pengchao, CHEN Xiaofei, CHEN Wei, GUO Zhiyong, CHAI Yifeng. Optimization of the compound herba lysimachiae extraction prosess based on orthogonal experiment and response surface method[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(1): 27-34. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201910001

基于正交试验和响应曲面法优化复方金钱草颗粒提取工艺

doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201910001
基金项目: 国家自然科学基金(81573396,81973291,81573759)

Optimization of the compound herba lysimachiae extraction prosess based on orthogonal experiment and response surface method

  • 摘要: 目的 采用正交试验和响应面分析法优化复方金钱草颗粒的提取工艺。 方法 以复方金钱草颗粒中多个代表性成分的峰面积之和为评价指标,应用正交试验及Box-Behnken响应面分析法对超声提取时间、超声温度以及乙醇比例3个提取条件进行3因素3水平回归分析,优化最佳提取条件。 结果 超声提取时间和乙醇比例是复方金钱草颗粒提取工艺的重要因素,超声温度对其提取效果作用不明显。复方金钱草颗粒的最佳提取条件为超声提取时间10 min,超声温度55 ℃,乙醇比例55%。 结论 结合正交试验以及Box-Behnken响应面分析法得到的最佳提取工艺参数,可用于复方金钱草颗粒代表性成分的提取以及后续的药学研究。
  • 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是一种重要的代谢产物,其参与许多生化过程,如能量代谢、基因表达调控、DNA修复等[1, 2]。人体皮肤、血液、肝脏、肌肉和大脑中的NAD+浓度会随着年龄的增长而降低,因此,增强NAD+可能在缓解相关的细胞功能和整体健康受损方面发挥关键作用[3]。烟酰胺单核苷酸(NMN)是NAD+生物合成的前体。体内外研究表明,补充NMN可以提高NAD+水平[4]。NMN可以缓解各种心脑血管疾病的发展,包括中风[5]、心力衰竭[6]和心肌缺血等[7]。此外,NMN还与改善线粒体功能和潜在的抗衰老益处有关[8]。几项临床试验探索了NMN补充剂的有效性和安全性(标识号:NCT04228640[9],NCT04823260[10],UMIN000036321[11][8],证明了其对心血管保护的潜力。然而,NMN的研究仍然缺乏大规模可靠的人体试验数据,特别是关于其治疗高血压等特定疾病的疗效问题。虽然早期研究显示了一些有希望的结果,但需要更广泛的基础研究和临床试验来证实其在不同患者群体中的疗效和安全性。

    高血压是一系列健康问题的重要危险因素,包括心脏、肾脏疾病以及中风等脑血管疾病[12],影响着全世界数百万人[13]。高血压的危险在于,随着时间的推移会导致靶器官损伤,发生如动脉粥样硬化、肾功能衰竭、心力衰竭和中风等疾病。高血压的发生与衰老和肥胖等因素有关,而这两者都源自于NAD+缺乏。因此,NAD+已成为高血压的潜在治疗靶点。

    目前关于NMN对高血压的影响研究相对有限。只有一项临床前实验表明NMN可以降低血管紧张素II(Ang II)诱导的高血压小鼠的血压[14]。另有一项临床研究表明,补充NMN可以降低高血压患者的血压(标识号:NCT04903210[14])。然而,目前的证据不足以将NMN开发为抗高血压药物,特别是其缺乏较为全面的临床前药效评价。因此需要更严格的研究来确定NMN是否能作为高血压治疗药物。自发性高血压大鼠(SHR)是一种遗传性高血压模型动物,常用于评估抗高血压药物[15-17]。双肾双夹(2K2C)大鼠是一种实验性易卒中肾血管性高血压模型动物,这些大鼠在术后2周内100%发生高血压[15, 16],也常用于评估抗高血压药物。本次研究中,我们采用单次胃瘘给药和长期药物饲料喂养方式给予受试大鼠NMN治疗,观察NMN对原发性和继发性高血压大鼠模型的血压和器官损伤的影响。此外,我们还观察了终身给药NMN对2K2C大鼠模型死亡率和寿命的影响[15]

    Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(160~180 g)购于上海必凯科翼生物科技有限公司。2K2C大鼠由SD大鼠双侧肾动脉嵌套0.2 mm内径的U型银夹制作而成。雄性SHR(250~290 g)购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

    所有大鼠均饲养于独立通气笼盒(IVC)系统中,饲养温度为24±2°C,相对湿度为40%~60%,照明时间为8:00~20:00,自由饮食和饮水(特定情况除外)。本实验研究严格遵守实验动物福利等伦理原则。

    NMN(批号2021046B)由尚科生物医药(上海)有限公司提供,氯沙坦钾(Losartan)(批号LOSB-4-06210326)由浙江美诺华药业股份有限公司提供,戊巴比妥钠购于德国Merck公司,注射用青霉素钠购于山东鲁抗医药股份有限公司,肝素钠(批号H3v60)购于上海博光生物科技有限公司,EVG弹力纤维染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。

    U型银夹(0.2 mm内径)、血压与心率分析系统(型号MPA-HBBS)购于上海奥尔科特生物科技有限公司,聚乙烯导管购于法国Biotrol公司。

    1.3.1   实验分组和治疗方案

    NMN单次给药治疗研究:包括SHR和2K2C大鼠两种模型,在各自模型实验中,大鼠均被随机分配为对照组(蒸馏水)和NMN给药组(200 mg/kg),并通过胃瘘导管给药。

    NMN长期给药(4周)治疗研究:包括SHR和2K2C大鼠两种模型,在各自模型实验中,大鼠均被随机分配为对照组(普通饲料)和NMN给药组[药物饲料,等效NMN剂量200 mg/(kg·d)]。

    生存时间观察研究:采用2K2C大鼠模型,实验包括假手术组(正常SD大鼠,普通饲料)和2K2C造模组,2K2C造模组大鼠再被随机分为模型组(普通饲料)、氯沙坦给药组[药物饲料,等效剂量20 mg/(kg·d)]和NMN给药组[药物饲料,等效剂量200 mg/(kg·d)]。

    1.3.2   2K2C大鼠模型制备

    2K2C模型是通过在正常SD大鼠的两个肾动脉上放置0.2 mm尺寸的银夹后造成的高血压模型,参考本教研室文献及方案[16,17]。简言之,SD大鼠用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉,腹部切口,轻轻翻转肾脏,游离出肾动脉后放上内径为0.2 mm的U形银夹。在另一侧肾脏重复相同步骤。小心复位肾脏和周围组织。假手术的大鼠进行相同的操作至游离血管步骤,但不放置U形银夹。以上步骤完成后,滴加青霉素,缝合。然后将大鼠放在电热毯上,苏醒后送回IVC系统笼。

    1.3.3   胃瘘给药操作方法

    用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠,腹部区域脱毛并消毒,自剑突下沿腹部中间切口2 cm,使用无菌棉签将胃轻轻拉出,于近幽门段并且避开血管作荷包预缝合,预留区域内戳出小孔,迅速将胃瘘导管缠有胶布端插入胃内,拉紧预缝合线固定导管,经背部皮下牵引至颈后穿出并固定。随后,将胃瘘导管以大鼠马甲方式固定于背部防止动物清醒后抓咬。手术完成后,动物于电热毯上保温至复苏。

    1.3.4   清醒自由活动测量血压

    参考本教研室文献及方案[15, 16],用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠,左侧腹股沟区域脱毛并消毒,并沿股动脉方向切开皮肤,暴露股动脉。游离出一段股动脉,插入特制的PE测压导管,导管前端依次穿行过股动脉、髂总动脉并最后进入腹主动脉,此时测得血压为腹主动脉血压,导管的另一端沿皮下穿行至颈部背侧皮肤后穿出,用自制马甲固定,缝合伤口。术后,大鼠饲养于测量系统笼里适应环境,自由饮食和饮水。24 h后,测压导管连接压力传感器,经MPA-HBBS数据分析系统处理后将压力信号转化为血压波形显示在电脑屏幕上。同时以0.3 ml/h的速率连续输注25 U/ml肝素钠,以防止测压过程中凝血。

    NMN单次给药实验中,大鼠股动脉插管手术后次日上午9:00开启测量系统,连续记录血压和心率信号。12:00,通过胃管给予相应的药物(NMN或蒸馏水)。连续记录24 h血压和心率变化(取给药前1 h的数据作为基础血压和心率)。NMN长期给药实验中,NMN给药组和对照组的大鼠同样使用上述方法进行血压和心率测量,并连续记录2 h。

    1.3.5   器官大体形态学和病理形态学分析

    在完成血压和心率测量后,大鼠再次麻醉并迅速打开胸腔,用4 ℃预冷的生理盐水对大鼠进行心脏灌注。取出脑、肝脏、心脏、肾脏和主动脉(从左锁骨下动脉分支到横膈膜段),测量器官重量,以及主动脉长度、左心室壁厚度、肾皮质和髓质厚度。随后,将脑、心脏、主动脉、和肾脏用4%多聚甲醛固定,并进行病理形态学分析,包括EVG、苏木素-伊红(HE)和Masson染色[18]

    1.3.6   统计学分析

    所有实验数据均以“均值±标准误(mean±SEM)”表示。使用GraphPad Prism 10软件进行统计分析。使用非配对Student-t检验进行组间比较,生存曲线使用Log-rank检验分析。以P<0.05为具有统计学差异。

    SHR是一种原发性高血压大鼠模型,单次给予200 mg/kg NMN后,2 h内,NMN给药组和溶剂对照组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率没有显著差异(图1:A-D)。对NMN给药后2 h和24 h内的区间血压进行测量分析,两组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率均值也没有显著差异(图1:E-H)。

    图  1  单次NMN治疗对SHR的血压、心率及靶器官损伤的影响(n=5)
    A-D. 单次给药后2 h内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率的动态测量值;E-H. 单次给药前和给药后2、24 h区间内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率平均值;I. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量;J. 主动脉重量与长度比;K. 左心室壁厚度;L. 肾皮质与髓质厚度比;M. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图

    高血压还可导致心室肥大、主动脉增厚、肾脏皮质萎缩等靶器官损伤。进一步比较两组大鼠的器官损伤程度,与溶剂对照组相比,NMN给药组的脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的器官相对重量没有显著变化(图1:I)。同时,两组在主动脉重量与长度比、左心室壁厚度和肾皮质与髓质厚度比方面也没有显著差异(图1:J-L)。

    对脑血管进行EVG染色,两组大鼠的弹力纤维均清晰、完整,没有发生显著的病理损伤;对心脏进行Masson染色,也没有发现NMN可以改善血管周围的胶原纤维分布;对主动脉和肾脏进行HE染色,同样没有发现NMN减轻主动脉厚度或改善肾小球萎缩等病变(图1:M)。这些结果表明,在SHR模型中,单次给药NMN对血压或器官保护方面没有治疗作用。

    高血压是一种慢性疾病,进一步在SHR模型上长期给予NMN药物饲料喂养4周,等效剂量为200 mg/(kg·d),以评估其对血压和器官损伤的影响。与对照组相比,长期NMN药物饲料治疗组的大鼠体重没有显著变化,但第4周时,NMN给药组大鼠的进食量显著增加(图2:A-B)。NMN药物饲料喂养4周后,对照组和NMN给药组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率均没有显著差异(图2:C-F)。

    图  2  长期NMN治疗对SHR的血压和心率的影响(n=5)

    比较两组大鼠的器官损伤程度,与NMN单次给药治疗的结果相似,NMN药物饲料治疗4周依然没有显著的靶器官保护作用(图2:G-K)。这些结果表明,在SHR模型中,NMN长期给药也没有降低血压或器官保护作用。

    2K2C大鼠模型是继发性高血压的实验室模型,通过2K2C手术造模后,大鼠血压明显升高[16],进一步研究了在2K2C大鼠模型中单次给药200 mg/kg NMN的治疗效果。与SHR模型中观察到的结果一致,与对照组相比,单次给药NMN后2 h或24 h内对血压和心率没有影响(图3:A-H)。2K2C大鼠单次服用NMN后,脑、心脏、肾脏和主动脉等组织的形态学评估和病理染色也没有显示出任何器官保护作用(图3:I-M)。这些结果表明,在2K2C模型中,单次给药NMN对血压或器官保护方面也没有显著影响。

    图  3  单次NMN治疗对2K2C大鼠的血压、心率和器官损伤的影响(n=5)
    A-D. 单次给药后2 h内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率的实时测量值;E-H. 单次给药前和给药后2、24 h区间内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率平均值;I. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量;J. 主动脉重量与长度比;K. 左心室壁厚度;L. 肾皮髓质厚度比;M. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图

    在2K2C模型中长期给予NMN 200 mg/(kg·d),与对照组相比,长期NMN治疗组的体重没有显著变化,尽管第4周的进食量明显减少(图4:A-B)。连续给予NMN 4周后,测量两组大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率,没有观察到显著差异(图4:C-F)。形态学评估,包括脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量;主动脉重量与长度比;左心室壁厚度、和肾皮质与髓质厚度比;结合EVG、Masson和HE染色,两组之间没有显著差异(图4:G-K)。这些结果表明,在2K2C模型中,长期给药NMN对血压或器官保护也没有显著影响。

    图  4  长期NMN治疗对2K2C大鼠的血压和心率的影响(n=5)
    A.体重;B. 进食量;C-F. 长期给药4周后的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率;G. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量;H. 主动脉重量与长度比;I. 左心室壁厚度;J. 肾皮髓质厚度比;K. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图*P<0.05,NMN给药组与对照组比较。

    NMN在多种病理生理过程中起着重要作用[10]。进一步考察终身服用NMN是否可以延长2K2C高血压大鼠的存活时间。治疗期间,各组大鼠的体重或进食量没有显著差异(图5:A-B)。与假手术组相比,2K2C模型大鼠的存活时间显著减少,经氯沙坦治疗后,2K2C大鼠的存活时间显著延长。而NMN治疗的2K2C大鼠生存曲线与模型组没有显著差异(图5C)。以上结果表明,在2K2C模型中,NMN没有延长高血压大鼠存活时间的作用。

    图  5  长期NMN治疗对2K2C大鼠存活时间的影响(n=25~27)
    A. 体重;B. 进食量;C. 生存曲线***P<0.001,与假手术组比较;###P<0.001,与模型组比较;▲▲P<0.01,NMN给药组与氯沙坦给药组比较,C图中均使用Log-rank检验方法。

    本研究使用两种成熟的高血压大鼠模型:SHR和2K2C大鼠模型,探讨了NMN对高血压的可能影响。研究结果表明,在上述模型中,单次或长期NMN治疗均未显示出显著的抗高血压和保护器官损伤作用,也没有延长生存时间的作用。

    高血压对健康存在重大威胁,会导致严重的并发症,如心脏疾病、中风和慢性肾病等。抗高血压治疗在高血压的管理中至关重要。氯沙坦是一种经典的抗高血压药物,能够特异性拮抗血管紧张素II的AT1型受体,并在2K2C和易卒中自发性高血压大鼠(SHR-SP)模型中被证明存在降低血压,减轻器官损伤,延长存活时间的作用[15, 19]。因此,我们选择氯沙坦作为阳性对照药物,它显著延长了高血压大鼠的存活时间。相比之下,NMN并没有延长高血压大鼠的存活时间。此外,在2K2C大鼠和SHR模型中,无论是单次治疗还是长期治疗,NMN对高血压和器官损伤都没有影响。

    在最近的一项研究中,在AngⅡ诱导的高血压小鼠模型中证明了NMN有抗高血压和器官保护作用[14]。有几个因素可能导致我们的发现与该团队的发现之间存在差异,如动物模型、给药方案、NMN给药时间和血压测量方法的变化,特别是所用模型之间的差异,SHR和2K2C大鼠模型更广泛地用于评估抗高血压药物的效果。我们使用了与该团队近似的药物剂量进行单次和长期给药来评估NMN药效,但该团队只研究了长期给药。此外,实验动物的血压测量方法可能是观察到结果差异的重要原因。在本研究中,我们采用更为准确的清醒自由活动大鼠血压测定方法,而该团队采用了非侵入性尾套法。总的来说,我们直接评估了NMN对SHR和2K2C大鼠经典高血压模型中高血压和器官损伤的影响,发现NMN对高血压大鼠的血压和器官损伤没有治疗作用。

    同时,氯沙坦的降血压作用已多次被我们证实,例如,在2K2C模型上,长期给药氯沙坦4周,收缩压降低约40 mmHg[15],并且氯沙坦的降压作用被国内外广泛证明。因此研究NMN治疗对血压的影响实验中,不设氯沙坦阳性药对照组。而前期我们未证明过氯沙坦对大鼠寿命的影响,因此选择氯沙坦作为阳性对照药物,发现它显著延长了高血压大鼠的存活时间。

    关于文中NMN剂量的选择,目前,NMN在各种人群中通常用作营养保健品,剂量范围为50~150 mg/d[20]。小鼠常用NMN剂量为300 mg/kg,对应大鼠剂量约为200 mg/kg,对应人(70 kg)剂量为33 mg/kg;临床试验剂量最大一般设为900 mg/d[21],因此,上述剂量已是较大剂量,若再尝试加大剂量没有实际应用价值,故未设计再高剂量组。

    综上,本研究评估了单次和长期NMN治疗对SHR和2K2C大鼠模型中高血压和器官损伤的影响。结果表明,NMN对高血压大鼠的血压、器官损伤和寿命均没有影响,这些发现为NMN的未来临床研究提供了有价值的见解和参考。

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-10-08
  • 修回日期:  2019-12-05

基于正交试验和响应曲面法优化复方金钱草颗粒提取工艺

doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201910001
    基金项目:  国家自然科学基金(81573396,81973291,81573759)

摘要: 目的 采用正交试验和响应面分析法优化复方金钱草颗粒的提取工艺。 方法 以复方金钱草颗粒中多个代表性成分的峰面积之和为评价指标,应用正交试验及Box-Behnken响应面分析法对超声提取时间、超声温度以及乙醇比例3个提取条件进行3因素3水平回归分析,优化最佳提取条件。 结果 超声提取时间和乙醇比例是复方金钱草颗粒提取工艺的重要因素,超声温度对其提取效果作用不明显。复方金钱草颗粒的最佳提取条件为超声提取时间10 min,超声温度55 ℃,乙醇比例55%。 结论 结合正交试验以及Box-Behnken响应面分析法得到的最佳提取工艺参数,可用于复方金钱草颗粒代表性成分的提取以及后续的药学研究。

English Abstract

魏雨辰, 田家盛, 王道鑫, 凌期盛, 王治, 缪朝玉. 烟酰胺单核苷酸口服给药对高血压大鼠的影响[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202412006
引用本文: 潘鹏超, 陈啸飞, 谌卫, 郭志勇, 柴逸峰. 基于正交试验和响应曲面法优化复方金钱草颗粒提取工艺[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(1): 27-34. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201910001
WEI Yuchen, TIAN Jiasheng, WANG Daoxin, LING Qisheng, WANG Zhi, MIAO Chaoyu. The effects of nicotinamide mononucleotide on hypertensive rats[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202412006
Citation: PAN Pengchao, CHEN Xiaofei, CHEN Wei, GUO Zhiyong, CHAI Yifeng. Optimization of the compound herba lysimachiae extraction prosess based on orthogonal experiment and response surface method[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(1): 27-34. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201910001
参考文献 (16)

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