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上海市非物质文化遗产 “夏氏外科”第五代传人李福伦主任医师，基于中医“血虚风燥”理论和夏氏特色用药经验，总结凝练出六味润肤油摩方为治疗特应性皮炎的外用经验效方。该方由火麻仁等六味中药组成具有“养血润燥，祛风止痒”之效[1]，在临床上运用多年，疗效确切。本研究拟将经验方-六味润肤油摩方开发成院内制剂，应用于临床。为控制六味润肤油摩方质量，本研究采用薄层色谱（TLC）法对该方中的中药进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定方中君药火麻仁中的亚油酸及川芎、当归中的藁本内酯、洋川芎内酯A的含量[2-3]，为六味润肤油摩方的质量控制提供客观的评价方法。
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Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BSA822-CW型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；CQ-250A-DST型超声波清洗仪（上海跃进医疗器械有限公司）；SHZ- D（Ⅲ）型循环水式真空泵（郑州博科设备有限公司）；RV-10型旋转蒸发仪（德国IKA公司）； BD-Ⅱ型多功能紫外分析仪（北京启航博达科技有限公司）；HWS28型电热恒温水浴锅（上海一恒科学实验有限公司）。
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六味润肤油摩方（岳阳医院制剂室，批号：20230801、20230802、20230803）；洋川芎内酯A对照品（货号：ST10580220，含量≥95.0%），购于上海诗丹德标准技术服务有限公司；藁本内酯对照品 （批号：111737-202311），亚油酸对照品（批号：111622-202105，含量≥98.0%），甘油三油酸酯对照品（批号：121254-202105，含量≥99.8%），甘草苷对照品（批号：111610-202209，含量≥95.0%）均购于中国食品药品检定研究院；硅胶G薄层板（山东省烟台江友硅胶开发有限公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
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火麻仁的鉴别：取六味润肤油摩方40 ml，加甲醇40 ml，振摇5 min，静置30 min，取甲醇层溶液，回流浓缩后定容至2 ml，作为供试品溶液；按六味润肤油摩方处方及工艺，制备不含火麻仁的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液；另取亚油酸对照品，加甲醇制成每1 ml含20 μl的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（通则 0502）实验，吸取上述溶液各3 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（3∶0.3∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1。
图 1 火麻仁的TLC图
川芎、当归的鉴别：供试品溶液制备方法同前；按六味润肤油摩方处方及工艺，制备不含川芎、当归的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液；另取藁本内酯对照品，加甲醇制成每1 ml含50 μl的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（通则 0502）实验，吸取上述溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯（37∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰，阴性对照无干扰。详见图2。
图 2 川芎、当归的TLC图
薏苡仁的鉴别：供试品溶液制备方法同前；按六味润肤油摩方处方及工艺，制备不含薏苡仁的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液；另取甘油三油酸酯对照品，加甲醇制成每1 ml含50 μl的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（通则 0502）实验，吸取上述溶液各 5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙醚-冰醋酸（83∶17∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无干扰。详见图3。
图 3 薏苡仁的TLC图
甘草的鉴别：供试品溶液制备方法同前；按六味润肤油摩方处方及工艺，制备不含甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液；另取甘草苷对照品，加甲醇制成每1 ml含20 μl的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（通则 0502）实验，吸取上述溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无干扰。详见图4。
图 4 甘草的TLC图
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色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），洗脱程序见表1；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长： 210 nm；进样量：10 μl。
表 1 梯度洗脱程序
时间（t/min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0~20 50→30 50→70 20~30 30→15 70→85 30~35 15→8 85→92 35~40 8→13 92→87 40~45 13→30 87→70 45~50 30→50 70→50 50~55 50 50 -
（1）对照品溶液：取洋川芎内酯A、藁本内酯、亚油酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，配制成浓度分别为2.000、0.220、0.451 mg/ml的混合对照品溶液。
（2）供试品溶液：取样品（批号20230801）5 ml，按1:1比例加甲醇混合，振摇5 min后静置30 min，取上清甲醇层，即得供试品溶液。
（3）阴性样品溶液：按六味润肤油摩方处方及工艺，制备缺火麻仁、川芎、当归的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。
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取供试品溶液、对照品溶液与阴性对照品溶液各10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果理论板数符合要求，基线分离良好；阴性对照品溶液在与对照品溶液色谱保留时间相同处无干扰峰，表明专属性良好。详见图5。
图 5 六味润肤油摩方的HPLC图
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以“2.2.2”项下对照品溶液为母液，按不同比例进行稀释，制备5份不同浓度的混合对照品溶液。其中，洋川芎内酯A的浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、30.0 μg/ml；藁本内酯的浓度分别为0.28、0.55、1.10、2.20、3.30 μg/ml；亚油酸的浓度分别为0.56、1.13、2.26、4.51、6.77 μg/ml。按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，并记录峰面积。以对照品浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得各组分线性方程、相关系数及线性范围。结果见表2。实验结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
表 2 3种主成分的线性关系考察结果
成分 回归方程 r 线性范围（μg /ml） 洋川芎内酯A Y=14.893X+8.155 2 0.999 9 2.50~30.00 藁本内酯 Y= 3267.4 X+637.840.999 3 0.28~3.30 亚油酸 Y=499.37X+584.36 0.999 0 0.56~6.77 -
精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液10 µl，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算RSD值，实验数据列于表3。结果表明仪器的精密度良好。
表 3 精密度实验结果
测定次数 峰面积值 洋川芎内酯A 藁本内酯 亚油酸 1 368.3 1 683.4 869.1 2 366.7 1 651.1 878.9 3 363.5 1 657.3 864.9 4 364.2 1 640.9 869.5 5 367.5 1 634.9 873.9 6 368.1 1 656.8 877.5 RSD（%） 0.51 0.93 0.57 -
按“2.2.3”项下的方法分别制备6份供试品溶液，分别进样10 µl，记录洋川芎内酯A、藁本内酯、亚油酸的峰面积，计算RSD值。结果见表4。结果表明方法重复性良好。
表 4 重复性实验结果
测定次数 含量 洋川芎内酯A 藁本内酯 亚油酸 1 368.1 1607.1 873.9 2 367.5 1624.3 880.5 3 368.8 1647.3 874.9 4 367.4 1627.8 878.0 5 364.8 1598.5 879.5 6 366.6 1631.1 868.2 RSD（%） 0.30 0.98 0.47 -
取“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，分别于室温放置0、4、8、12、16和24 h。按“2.2.1”项下色谱条件进样10 µl，测定峰面积，计算RSD值。实验数据列于表5，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
表 5 稳定性实验结果
测定时间（t/h） 峰面积值 洋川芎内酯A 藁本内酯 亚油酸 0 367.7 1 680.7 873.4 4 368.1 1 706.1 864.5 8 364.6 1 682.4 873.1 12 363.2 1 670.3 868.3 16 364.1 1 681.5 876.7 24 365.4 1 667.1 880.5 RSD（%） 0.50 0.74 0.60 -
精密量取已知指标成分含量的样品（批号
20230801 ）1 ml。在线性范围内配置洋川芎内酯A（24.00 μg/ml）、藁本内酯（0.30 μg/ml）和亚油酸（0.58 μg/ml）混合对照品甲醇溶液。上述两者按1∶1比例混合，0.45 μm微孔滤膜过滤备用。重复上述操作，制备其余5份样品。按“2.2.1”项下色谱条件测定含量并计算，数据列于表6。根据计算结果，回收率控制在95%~105%之间，RSD值不超过3%。结果表明本方法回收率良好。表 6 加样回收实验结果
成分 序号 样品含量（m/μg） 加入量（m/μg） 实测含量（m/μg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%） 洋川芎内酯A 1 24.19 24.00 48.71 101.08 100.48 1.27 2 24.03 48.53 101.04 3 24.15 49.25 102.28 4 23.97 47.67 99.37 5 24.38 47.58 98.35 6 23.87 48.24 100.77 藁本内酯 1 0.31 0.30 0.63 103.28 101.08 2.02 2 0.30 0.61 101.67 3 0.31 0.60 98.36 4 0.29 0.58 98.31 5 0.33 0.65 103.17 6 0.28 0.59 101.72 亚油酸 1 0.58 0.58 1.17 100.86 100.57 1.60 2 0.59 1.21 103.42 3 0.57 1.14 99.13 4 0.60 1.16 98.31 5 0.57 1.16 100.87 6 0.59 1.18 100.85 -
取3批六味润肤油摩方样品（批号
20230801 、20230802 、20230803 ），按“2.2.3”项下方法制备供试样品溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件测定洋川芎内酯A、藁本内酯、亚油酸的含量，实验数据列于表7。结果显示，该工艺准确可靠，可行性好，可用于工业化生产。表 7 六味润肤油摩方中洋川芎内酯A、藁本内酯、亚油酸的含量测定结果
批号 浓度（μg/ml） 洋川芎内酯A 藁本内酯 亚油酸 20230801 24.74 0.32 0.59 20230802 23.86 0.31 0.56 20230803 24.01 0.28 0.57 -
六味润肤油摩方是一种基于中医“血虚风燥”理论的外用方剂，主要用于治疗特应性皮炎。本实验针对六味润肤油摩方中5种药材进行TLC鉴别，主要参考2020年版《中华人民共和国药典》（一部）的方法[4]。针对方中的君药火麻仁、当归，臣药川芎，佐药薏苡仁，使药甘草，选取药典上的有效成分进行鉴别，包括亚油酸、藁本内酯[5]、甘油三油酸酯和甘草苷。以上鉴别，可操作性强，重复性好，斑点清晰易于识别，阴性对照无干扰。
六味润肤油摩方以大豆油浸渍制备，且方中有种仁类药物，所以该制剂中以油脂类成分为主。对于油脂类药效成分的含量测定，《中华人民共和国药典》（2020年版）[4]标明的测定方法中，主要采用气相色谱法。为了测定方中主要成分含量，本实验采用高效液相色谱法[6-8]。采用DAD检测器进行含量测定，结果发现主要成分的分离度均大于1.5，理论塔板数超过5 000，且相似度大于0.9，相较药典方法更加简便易行，更适合该方中主要成分的分离鉴定。经实验，分别采用DAD检测器254、230和210 nm进行检测，发现3种主要标准物质成分能够在210 nm下被测定，故本实验采用单波长同时检测3种主要物质，从而简便了含量测定方法。
本实验建立了六味润肤油摩方5种中药TLC鉴别及3 种有效成分的含量测定方法，实验方法简便可行，灵敏度高，重现性好，可用于六味润肤油摩方的质量控制。从而为六味油摩方在临床上规范化使用，提供质量标准检测方法。现有研究已发现油脂类成分有治疗特应性皮炎的作用[9-10]，后续我们将进一步探索该制剂中主要活性成分。
Study on quality standards of Liuwei Runfu oil recipe
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摘要:
目的 建立六味润肤油摩方的质量标准。 方法 采用薄层色谱（TLC）法对该复方中五味中药进行定性鉴别，同时采用HPLC法测定洋川芎内酯A、藁本内酯、亚油酸的含量。 结果 TLC 鉴别分离度良好，专属性强，阴性样品无干扰；洋川芎内酯A 在25~300 µg（r=0.999 9）范围内线性关系良好，加样回收率均值为102.3%，RSD为2.3%；藁本内酯在0.69~8.25 µg（r=0.999 3）范围内线性关系良好，加样回收率均值为100.1%，RSD为2.8%；亚油酸 在2.81~33.75 µg（r=0.999 0）范围内线性关系良好，加样回收率均值为102.7%，RSD为1.7%。 结论 该方法操作简便易行，专属性强，准确可靠，可用于六味润肤油摩方的质量控制。 Abstract:Objective To establish a standardized quality criterion for the formula of the Liuwei Runfu oil recipe. Methods The qualitative identification of the components, such as Cannabis sativa, Ligusticum chuanxiong, Angelica sinensis, Coix lacryma-jobi, and Glycyrrhiza uralensis, was conducted by thin layer chromatography （TLC）. The concentration of Senkyunolide A, ligustilide, and linoleic acid was determined by high-performance liquid chromatography （HPLC）. Results The TLC identification results demonstrated excellent differentiation and high selectivity, without any disruption from the negative samples. The reference standard for Senkyunolide A exhibited excellent linearity in the range of 25 to 300 µg （r= 0.9999 ）, with an average recovery rate of 102.3% and a relative standard deviation （RSD） of 2.3%. The ligustilide reference standard exhibited strong linearity between the concentrations of0.6875 and 8.25 µg （r=0.9993 ）, with an average recovery rate of 100.1% and a relative standard deviation （RSD） of 2.8%. The linoleic acid reference standard demonstrated strong linear correlation within the range of2.8125 to 33.75 µg （r=0.9990 ）, with an average spiking recovery rate of 102.7% and a relative standard deviation （RSD） of 1.7%.Conclusion The established method with strong specificity was simple, accurate, reliable, which coulod provide a reference for the quality control of the Liuwei Runfu oil recipe. -
表 1 梯度洗脱程序
时间（t/min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0~20 50→30 50→70 20~30 30→15 70→85 30~35 15→8 85→92 35~40 8→13 92→87 40~45 13→30 87→70 45~50 30→50 70→50 50~55 50 50 
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表 2 3种主成分的线性关系考察结果
成分 回归方程 r 线性范围（μg /ml） 洋川芎内酯A Y=14.893X+8.155 2 0.999 9 2.50~30.00 藁本内酯 Y= 3267.4 X+637.840.999 3 0.28~3.30 亚油酸 Y=499.37X+584.36 0.999 0 0.56~6.77
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表 3 精密度实验结果
测定次数 峰面积值 洋川芎内酯A 藁本内酯 亚油酸 1 368.3 1 683.4 869.1 2 366.7 1 651.1 878.9 3 363.5 1 657.3 864.9 4 364.2 1 640.9 869.5 5 367.5 1 634.9 873.9 6 368.1 1 656.8 877.5 RSD（%） 0.51 0.93 0.57
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表 4 重复性实验结果
测定次数 含量 洋川芎内酯A 藁本内酯 亚油酸 1 368.1 1607.1 873.9 2 367.5 1624.3 880.5 3 368.8 1647.3 874.9 4 367.4 1627.8 878.0 5 364.8 1598.5 879.5 6 366.6 1631.1 868.2 RSD（%） 0.30 0.98 0.47
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表 5 稳定性实验结果
测定时间（t/h） 峰面积值 洋川芎内酯A 藁本内酯 亚油酸 0 367.7 1 680.7 873.4 4 368.1 1 706.1 864.5 8 364.6 1 682.4 873.1 12 363.2 1 670.3 868.3 16 364.1 1 681.5 876.7 24 365.4 1 667.1 880.5 RSD（%） 0.50 0.74 0.60
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表 6 加样回收实验结果
成分 序号 样品含量（m/μg） 加入量（m/μg） 实测含量（m/μg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%） 洋川芎内酯A 1 24.19 24.00 48.71 101.08 100.48 1.27 2 24.03 48.53 101.04 3 24.15 49.25 102.28 4 23.97 47.67 99.37 5 24.38 47.58 98.35 6 23.87 48.24 100.77 藁本内酯 1 0.31 0.30 0.63 103.28 101.08 2.02 2 0.30 0.61 101.67 3 0.31 0.60 98.36 4 0.29 0.58 98.31 5 0.33 0.65 103.17 6 0.28 0.59 101.72 亚油酸 1 0.58 0.58 1.17 100.86 100.57 1.60 2 0.59 1.21 103.42 3 0.57 1.14 99.13 4 0.60 1.16 98.31 5 0.57 1.16 100.87 6 0.59 1.18 100.85
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表 7 六味润肤油摩方中洋川芎内酯A、藁本内酯、亚油酸的含量测定结果
批号 浓度（μg/ml） 洋川芎内酯A 藁本内酯 亚油酸 20230801 24.74 0.32 0.59 20230802 23.86 0.31 0.56 20230803 24.01 0.28 0.57
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