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定量核磁共振技术（qNMR）在现代化学、生物医药、食品科学等领域中扮演着至关重要的角色[1, 2]。其原理是基于核磁共振现象，当将含有1H、13C、19F、31P等特定磁性核的样品置于外加磁场中，并施加一定的频率射频脉冲时，特定磁性核会吸收能量并进入激发态。当这些原子核回到基态时，会释放出能量，产生NMR信号[3]。通过分析这些信号的强度，可以定量分析样品中目标分子[4, 5]。与传统的化学分析方法相比，qNMR技术具有准确度高、操作简便、无需标记和高通量检测等优点，已相继被《美国药典》、《欧洲药典》、《中国药典》收录，并广泛应用于多个领域[6]。如用于药物成分的定量分析，检测食品中的添加剂和污染物，监测环境中的有害物质，评估环境污染程度。此外，qNMR还在代谢组学、材料科学等领域中有着重要的应用[7, 8]。
核磁共振磷谱是一种核磁共振分析方法。其用于鉴定含磷化合物的结构，定量分析含磷化合物的含量，或监测含磷化合物动力学及其在生物体中的代谢过程[9]。由于31P原子核天然丰度为100 %，旋磁比较高，化学位移范围宽，使得31P-NMR成为研究含磷化合物极为有效的工具[10, 11]。通过分析31P-NMR谱图，可以获得关于磷化合物的分子结构、化学环境等重要信息[12]。
磷酸氢钙咀嚼片是一种以磷酸氢钙为主要原料，蔗糖、淀粉、硬脂酸镁为辅料制成的补钙类药品，具有参与骨骼形成、骨组织重建、降低毛细血管通透性等药理作用，广泛应用于儿童生长发育的促进和钙质补充。现行中国药典采用乙二胺四醋酸二钠滴定法测定磷酸氢钙片剂中的磷酸氢钙的含量[13, 14]，但该法干扰因素多、灵敏度低、操作复杂。本研究建立了一种核磁共振磷谱定量（31P-qNMR）测定磷酸氢钙咀嚼片中磷酸氢钙含量的方法，相比于现有测定方法，操作简单，且专属性强，快速准确。
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仪器：600 MHz NMR（Bruker，AVANCE II）、分析天平（Shimadzu，AUW220D）、5 mm 同轴核磁管（Wilmad，535-pp-7）。
样品与试剂：某公司磷酸氢钙咀嚼片、重水（Cambridge Isotope Laboratories, Ins）、六甲基磷酰三胺（Adamas，含量≥98.0%，）、磷酸氢钙对照品（中国食品药品检定研究院，批号100410-201802）、稀盐酸（Adamas，分析纯）。
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取20片磷酸氢钙咀嚼片，精密称定后研细，精密称取细粉适量（约相当于含磷酸氢钙0.60 g）于100 ml量瓶中，加入10 ml 0.1 mol/L盐酸溶液，超声5 min后加入重水10 ml，用水稀释至刻度，摇匀后过滤。制得含磷酸氢钙浓度约为6 mg/ml的供试品溶液，精密量取260 μl于同轴核磁管外管。
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精密量取40 mg六甲基磷酰三胺于5 ml量瓶中，加入0.5 ml重水后，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取220 μl于同轴核磁管内管。
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精密称定磷酸氢钙对照品5.009 6 g于100 ml量瓶中，加10 ml 0.1 mol/L 稀盐酸溶解后定容，摇匀后得浓度为50.096 mg/ml的磷酸氢钙对照品储备液，稀释至适当浓度后精密量取260 μl于同轴核磁管外管。
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精密量取260 μl待测样品、220 μl内标物溶液分别置于同轴核磁管外管和内管，进行数据采集。采用zgpg30脉冲序列在25 ℃下获取31P-NMR谱。具体实验参数设置如下：谱宽频率（SWH）= 39 682.5 Hz，采样点数（TD）= 65 K，采样时间（AQ）= 0.825 s，采样次数（NS）= 128，空扫次数（DS）= 4，增益（RG）= 1 150，其他实验参数均采用仪器推荐参数。采用Topspin3.1 软件进行数据处理。
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按“2.1”项对空白辅料、对照品、和实测样品进行处理后进样，图1表明辅料及溶剂成分对被测组分的测定没有干扰，且磷酸氢钙的化学位移为δ 1.06，内标的化学位移为δ 29.02，内标对药物的测定也没有干扰。
图 1 磷酸氢钙及内标的核磁共振磷谱检测图谱
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量取9.0、7.0、5.0、3.0、1.0 ml磷酸氢钙对照品储备液置于50 ml量瓶中，稀释至刻度，制成含磷酸氢钙对照品浓度为9.018、7.014、5.010、3.006、1.002 mg/ml 的标准曲线溶液。分别量取260 μl标准曲线溶液于同轴核磁管外管，按照“2.2”项下方法测定31P NMR谱。以磷酸氢钙对照品响应信号和内标响应信号比为纵坐标，标准曲线系列溶液浓度为横坐标（mg/ml）进行线性回归，计算得回归方程为：A=0.004 3+0.183 6C，表明磷酸氢钙在1.0～9.0 mg/ml 范围内线性范围较好，r=0.999 9。
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按“2.1”项下重复精密称取6份片剂细粉，经相同处理后，按“2.2”项下进行检测，记录响应信号面积，根据工作曲线法计算其含量，得磷酸氢钙咀嚼片中磷酸氢钙含量为98.7 %，RSD为0.098 %，表明该方法重复性满足要求。
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精密称定磷酸氢钙对照品1.002 g于100 ml量瓶中，加入10 ml 0.1 mol/L 盐酸溶解后加水至刻度线，摇匀后得浓度为10.02 mg/ml的磷酸氢钙对照品储备液。
移液管精密移取供试品储备液2.00 ml于5 ml容量瓶中，分别精确加入10.02 mg/ml对照品溶液0.75、1.00、1.25 ml，加水稀释至刻度线后得到低、中、高3种浓度的回收率测定溶液，每种浓度平行配制3份，测定并计算加样回收率，得平均回收率为98.02 %、98.16 %、98.47 %，RSD分别为 0.31 %、0.68 %、0.62 %（n=9），证明该方法准确度较好。
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取同一样品溶液分别在0、4、8、12 h下进行测定，记录供试品信号峰面积，计算样品中磷酸氢钙含量。4次测量的信号峰面积的RSD值仅为0.26 %，表明供试品溶液在室温下放置12 h稳定性较好。
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分别精密量取5份供试品溶液260 μl于同轴核磁管外管，按照“2.2”项下方法测定31P NMR谱图并计算样品中待测组分磷酸氢钙的含量，结果表明样品中磷酸氢钙平均含量为98.19 %，RSD = 0.10 %。
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内标物的选择是定量核磁共振方法建立的关键，31P-qNMR定量检测中内标物质应选择结构稳定、不与待测样品发生反应、内标物信号峰与待测样品信号峰分离度高等特点。常见的磷核磁共振定量内标物有六甲基磷酰三胺（HMDA）、磷酸、甲基膦酸、亚甲基二磷酸等。其中，六甲基磷酰三胺易溶于氘代溶剂，且化学性质稳定，化学位移值约为δ 29.01，与待测物磷酸氢钙分离度好，无重叠，故本实验选取六甲基磷酰三胺作为内标物。经过方法学考察后，表明磷酸氢钙在1.0～9.0 mg/ml范围内线性相关，低、中、高3种浓度的加样回收率结果为98.0 %、98.1 %和98.4 %。本研究建立了一种精密度高、专属性强的含磷药物的含量检测方法，且无需自身对照物、前处理简便、检测速度快，为含磷药品质量控制提供了新的策略。
Determination of phosphorus content in calcium hydrogen phosphate tablets by 31P-qNMR
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摘要:
目的 建立一种高精密度和高专属性的核磁共振磷谱定量方法（31P-qNMR），用于检测磷酸氢钙咀嚼片中含磷药物的含量。 方法 使用六甲基磷酸酰胺作为内标，采集磷酸氢钙咀嚼片剂溶液的磷谱数据。研究磷酸氢钙在浓度范围1.0～9.0 mg/ml内的线性关系，并进行加样回收率和重复性实验。 结果 磷酸氢钙与内标的峰面积比在1.0 ～9.0 mg/ml范围内显示出良好的线性关系，回归方程为A = 0.0043 +0.1836 C。低、中、高3种浓度的加样回收率分别为98.0 %、98.1 %、98.4 %，相对标准偏差（RSD）分别为0.31 %、0.68 %、0.62 %（n = 9）。测定得到的磷酸氢钙咀嚼片中磷酸氢钙的平均含量为98.1 %。结论 成功建立了一种精密度高且专属性强的磷酸氢钙咀嚼片含量检测方法。该方法无需自身对照物，前处理过程简便，检测速度快，为含磷药品质量控制提供了新的技术支撑。 Abstract:Objective To establish a high-precision and high-specificity quantitative nuclear magnetic resonance phosphorus spectrometry method（31P-qNMR）for detecting the phosphorus content in calcium hydrogen phosphate chewable tablets. Methods Hexamethyl phosphoramide was used as an internal standard, phosphorus spectrum data of calcium hydrogen phosphate chewable tablets solution was collected. The linear relationship of calcium hydrogen phosphate within the concentration range of 1.0 to 9.0 mg/ml was studied, and sample recovery rate and repeatability experiments were conducted. Results Calcium hydrogen phosphate and the internal standard demonstrated a good linear relationship within the concentration range of 1.0 to 9.0 mg/ml, with a regression equation A = 0.0043 +0.1836 C. The recovery rates for low, medium, and high concentrations were 98.0%, 98.1%, and 98.4%, respectively, with relative standard deviations（RSD）of 0.31%, 0.68%, and 0.62%, respectively（n= 9）. The average content of calcium hydrogen phosphate in the chewable tablets was determined to be 98.1%.Conclusion This study successfully established a high-precision and highly specific method for quantifying the content of calcium hydrogen phosphate in chewable tablets, which did not require a self-reference substance, was simple in sample preparation, and had a fast detection speed. The method could provide a new technical support for the quality control of phosphorus-containing drugs. -
Key words:
- 31P-NMR /
- q-NMR /
- content determination /
- calcium hydrogen phosphate
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奥卡西平(oxcarbazepine, OXC)是第二代抗癫痫药物，可用于儿童全面强直-阵挛发作，部分伴或不伴继发性全面发作的一线治疗[1]，其具有与传统的抗癫痫药物（AEDs）如苯妥英钠、卡马西平和丙戊酸钠相同的疗效，但其对肝药酶和自身的诱导作用小，药物间相互作用较少，临床上可用于替代传统的AEDs。OXC是卡马西平（carbamazepine, CBZ）的一种10-酮类衍生物，但两者之间的药动学存在差异，OXC的耐受性好且不良反应少[2]。OXC是无活性的前体药物，在体内经过肝脏内细胞溶质芳基酮还原酶的作用转化为具有药理活性的中间代谢产物单羟基卡马西平（monohydroxy carbamazepine, MHD）[3-4]。国际抗癫痫联盟推荐MHD血清浓度的参考范围为3～35 μg/ml[5]，有研究表明，当血药浓度高于30 μg/ml时，容易发生药物不良反应，且在许多患者中，不良反应间歇性的发生与MHD浓度的波动有关[6]。在临床用药中也发现OXC服药后的药物浓度个体化差异大，年龄、性别、体重、肝肾功能等均会影响MHD的药动学参数[7]，故需要对其血药浓度进行监测。本研究在参考既往研究的基础上[8-12]，对色谱条件进行了优化，并简化了血样处理的过程，建立了HPLC法测定OXC活性代谢产物MHD血药浓度的方法，该方法快速、简单、准确、选择性好、灵敏度高，为临床监测血药浓度、调整给药剂量提供了手段。
1. 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；H1850R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科仪器有限公司）；SHB-B95A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Discovery DV215CD型分析天平（美国OHAUS公司）；Vortex-5型涡旋混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2 材料
MHD对照品（美国CATO公司）；内标：奥硝唑（中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海科丰化学试剂有限公司）；空白血浆（医院血库提供）；超纯水（实验室自制）。
2. 实验方法
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），预柱为Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈（80:20，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μl；双波长检测：在192 nm处检测MHD，318 nm处检测奥硝唑。
2.2 溶液及血浆样品的配制
2.2.1 储备液的配制
精密称取MHD对照品10 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为1 mg/ml的储备液，置于−20 ℃下保存。
2.2.2 内标工作液的配制
精密称取奥硝唑1.4 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为140 μg/ml的内标工作液，置于−20 ℃下保存。
2.2.3 血浆标准曲线和质控样品的配制
分别精密量取适量储备液，用甲醇稀释成20、50、100、200、300、400、500 μg/ml浓度梯度的标准对照溶液。取以上6个标准对照溶液，加入适量空白血浆，得2、5、10、20、30、40、50 μg/ml系列浓度的血浆标准曲线样品。同法配制相应的低、中、高浓度的血浆质控样品（QC），使得MHD对应的浓度分别为5、15、40 μg/ml。
2.3 血浆样品的预处理
取200 μl血浆样品，加入200 μl内标工作液、400 μl甲醇，涡旋混合30 s，10 ℃条件下13 000 r/min离心10 min，取上清液直接进样。
3. 结果
3.1 专属性试验
通过考察6份不同生物来源的空白血浆样品色谱图、空白血浆样品加入MHD对照品和内标的色谱图，以及临床实际用药后的患者血浆样品色谱图，以此反映方法的专属性。由图1可见，在本实验条件下，被测物MHD与内标的色谱峰分离良好，且血浆中的内源性物质不干扰测定。MHD和内标的保留时间分别为9.5 min和6.1 min。
3.2 标准曲线与线性范围
取上述浓度为2、5、10、20、30、40、50 μg/ml的血浆标准曲线样品按“2.3”项下方法处理。经HPLC法分析，以测得OXC的峰面积与内标峰面积之比（Y）作为纵坐标，以血浆MHD浓度（X）为横坐标，得到回归方程为：Y=0.047 1X+0.022 2（r=0.998 6）。线性范围：根据标准曲线，MHD血药浓度在2～50 μg/ml范围内线性关系良好，其定量下限浓度为2 μg/ml。
3.3 日内、日间精密度和准确度
配制定量下限、低、中、高（2、5、15、40 μg/ml）4种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理后测定，连续测定3 d，以当天的标准曲线计算QC样品的测定浓度，计算日内、日间精密度以及准确度。经测定，MHD的日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，均符合生物样品的测定要求，结果见表1。
表 1 单羟基卡马西平日内、日间精密度和准确度（n=6）理论浓度
（μg/ml）实测浓度
（μg/ml）RSD（%） RE（%） 日内精密度 日间精密度 2 1.85±0.16 8.64 12.21 −3.63 5 4.93±0.24 4.86 7.68 −4.43 15 14.32±0.37 6.86 6.16 −3.11 40 41.80±1.26 3.03 5.33 0.59 3.4 提取回收率
配制低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理。同时另取18份空白血浆，除了不加系列对照品溶液和内标外，按“2.3”项下方法处理，在获得的上清液中加入MHD和内标溶液至相应浓度。进样分析，以每一浓度中2种不同处理方法的峰面积比值计算提取回收率。经测定，本法中MHD的平均提取回收率在89.62%～95.32%之间；内标的平均提取回收率为98.76%，符合生物学样品的分析要求，结果见表2。
表 2 单羟基卡马西平、MHD和内标提取回收率试验结果（n=6）化合物 浓度（μg/ml） 提取回收率（%） MHD 5 89.62±4.82 15 94.67±6.76 40 95.32±4.90 内标 140 98.76±5.92 3.5 稳定性试验
3.5.1 室温稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并在室温条件下放置4 h和10 h后测定样品血药浓度，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在室温下放置10 h后仍稳定，RSD均小于4.47%，RE值在1.50%～2.98%之间，结果见表3。
表 3 奥卡西平代谢产物单羟基卡马西平稳定性试验结果 (n=5)储存条件 理论浓度（μg/ml） 实测浓度（μg/ml） RSD（%） RE（%） 室温10 h 5 5.15±0.19 3.60 2.98 15 15.39±0.69 4.47 2.62 40 40.60±0.40 0.98 1.50 冻融3次 5 5.47±0.15 2.83 9.41 15 15.79±0.32 2.06 5.24 40 40.75±1.10 2.71 1.86 处理后36 h 5 5.39±0.27 5.09 7.74 15 15.66±0.58 3.70 4.39 40 39.46±1.80 4.57 −1.34 −20 ℃，30 d 5 5.16±0.23 4.39 3.19 15 14.62±0.39 2.64 −2.53 40 40.37±0.58 1.44 0.93 3.5.2 冻融稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并于−20 ℃冰箱中冷冻保存24 h后室温下解冻1 h后测定，反复冻融3次，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品反复冻融3次后仍能保持稳定，RSD均小于2.83%，RE值在1.86%～9.41%之间，结果见表3。
3.5.3 处理后的血浆样品在自动进样器中储存的稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆QC样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，然后放置在自动进样器内12 h、36 h后再次测定，求得RSD和RE值。经测定处理后的MHD血浆样品在进样器内放置36 h仍能保持稳定，RSD均小于5.09%，RE值在−1.34%～7.74%之间，结果见表3。
3.5.4 长期稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆质控样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，并置于−20 ℃冰箱中冻存30 d后取出解冻后测定，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在−20 ℃冰箱中冻存30 d后仍能保持稳定，RSD均小于4.39%，RE值在−2.53%～3.19%之间，结果见表3。
4. 讨论
目前，有关MHD的检测方法的文献很多，其中,高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法都有报道，后者虽有灵敏度高、专属性强的特点，但其仪器昂贵，且需专业人员进行操作，很难在大部分的医疗机构普及[13-15]。另外，国内外文献报道中多使用固液萃取法或液液萃取法进行血样的前处理，但这种处理过程相对复杂、耗时，且经济成本较高[11, 16]。本方法采用甲醇沉淀蛋白进行血样的前处理，建立了HPLC法测定人血浆中MHD血药浓度的方法，整个过程操作简单、快速，样品分析时间较短，适用于临床大量样品的连续检测。
文献报道的流动相有乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钾溶液（33∶67，V/V）[12]、水-乙腈（65∶35，V/V）[17]、水-甲醇-乙腈（64∶30∶6，V/V/V）[18]等。本方法采用了水-乙腈，按不同的配比进行试验，发现当水-乙腈的比例为80∶20时，色谱峰的峰形、出峰时间及分离度最佳。文献采用卡马西平[17]、苯巴比妥[19]和奥硝唑[20]等作为内标，本研究通过筛选发现奥硝唑的保留时间为6.1 min，不仅与MHD的保留时间相近，又能与其有很好的分离，且其性质稳定，满足内标的要求。
本实验建立的测定人血浆中OXC活性代谢产物MHD的HPLC法，MHD线性回归方程中的r=0.998 6，说明血药浓度在2～50 μg/ml范围内具有良好的线性关系，日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，MHD及内标的平均提取回收率在89.62%～98.76%之间。血浆样品的稳定性试验证明，在室温放置10 h、反复冻融、处理后放置进样器36 h以及低温保存30 d的情况下，样品未见明显降解，仍能保持稳定。本研究建立的HPLC法操作快速简单，精密度、回收率高，稳定性好，专属性强，不受血浆中内源性物质的干扰，结果准确可靠，且灵敏度高，适用于奥卡西平临床血药浓度的监测。
目前癫痫治疗主要以药物治疗为主，奥卡西平是第二代抗癫痫药物，我国诸多癫痫病专家也建议将其作为癫痫部分性发作和全面强直阵挛发作的首选药物[21]。但奥卡西平使用过程中可能出现瘙痒、荨麻疹、血管性水肿等超敏反应，包括Stevens Johnson综合征中毒性表皮坏死松解症[22]等，还可引起低钠血症、头晕、胃肠道不适等不良反应，有文献报道，其疗效及不良反应可能与血药浓度密切相关[23]，因此开展奥卡西平血药浓度的测定，能提高药物治疗的疗效，同时可以有效避免或减少可能产生的药物不良反应，提高癫痫患者服药的依从性。本研究建立了测定人血浆中MHD血药浓度的方法，应用于临床，为临床个体化给药提供依据，值得临床推广使用。
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