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冻伤是由寒冷、潮湿或大风引起的，会导致周围组织的损伤、丧失和残疾，尤其是手、脚、鼻子、脸颊和耳朵[1]。冻伤可引起微血管收缩，红细胞聚集，小动脉口径减小，硬度增大，毛细血管通透性升高，从而增加血液黏度，增大血流阻力，引起局部组织血流量减少，最终导致微循环障碍，使组织细胞由于缺血缺氧而坏死[2-3]，临床早期主要通过血管阻塞症状和软组织缺血边界来判断冻伤程度[4-5]。因此，课题组着手研发一种由肌醇烟酸酯（IN）和肝素钠组成的冻伤膏，直接涂在易冻伤的四肢上，用于预防和治疗冻伤，降低冻伤程度。该冻疮膏对早期冻伤、皲裂、湿疹及软组织损伤均有很好的治疗效果[6]。其中，IN是一种外周血管扩张剂，温和持久，能选择性扩张病变部位及冷刺激敏感部位的血管，具有溶栓抗凝、缓解血管痉挛、改善小血管循环、降低毛细血管脆性的作用[7]。此外，它还具有止痒、止痛、消肿的作用。在此处方中，肌醇烟酸酯还可缓解长期使用肝素钠引起的局部血肿血栓和皮肤过敏，有效减少全身凝血功能障碍的副作用。
分析药物在体内血药浓度随时间变化的动态过程，是传统药动学的研究方法。然而，对于经皮给药，药物入血浓度往往很低，难以定量。故本研究采用活体分时采样法，直接在大鼠皮肤上涂药，在不同时间点测定皮肤组织匀浆中的药物浓度。目前，已有研究对人或大鼠血浆中肌醇烟酸酯进行药代动力学研究[8-9]，但是，没有可用于定量分析大鼠皮肤组织匀浆样品中肌醇烟酸酯的含量。因此，本研究旨在建立一种快速、灵敏、重现性好、经济简便的HPLC法，定量分析大鼠皮肤中肌醇烟酸酯，用于大鼠经皮给药肝素钠肌醇烟酸酯乳膏后肌醇烟酸酯的药动学研究。
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W501型高效液相色谱仪（Waters）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率150 W，频率40 kHz）；FLUKO MODE组织匀浆器（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；XW-80A微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；离心机（ABBOTT LABORATORIES Germany）；剃须刀（上海飞科电器有限公司）；AUW120D型电子分析天平（SHIMADZU公司）。
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肌醇烟酸酯（天津中瑞药业有限公司，纯度：99.5%）；甲苯咪唑对照品（中国食品药品检定研究院；纯度：99.9%）；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏（北部战区总医院药剂科自制，批号：
20150108 ）；盐酸（分析纯，天津市凯信化学工业有限公司）；乙腈（色谱纯，Sigma公司）；甲醇（色谱纯，Sigma公司）；四氢呋喃（色谱纯，Sigma公司）；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。 -
SD清洁级雄性大鼠（体重230~250 g）：由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2010-0001。
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Kromasil ODS C18 色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水-四氢呋喃（35∶55∶10，V/V/V）；检测波长为262 nm；流速1.0 ml/min；柱温25 ℃；进样量20 μl。
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精密称取肌醇烟酸酯对照品12.5 mg（现用现配），置于10 ml量瓶中，加入适量0.5 mol/L盐酸水溶液，超声溶解，0.5 mol/L盐酸水稀释至刻度，即得浓度为1 250 μg/ml的对照品储备液。精密量取对照品储备液适量，置于10 ml量瓶中，分别用0.5 mol/L盐酸水稀释成系列溶液，即得到浓度为5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00和400.00 μg/ml的系列对照品溶液。同法配制浓度分别为10.00、50.00、300.00 μg/ml的低、中、高对照品溶液。
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精密吸取低、中、高对照品溶液各50 μl，分别加入到1 ml空白皮肤匀浆液中，分别得到浓度为0.50、2.50和15.00 μg/ml的质控样品（QC）。
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取甲苯咪唑对照品适量，精密称定，加2%盐酸甲醇溶液超声溶解并定量稀释制成浓度为12 μg/ml的内标溶液。
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根据非临床药动学研究技术指导原则及《中国药典》生物样品定量分析方法验证指导原则的有关要求[10-11]，对定量研究方法进行方法学验证。
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取72只健康SD大鼠，雄性，体重（230～250）g，于实验条件下饲养5 d（22±2） ℃，相对湿度（50±10）%。试验开始前1 d，用电动理发器对腹部皮肤进行脱毛（4 cm×4 cm，不要损伤皮肤），禁食不禁水。其中6只大鼠作为空白组，涂抹空白乳膏基质。其余大鼠将临床3倍用量的肝素钠肌醇烟酸酯乳膏均匀涂抹于腹部脱毛处皮肤，剂量为0.2 g/只，于给药后0.25、0.5、l、2、3、4、6、8、10、12、24 h各时间点分别取6只大鼠，给药皮肤表面用生理盐水反复擦拭，以棉签擦干，剥离剪取固定面积的皮肤，去除附着的肌肉，备用。皮肤样品的处理：精密称取皮肤样品0.07 g，加入1 ml 甲醇-0.5mol/L盐酸（50:50，V/V），组织匀浆机研磨后超声处理20 min，离心10 min（转速为10 000 r/min），取300 μl上清液，加入50 μl内标溶液，再加入1 ml乙腈，涡旋混匀1 min，离心10 min（转速为10 000 r/min），取上清液，空气流吹干，加200 μl流动相涡旋1 min复溶，离心5 min（转速为10 000 r/min），取上清液，20 μl进样。
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采用DAS 2.0药动学软件处理，以统计矩方法计算药动学参数。
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取涂抹空白乳膏基质的大鼠皮肤和给药后大鼠皮肤经处理后，分别进样20 μl，记录色谱图，考察是否有内源性物质干扰肌醇烟酸酯的测定。结果见图1。由实验结果可知，在此色谱条件下，皮肤中内源性物质和空白乳膏基质不干扰肌醇烟酸酯和内标的定量测定。
图 1 专属性HPLC图谱
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精密吸取系列对照品溶液各50 μl，分别加入到1 ml空白皮肤匀浆液中，分别得到待测物浓度为0.25、0.50、1.00，2.50，5.00，10.00和20.00 μg/ml的系列溶液，按“2.4”项下操作后进样分析，记录峰面积，以肌醇烟酸酯的浓度（X）为横坐标，以肌醇烟酸酯（A）与内标物（B）的峰面积比值（Y）为纵坐标，进行线性回归计算，得回归方程为Y=0.172X+0.002（r=0.999 9），线性范围0.25~20.00 μg/ml，定量下限为0.25 μg/ml（S/N≥10）。
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取低、中、高不同浓度的QC样品及定量下限，按“2.4”项下方法操作。每个浓度配制6份样品，配制3个分析批，连续测定3 d。计算定量下限和QC样品的日间和日内的准确度RE%和精密度RSD%，见表1，该方法的精密度和准确度均符合生物样品分析要求。
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度（n=6）
质量浓度
（ρB/μg·ml−1）日内精密度 日间精密度 实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 -
取低、中、高不同浓度的QC样品，按“2.4”项下方法操作，记录峰面积（A1）。另外，将1 ml空白皮肤匀浆液按“2.4”项下方法操作，提取后，加入3种不同浓度的QC样品各50 μl，空气流吹干，加200 μl流动相涡旋1 min复溶，离心（10 000 r/min，5 min），取上清液，20 μl进样，记录峰面积（A2）。将两者相比，即得QC样品的提取回收率。结果见表2。肌醇烟酸酯的平均提取回收率为96.18%，甲苯咪唑的平均提取回收率为90.65%，RSD均<15%，表明该提取方法具有较好的稳定性和重现性。
表 2 样品提取回收率考察结果（n=6）
成分 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）回收率（ % ） mean±SD RSD（ % ） 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35 -
取低、高不同浓度的QC样品，按照“2.4”项下皮肤样品的处理方法操作，分别考察低、高2个浓度的QC样品在室温下放置12 h、−4 ℃放置12 h、反复冻融3次（−20 ℃）和冷冻贮存2周（−80 ℃）的稳定性。数据结果见表3。结果表明，各生物样品在上述条件下稳定性均良好。
表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性（n=3）
稳定性条件 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）实测值
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69 -
采用DAS 2.0软件，以非房室模型分析待测物的药动学数据。皮肤中药物浓度数据以（mean±SD）表示，绘制了平均药物浓度时间曲线，各时间点含药浓度的计算分别伴随行标曲及QC。将给药后不同时间血药浓度和时间数据用DAS 2.0药动学软件处理，以统计矩方法计算药动学参数。详见图2和表4。
图 2 单次经皮给药后大鼠皮肤中肌醇烟酸酯药物浓度-时间曲线图（mean±SD, n=6）
表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数（mean±SD, n=6）
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT（0−t） h 9.044±0.618 MRT（0−∞） h 10.444±1.91 CLz/F L/（h·kg） 0.19±0.03 Vz/F L/（h·kg） 1.19±0.437 -
本实验采用在体给药分时取样法，在不同时间点取皮制备成匀浆测定皮肤中药物浓度。该方法线性关系良好、所测匀浆样品的精密度、准确度等方法学均符合生物样品定量分析要求，其专属性强、灵敏度高、简便、快速高效，可以用于大鼠皮肤中IN的含量测定，对IN在体皮肤浓度测定以及相关药理研究有一定的参考价值。由上述结果可知，IN能迅速渗透进入皮肤，并能长时间蓄积在皮肤局部，有利于IN在病变部位长时间发挥药效。HPLC分析方法快速、准确、回收率高、重现性好，可成功的用于测定GJR中IN在皮肤中的含量，表明在体给药分时取样法能较好地反映药物在大鼠体内的经皮代谢过程，适用于临床前外用药物的皮肤药动学筛选与评价，为临床用药方案的确定提供参考。
Skin pharmacokinetics of inositol nicotinate in heparin sodium inositol nicotinate cream
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摘要:
目的 建立HPLC法测定大鼠皮肤中肌醇烟酸酯（IN）的浓度，并研究肝素钠肌醇烟酸酯乳膏在大鼠经皮给药后IN的药动学特征。 方法 采用HPLC法建立简便快速的测定给药后不同时间点大鼠皮肤中IN浓度的分析方法，并用建立的方法开展肝素钠肌醇烟酸酯乳膏在大鼠经皮给药后IN的药动学研究，采用DAS软件拟合药物动力学参数。 结果 该分析方法在0.25 ~ 20 μg/ml浓度范围内线性良好，定量限为0.25 μg/ml，平均加样回收率为96.18%。肝素钠肌醇烟酸酯乳膏皮肤给药后IN的药动学参数t1/2 为（4.555±2.054） h、Tmax为（6±0） h、Cmax为（16.929±2.153） mg/L、AUC0−t为（150.665±16.568） mg·h /L、AUC0−∞为（161.074±23.917） mg·h /L、MRT（0−t）为（9.044±0.618） h、MRT（0−∞）为（10.444±1.91） h、CLz/F 为（0.19±0.03） L/（h·kg）、Vz/F 为（1.190±0.437） L/（h·kg）。 结论 IN能迅速渗透进入皮肤，并能够长时间蓄积在皮肤局部，有利于IN在病变部位长时间发挥药效。该方法简便、快速、专属性强、重复性好，可应用于大鼠腹部皮肤给药后IN的药动学研究。 -
关键词:
- 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏 /
- 皮肤药动学 /
- 肌醇烟酸酯
Abstract:Objective To establish an HPLC method to determine the concentration of inositol nicotinate（IN） in rat skin, and study the pharmacokinetic characteristics of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats. Methods HPLC method was used to establish a simple and rapid analytical method for the determination of IN concentration in the skin of rats at different time points after administration. The established method was used to study the pharmacokinetics of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats, and the pharmacokinetic parameters were fitted with DAS software. Results The linearity of the analytical method was good in the concentration range of 0.25-20 μg/ml, the quantitative limit was 0.25 μg/ml, and the average recovery rate was 96.18%. The pharmacokinetic parameters of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats were as follows: t1/2 was （4.555±2.054） h, Tmax was （6±0）h, Cmax was （16.929±2.153）mg/L, AUC0−t was （150.665±16.568） mg·h /L ,AUC0−∞ was （161.074±23.917） mg·h /L, MRT（0−t） was （9.044±0.618）h, MRT（0−∞） was （10.444±1.91） h, CLz/F was （0.19±0.03） L/（h·kg）, and Vz/F was （1.19±0.437） L/（h·kg）. Conclusion IN could quickly penetrate the skin and accumulate in the skin for a long time, which was beneficial to the pharmacological action of drugs on the lesion site for a long time. The method is simple, rapid, specific and reproducible, which could be successfully applied to the pharmacokinetic study of IN after transdermal administration in rats. -
流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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图 1 专属性HPLC图谱
A. 空白皮肤（涂抹空白基质乳膏）溶液；B. 空白皮肤溶液+肌醇烟酸酯+甲苯咪唑对照品溶液； C.含药皮肤样品溶液（涂抹6 h后）；1. 肌醇烟酸酯；2. 甲苯咪唑
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度（n=6）
质量浓度
（ρB/μg·ml−1）日内精密度 日间精密度 实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 
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表 2 样品提取回收率考察结果（n=6）
成分 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）回收率（ % ） mean±SD RSD（ % ） 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35
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表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性（n=3）
稳定性条件 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）实测值
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69
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表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数（mean±SD, n=6）
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT（0−t） h 9.044±0.618 MRT（0−∞） h 10.444±1.91 CLz/F L/（h·kg） 0.19±0.03 Vz/F L/（h·kg） 1.19±0.437
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