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![](data:image/svg+xml,<svg xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' width='210' height='179'><foreignObject width='2000' height='100%'><div xmlns='http://www.w3.org/1999/xhtml' style='font-size:16px;font-family:Helvetica'><table>
<thead><tr><td class="table_top_border" align="center" valign="middle">组别</td><td class="table_top_border" align="center" valign="middle">例数</td><td class="table_top_border" align="center" valign="middle">肝气郁结</td><td class="table_top_border" align="center" valign="middle">肝郁脾虚</td><td class="table_top_border" align="center" valign="middle">气滞血阻</td><td class="table_top_border" align="center" valign="middle">肝肾阴虚</td><td class="table_top_border" align="center" valign="middle">湿热阻滞</td></tr></thead>
<tbody><tr><td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">对照组</td><td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">40</td><td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">11（30）</td><td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">8（20）</td><td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">5（10）</td><td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">9（23）</td><td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">7（17）</td></tr><tr><td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">观察组</td><td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">40</td><td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">12（33）</td><td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">9（23）</td><td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">6（13）</td><td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">7（17）</td><td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">6（13）</td></tr></tbody>
</table></div></foreignObject></svg>)
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慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB)是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV)慢性感染所导致的疾病，具有反复性、长期性等特点，可造成肝硬化、肝癌等严重肝脏疾病甚至导致患者死亡[1]。根据慢性乙型肝炎临床症状和体征，中医辨证可将其归属于“黄疸”、“胁痛”、“肝着”、“肝瘟”、“湿阻”、“疫疠”等范畴[2]。中医药治疗CHB可依据中医的症状，以中医宏观调控理论为主，并参照西医检查肝功能、病理学检查、病毒定量等手段进行辨证论治。此外，中医的免疫调节作用还可能使纯中药或中西医结合治疗成为降低核苷(酸)类似物停药复发率的一种选择[3]。本研究通过观察中医辨证联合恩替卡韦后治疗CHB的临床疗效，比较两种治疗方案的优劣，为临床使用提供依据。
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选取2017年10月至2018年9月上海健康医学院附属嘉定区中心医院中医肝病门诊就诊的CHB患者80例作为研究对象。选择标准：符合CHB的临床诊断标准，符合我国《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》中相关诊断标准及首次抗病毒条件[4]，且均乙型肝炎E抗原阳性、乙型肝炎E抗体阴性。排除标准：肝细胞癌或失代偿性肝病者，重叠或合并其他肝炎病毒感染者，对核苷、核苷类似物高度过敏者，合并心脏等脏器严重疾病者，6个月内接受过抗病毒、免疫抑制剂治疗者。将入选的80例CHB患者按随机数字表法分为两组。观察组依据中医辨证分型施药加恩替卡韦治疗，患者40例，男27例，女13例，年龄在16~60岁之间，平均40岁。对照组以恩替卡韦治疗，患者40例，男25例，女15例，年龄17~58岁之间，平均38岁。观察组与对照组在年龄、性别、病程以及辨证分型等方面比较，无显著差异(P>0.05)，具有一定可比性，见表1。
表 1 两组慢性乙型肝炎患者辨证分型情况[例(%)]
组别 例数 肝气郁结 肝郁脾虚 气滞血阻 肝肾阴虚 湿热阻滞 对照组 40 11（30） 8（20） 5（10） 9（23） 7（17） 观察组 40 12（33） 9（23） 6（13） 7（17） 6（13） -
对照组给予西医常规治疗，选用恩替卡韦片（南京正大天晴药业公司）1 mg qd po。观察组加用中药治疗，草药汤剂由本院中药房提供。中医治疗根据“慢性乙型肝炎中医辨证规范和疗效评价体系[5]”辨证分型为5种：肝气郁结证、肝郁脾虚证、气滞血阻证、肝肾阴虚证、湿热阻滞证。肝气郁结以柴胡舒肝散（柴胡10 g、白芍10 g、枳壳10 g、炙甘草3 g、川芎10 g、香附12 g）为主方；肝郁脾虚以逍遥散（柴胡9 g、薄荷3 g、党参15 g、茯苓12 g、白芍10 g、白术12 g、炙甘草3 g、当归12 g、生姜3片）为主方；气滞血阻以大七气汤加减（三棱10 g、莪术10 g、青皮9 g、陈皮12 g、木香5 g、炙甘草3 g、藿香10 g、益智仁9 g、桔梗6 g、肉桂3 g、生谷麦芽各30 g）为主方。肝肾阴虚以一贯煎（北沙参12 g、麦冬9 g、当归9 g、生地黄12 g、枸杞子12 g、川楝子6 g）为主方；湿热阻滞以茵陈四苓汤（茵陈15 g、郁金12 g、金钱草15 g、茯苓12 g、猪苓12 g、泽泻12 g、白术12 g、陈皮12 g、枳壳10 g、焦三仙12 g、甘草3 g）为主方。肝病门诊患者每2周复诊一次，临床根据症状，食积加神曲、麦芽、山楂、砂仁等药；化瘀加三棱、莪术、桃仁、红花、川芎、当归、鳖甲等药；行气者多用青皮、陈皮、厚朴、木香、香附等药；化痰者多用半夏、白芥子、莱菔子等药；温阳散寒者多用肉桂、干姜、良姜、茴香、丁香等药；养阴益精、清化燥热、软坚散结者多用生地、白芍、乌梅，以及黄连、大黄等药。用法：每日一剂，煎服2次。24周为1个疗程，为期2个疗程。治疗48周后，观察患者的临床症状，肝功能指标、血清学转换及乙肝病毒基因的改善程度。
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ALT检测采用速率法，正常值范围0~64 U/L。HBV-DNA定量采用实时荧光免疫聚合酶链式反应（PCR）法测定，其最低检测值为1000 IU/ml，低于其检测值可视为转阴。e抗原及e抗体检测采用酶联免疫吸附法，检测试剂由广州达安基因有限公司提供。
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实验室指标：肝功能、肾功能、血常规、淀粉酶、心电图。每月复查一次实验室指标。不良反应：头痛、疲劳(原有乏力者无明显加重)、眩晕、恶心。每半个月门诊随访或就诊时详细记录。
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采用SPSS 13.0软件进行数据统计,计数资料采用χ2检验，计量资料用（
$\bar x \pm s$ ）表示，采用独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。 -
观察组与对照组相比，治疗前后患者出现的腹胀、胁痛、纳差、乏力情况的例数均有所减少，差异具有统计学意义（P<0.05），结果见表2。
表 2 两组慢性乙型肝炎患者治疗后症状改善情况比较[例(%)]
组别 腹胀 胁痛 乏力 纳差 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 对照组 32 (80) 12 (30) 20 (50) 11 (28) 21 (53) 10 (25) 20 (50) 8 (20) 观察组 36 (90) 2 (5) * 24 (60) 2 (5) * 32 (80) 3 (7.5) * 24 (60) 0 (0) * *P<0.05，与对照组治疗后比较 -
观察组的ALT复常率较对照组有显著优势。治疗12周，观察组的复常率为33例，对照组为22例；治疗24周，观察组的复常率为38例，对照组为32例；差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗48周，两组的复常率均为40例。结果见表3。
表 3 两组慢性乙型肝炎患者ALT复常率比较[例(%)]
组别 治疗12周 治疗24周 治疗48周 对照组 22（55） 32（80） 40（100） 观察组 33（82.5）* 38（95）* 40（100） *P<0.05，与对照组治疗后比较 -
观察组和对照组经治疗24周以及48周后，患者血清学转换及HBV-DNA阴转无统计学意义（P>0.05），但是24周观察组HBeAg转阴率以及24周血清学转换分别达30%、27.5%，48周观察组HBeAg转阴率以及24周血清学转换分别达35%、32.5%，表明观察组有一定治疗效果。结果见表4。
表 4 两组慢性乙型肝炎患者治疗后各阶段疗效比较[例(%)]
组别 HbeAg下降> 1log HBeAg转阴率 血清学转换 HBV-DNA转阴率 12周 24周 48周 24周 48周 24周 48周 对照组 6 (15) 9 (22.5) 11 (27.5) 9 (22.5) 10 (25) 35 (87.5) 38 (95) 观察组 8 (20) 12 (30) 14 (35) 11 (27.5) 13 (32.5) 36 (90) 39 (97.5) -
观察组中出现1例患者肝功能ALT一过性轻度增高（未作特殊处理），发生率为2.5%。对照组中出现1例患者肾功能异常，表现为一过性肌酐轻度增高（未作特殊处理），1例患者出现恶心，发生率为5%。均未明确与药物有关。提示恩替卡韦联合中药治疗CHB副作用较少，且两组不良反应发生率间差异无统计学意义（P>0.05）。
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《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》，首次明确定义了“临床治愈”的含义是基于停止治疗后依然稳定的病毒学应答，伴有HBsAg消失。这一目标是停药后依然获得持续免疫控制的表现。在CHB的抗病毒治疗中，获得持续性免疫学控制，即在持续性HBV-DNA阴性基础上的HBeAg血清学转换和HBsAg消失是抗病毒理想的治疗终点[6]。恩替卡韦是一种环戊酰鸟苷类似物，最初应用于疱疹病毒的治疗，后来发现其对HBV具有良好的抑制效果，能够强力阻断HBV与DNA的合成，遂将其应用于CHB的治疗中[7]。恩替卡韦能够抑制HBV的病毒活性，且可对其复制产生有效抑制，从而改善其生化学和组织学，进而达到治疗的目的[8]。而基于辨证论治使用中医药治疗CHB的本质与调节免疫功能有关，尽管不同中医药治疗方案对于CHB患者免疫系统功能的调节作用侧重点可能不同，但与《指南》关于持续免疫控制的目标有一定共识[9]。中医理论在认识免疫耐受、免疫清除等CHB病理阶段的认识有邪正盛衰关系作为其辨证论治的理论基础[10]，通过中医扶正祛邪的辨证思路配合恩替卡韦，能够实现提高CHB的临床疗效，无限接近甚至达到“临床治愈”的标准。
本研究观察中，两组均符合抗病毒基线要求并均为“大三阳”，其中，中医组根据患者腹胀、胁痛、乏力、纳差等症状结合舌脉四诊合参进行理论辨证分型，共分五型，各型均拟一相应主方，临床辨证加减施治。结果显示：两组在改善临床症状腹胀、乏力、纳差、胁痛诸症有显著差异（P<0.05），在24周前ALT的复常率中西药联用组亦明显优于西药单用组，在HBeAg血清学转换方面12周下降大于1log以及24周、48周HBeAg阴转、血清学转换方面亦有一定效果。有研究[11]表明，单纯使用恩替卡韦短期治疗（48~52周）HBeAg血清学转换率21%，HBV-DNA转阴率67%，无HBsAg消失。而本研究中，24周观察组HBeAg转阴率以及24周血清学转换率分别达30%、27.5%，48周观察组HBeAg转阴率以及24周血清学转换率分别达35%、32.5%。HBeAg血清学转换率观察组和对照组差异虽无统计学意义，却可提示观察组对HBV-DNA低于检测下限的比率和血清HBeAg低于检测下限的比率以及HBeAg血清学转换率有一定的治疗意义，此结果与相关研究[12]一致，也高于21%的对照组短期疗效。辨证论治联合恩替卡韦治疗不仅提高HBV-DNA阴转率、还能较明显提高HBeAg血清学转换率、改善中医症候提高及患者生活质量，推测辨证论证中药治疗可能通过调控机体免疫状态，诱导机体免疫应答等各方面影响而达到上述效果[13]。其次，辨证论治联合恩替卡韦治疗有理想的近期疗效，但远期疗效需延长随访时间做进一步研究。因此，中医辨证在改善CHB机体免疫、提高血清学转换方面有一定临床治疗意义。当然，由于样本数较少、观察时间不长以及对于CHB的基因型尚未考虑等因素使得结论尚存不足之处，今后将不断完善总结。
总之，中医辨证分型施治具有抗病毒、调节免疫等各种作用，可调理肝、脾、胃、肾，通过“清”和“通”化湿泄浊，理气通滞。可以通过“补”和“调”益肾补脾，调气治血等方法治疗，对患者康复十分有利[3，14]。笔者认为中西医结合治疗CHB可以改善患者症状，提高其生活质量，并能平衡阴阳，调整机体免疫，而且草药源于自然，价格适中，值得临床推广研究。
Clinical efficacy of TCM syndrome differentiation combined with entecavir in chronic hepatitis B patients
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摘要:
目的 探讨中医辨证联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎的临床疗效。 方法 选取本院中医肝病门诊就诊的慢性乙型肝炎患者80例作为研究对象，随机分为观察组和对照组，每组40例。对照组患者予恩替卡韦片，观察组在对照组的基础上联合中医辨证治疗。将两组患者治疗48周后临床症状、肝功能指标、血清学转换及乙肝病毒基因的改善程度进行对比。 结果 观察组在改善临床症状如腹胀、乏力、胁痛、纳差等方面均优于对照组，两组有显著差异（P<0.05）。观察组在丙氨酸氨基转移酶（ALT）复常率方面较对照组有显著治疗优势（P<0.05），尤其是在24周前效果更明显。观察组和对照组经治疗12周、24周、48周后血清学转换及乙肝病毒基因均转阴（P>0.05），结果差异无统计学意义。 结论 中医辨证联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎，其临床症状及肝功能生化指标改善显著，值得临床推广应用。 Abstract:Objective To investigate the clinical effect of traditional Chinese medicine syndrome differentiation-based treatment combined with entecavir in the treatment of chronic hepatitis B. Methods A total of 80 outpatients with chronic hepatitis B were randomly divided into the observation group (n=40) and control group (n=40).The patients in the control group were treated with entecavir tablets. The patients in the observation group were given TCM syndrome differentiation-based treatment in addition to the treatment received by the control group. Clinical symptoms relief, improvement of liver function indexes, serological conversion and HBV-DNA negative rate were compared between the two groups after 48 weeks of treatment. Results The clinical symptoms of abdominal distension, fatigue, pain and anorexia were relieved better in observation group than in control groups. The difference was significant between the two groups (P<0.05). The observation group had significant therapeutic advantages over the ALT recurrence rate compared to the control group, especially 24 weeks ago (P<0.05). There was no statistically significant difference between the combined group and the control group after 12, 24, 48 weeks after treatment, and the HBV-DNA (both greater than 0.05) were clinically modified. Conclusion TCM syndrome differentiation-based treatment combined with entecavir had significant therapeutic advantages in the treatment of chronic hepatitis B, which could relieve clinical symptoms, improve liver function indexes, and converse serological changes and be worthy of clinical popularization. -
Key words:
- TCM syndrome differentiation /
- entecavir /
- chronic hepatitis B /
- clinical efficacy
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生脉注射液临床上常用于辅助治疗心肌梗塞、心源性休克、脓毒症和感染性休克。心肌梗塞引起组织产生大量氧自由基，直接损伤心肌细胞并触发细胞凋亡，免疫介导的炎症损伤会加大心梗范围和心梗损伤[1]。心源性休克激活的炎症反应可诱导产生大量NO，促进细胞凋亡[2]。脓毒血症是由细菌引起的全身性炎症，大量致炎因子破坏机体的免疫平衡，从而导致机体代谢紊乱[3]，严重者可能引起感染性休克。本研究特选择抗氧化及抗炎能力作为生物效应指标，考察生脉注射液质量与生物效应之间的相关性。
课题组前期对生脉注射液中11种成分[4]进行了指认并进行了定量，均符合药典标准。药理学实验表明，生脉注射液中人参皂苷、木质素和麦冬皂苷等多种化学成分均在细胞及动物模型上表现出良好的抗炎效果[5-8]，且临床研究表明其可以通过抗炎通路发挥对器官损伤的保护作用[9-10]。现今生物效应评价在中药材和中成药质量控制研究中有所应用[11-12]，2015版《中国药典》收录了生物活性测定法作为质量控制标准，如洋地黄生物测定法和黄体生成素生物测定法，说明通过生物效应控制药品质量是可行的。
抗炎和抗氧化损伤是生脉注射液产生药理作用的重要机制，但现今的质量标准仅对化学成分进行定性定量分析，不能全面体现其整体的药效活性，为此，本研究尝试通过评价其抗氧化能力以及抗炎活性，建立有效的生脉注射液生物学质量控制方法。
1. 材料
1.1 试剂与药品
二苯基苦基苯肼（DPPH，质量分数≥97%，含10%～20%苯，批号：PRPDE-JO，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；水溶性维生素E (Trolox)、DMEM培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自北京Solarbio公司；胎牛血清（FBS，德国PAN Seratech公司）；N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；无水乙醇（北京化工厂）；水（屈臣氏）。
9批次生脉注射液分别由5个不同厂家生产，样品详细情况见表1。
表 1 生脉注射液样品来源、批号及有效成分含量(μg/ml)[4]编号 生产厂家 批号 规格 人参皂苷Rb1 人参皂苷Re 人参皂苷Rg1 五味子醇甲 麦冬皂苷D S1 A 16120401005 10 ml/支 61.16 51.39 84.69 51.43 1.48 S2 B 160502 10 ml/支 101.69 55.61 88.99 73.09 3.42 S3 C 17071014 10 ml/支 56.99 44.87 80.42 36.78 1.68 S4 C 17040423 20 ml/支 63.12 44.51 81.54 39.63 1.28 S5 D 1704252 20 ml/支 77.15 62.10 86.11 29.05 3.62 S6 E 17091302 10 ml/支 85.52 57.74 88.45 33.55 1.40 S7 E 17092903 10 ml/支 80.43 41.52 86.36 37.30 1.33 S8 E 17061103 20 ml/支 74.88 61.06 80.00 35.18 1.72 S9 E 17053005 20 ml/支 79.97 48.54 80.34 44.83 1.59 1.2 主要仪器及设备
电子分析天平（AB265-S，梅托勒-托利多有限公司）；超声波清洗仪（B25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）；TS-2000A脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；96孔板、多功能连续波长酶标仪（InfiniteM1000，TECAN公司）；低速离心机（SC-3610，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（MCO-15AC，三洋电机株式会社）。
1.3 细胞培养
RAW264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。培养条件：完全培养基为含10%FBS的DMEM培养基，在37℃含5% CO2的培养箱中培养。每天换液，细胞生长达对数生长期时，传代（传代比例为1:6）并开展实验，实验用细胞控制在10代以内。
2. 方法与结果
2.1 DPPH法评价生脉注射液质量
2.1.1 实验过程
取96孔板，每孔依次加入100 μl初浓度2.0%的受试液、100 μl 0.5 mmol/L DPPH溶液，震荡均匀后避光反应20 min。
测定方法：每孔依次加入100 μl受试液和DPPH溶液，在摇床上振荡均匀，避光反应20 min后，用酶标仪测定波长在517 nm处的吸光度。
2.1.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：分别吸取样品编号为S9的药液，用纯水定容得到浓度为8%的生脉注射液受试液。逐级稀释，测定其吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到的线性关系方程为Y=-0.2081X+1.2209（r=0.9996）（图1-A），表明生脉注射液具有较强的DPPH自由基清除能力且具有浓度依赖性，体积浓度和平均吸光度具有良好的线性关系，在0%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为2.25%（见表2），表明该方法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照"2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.21%（见表2），表明该方法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S9，分别于0、4、8、24、48和72 h，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.47%（见表3），表明该方法在72 h内稳定性良好。
图 1 生脉注射液抗氧化生物活性评价A. 生脉注射液对DPPH清除作用的标准曲线；B. Trolox对DPPH清除作用的标准曲线；C. 1.0%各批次生脉注射液相当于Trolox的量（mmol/L）表 2 1.0%生脉注射液对DPPH清除作用的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 1.063 4 1.087 9 2.25 1.138 9 1.135 6 2.22 2 1.115 6 1.175 6 3 1.098 3 1.135 7 4 1.114 3 1.096 7 5 1.064 9 1.129 2 6 1.070 9 1.137 7 表 3 1.0%生脉注射液对DPPH的清除作用的稳定性时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 1.038 5 1.078 8 2.47 4 1.105 7 8 1.072 2 24 1.080 5 48 1.065 7 72 1.110 0 2.1.3 生脉注射液抗氧化生物活性的质量评价
精密称定Trolox，加入100 μl无水乙醇溶解，纯水定容，得到初浓度为15.46 mmol/L的Trolox溶液。将其逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到的线性关系方程为Y=–0.0789X+1.1674（r=0.9951）（见图1-B），表明Trolox清除DPPH能力在作用浓度0.43~5.56 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液清除DPPH自由基的结果与Trolox比较，折算得到各批次生脉注射液相当于水溶性Trolox的作用浓度（见图1-C）。结果表明，终浓度1.0%的各批次生脉注射液清除自由基能力相对于Trolox作用浓度范围为1.2~1.9 mmol/L，在清除自由基即抗氧化能力方各批次不存在较大差异。
2.2 Griess试剂盒评价生脉注射液的抗炎活性
2.2.1 Griess试剂盒测定生脉注射液抑制NO释放能力
使用完全培养基配制为1.2%的生脉注射液样品溶液，及初浓度100μg/ml的LPS样品溶液。
取对数生长期的RAW264.7细胞，制备成2×106个/ml的细胞悬液，以每孔100 μl注入96孔板。培养24 h后，弃去培养基，每孔加入100 μl样品溶液和100 μl的LPS溶液，孵育24 h后吸取50 μl上清液，按照Griess试剂盒说明书操作，用酶标仪测定波长540 nm处的吸光度。
2.2.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：精密吸取样品编号为S6的药液，用完全培养基制成浓度为4.0%的溶液。逐级稀释，测定吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性方程为Y=–0.033ln(X)+0.243（r=0.9961）（见图2-A），表明生脉注射液具有良好的NO分泌抑制能力并具有浓度依赖性，终浓度和平均吸光度之间具有良好的线性关系，在0.2%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为1.71%（见表4），表明该法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.79%（见表4），表明该法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S6，分别于0、4、8、24和48 h时，配制得到浓度1.2%的溶液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.66%（见表5），表明该方法在48 h内稳定性良好。
图 2 生脉注射液抗炎活性评价A. 生脉注射液对RAW264.7细胞分泌NO的标准曲线；B. L-NAME对RAW 264.7细胞分泌NO的标准曲线；C. 0.60%各批次生脉注射液相当于L-NAME的量（mmol/L）表 4 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 0.276 0 0.272 9 1.71 0.272 9 0.285 0 2.79 2 0.272 3 0.281 1 3 0.265 0 0.289 0 4 0.276 1 0.291 6 5 0.275 0 0.290 6 表 5 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的稳定性考察时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 0.264 5 0.262 3 2.66 2 0.273 6 4 0.257 4 24 0.257 4 48 0.258 6 2.2.3 生脉注射液抗炎生物活性的质量评价
精密称定eNOS抑制剂L-NAME，逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作，测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性关系方程为Y=–0.052ln(X)+0.152（r=0.9957）（见图2-B），表明L-NAME抑制NO分泌能力在0.05~0.55 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液抑制NO分泌能力的结果与L-NAME比较，折算得到各批次生脉注射液相对于L-NAME的作用浓度（见图2-C）。
结果显示，除S2和S8样品外，终浓度0.6%的各批次生脉注射液对应的L-NAME浓度范围均在0.06~0.16 mmol/L范围内，表明在抑制NO分泌能力即抗炎能力方面S2和S8与其他样品存在较大差异。其中S2对应的L-NAME浓度远高于其他样品，其抗炎活性远高于其他样品组，推测这可能与化学成分含量差异有关，需要后续的实验加以证实。
3. 讨论
3.1 实验方法及阳性对照药的选择
测定抗氧化活性常用的方法有氧化自由基吸收能力（ORAC）、二苯基苦基苯肼（DPPH）法和总抗氧化能力检测（ABTS）法等，本实验首先采用DPPH法测定抗氧化能力，该方法操作简便，常用于体外评价化合物的抗氧化活性，其中Trolox和维生素C是常用的抗氧化剂对照药[13-14]，但相较之下，Trolox可通过清除自由基产生抗氧化机制，且具有剂量依赖性[15]，而维生素C稳定性较Trolox差，所以该方法选择了该药作为阳性对照。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）诱导产生NO是NO产生的重要途径[16]，L-NAME作为eNOS抑制剂，选择其作为对照药可以更加直观地评价药物对细胞产生NO的抑制能力。
3.2 结果分析
参考2015版药典生物测定方法，该试验通过测定生脉注射液的抗炎和抗氧化能力，初步建立了生脉注射液的生物效应质量控制方法，该方法不仅能满足方法学要求，而且可以克服现行质量控制方法的局限性，还可以有效的评价中药复方制剂在治疗过程中产生的效应强度，实现“质-量-效”的有效结合[17]。
4. 展望
中药复方是一个组分复杂，不仅化学成分复杂，未知组分众多，而且其可能通过不同成分的配伍产生作用机制，即其药理机制不是单一化学成分能够阐明的，因此，仅对中药复方的化学成分进行评价难以对其成分及作用进行全面阐述。生物效应质量控制方法能对中药复方的整体组分药效进行把控，从药理活性方面评价中药复方质量，弥补现有质控方法的不足。在生物效应质控方法建立过程中，应注意以下问题：①质控方法应根据药效及药理机制研究选择合适的生物效应指标，充分反映该药的药理活性特征；②选择的对照药应具有足够的专属性、关联性和可测性，能够充分准确地反映药物的生物效应[18-20]。参考已有的生物质量控制研究[11，21]并对生脉注射液可能的药理活性进行筛选，对此进行考察。重点考察其方法学验证，结果显示该方法可行性高，方法学符合生物效应评价要求，可以反映生脉注射液的整体生物效应。但抗炎活性的测定实验要求较高的实验操作，且该方法对中药复方的整体生物活性进行测定，并未对可能产生药理活性的化学组分和含量进行探究和测定，可能产生药理活性的化学成分及作用机制尚不明确，值得后续的探讨。
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表 1 两组慢性乙型肝炎患者辨证分型情况[例(%)]
组别 例数 肝气郁结 肝郁脾虚 气滞血阻 肝肾阴虚 湿热阻滞 对照组 40 11（30） 8（20） 5（10） 9（23） 7（17） 观察组 40 12（33） 9（23） 6（13） 7（17） 6（13） 
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表 2 两组慢性乙型肝炎患者治疗后症状改善情况比较[例(%)]
组别 腹胀 胁痛 乏力 纳差 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 对照组 32 (80) 12 (30) 20 (50) 11 (28) 21 (53) 10 (25) 20 (50) 8 (20) 观察组 36 (90) 2 (5) * 24 (60) 2 (5) * 32 (80) 3 (7.5) * 24 (60) 0 (0) * *P<0.05，与对照组治疗后比较
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表 3 两组慢性乙型肝炎患者ALT复常率比较[例(%)]
组别 治疗12周 治疗24周 治疗48周 对照组 22（55） 32（80） 40（100） 观察组 33（82.5）* 38（95）* 40（100） *P<0.05，与对照组治疗后比较
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表 4 两组慢性乙型肝炎患者治疗后各阶段疗效比较[例(%)]
组别 HbeAg下降> 1log HBeAg转阴率 血清学转换 HBV-DNA转阴率 12周 24周 48周 24周 48周 24周 48周 对照组 6 (15) 9 (22.5) 11 (27.5) 9 (22.5) 10 (25) 35 (87.5) 38 (95) 观察组 8 (20) 12 (30) 14 (35) 11 (27.5) 13 (32.5) 36 (90) 39 (97.5)
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