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METRNL（Meteorin-like）是一个新发现的分泌蛋白，为神经营养调节因子Meteorin的同源蛋白。2014年，本实验室首次报道METRNL是一个新的脂肪因子，由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富，故也称为Subfatin[1]。10年来，我们对METRNL的功能进行了多方面的探索，并不断扩展METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现，该蛋白参与调节机体多种病理生理过程，比如：脂肪细胞METRNL可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症，从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗[2]；肠上皮细胞METRNL参与调节肠道抗菌肽的平衡[3]，且肠道METRNL缺乏会加重溃疡性结肠炎[4]；此外，METRNL促进小鼠皮肤创伤愈合[5]，并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍[6]。最近，我们新报道了血液METRNL的主要分泌来源是血管内皮细胞，并发现内皮细胞METRNL对维持血管内皮正常功能和对抗动脉粥样硬化具有重要作用[7]。在这些研究中，我们构建METRNL基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠，以及多种双基因敲除小鼠，并在体外细胞实验中充分利用METRNL重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室，全球其他多个实验室也展开了对METRNL的功能探索，并发现METRNL在能量代谢[8-9]、炎症[10-11]、心脏疾病[12-13]等多种病理生理过程中发挥积极作用。
尽管目前有很多关于METRNL的研究结果提示，该蛋白具有非常好的临床治疗潜力，但有关整体METRNL治疗学探索不多，尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场METRNL重组蛋白价格昂贵，而且我们前期研究结果发现：对C57BL/6J 小鼠单次静脉注射1.75 µg METRNL重组蛋白后，血清METRNL在15 min后急剧升高（226 ng/ml），接着在4 h内迅速下降约90%。虽然在注射后24 h仍明显高于基础水平，但此时血中METRNL浓度已下降约97%[2]。因此，以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究METRNL的治疗学作用，尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面，对于一些已经体现METRNL治疗潜力的疾病（如动脉粥样硬化），疾病发展缓慢，短期给予METRNL重组蛋白很难起到治疗作用。
因此，本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL的小鼠作为METRNL的治疗学研究工具，并对该小鼠高表达METRNL的情况进行验证。
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鼠尾DNA提取试剂盒（CW2094S）购自北京康伟试剂生物科技有限公司；5 × PrimeScript RT Master Mix（Takara 公司）；小鼠Tubulin抗体（ AT819，碧云天公司）；通用型RNA提取试剂盒Ⅱ（AG21022，艾瑞克生物科技）；Human Meteorin-like/METRNL DuoSet ELISA试剂盒（DY7867-05，R&D system公司）；山羊抗兔 IgG（ab175471）、山羊抗小鼠 IgG（ab216772）、抗METRNL抗体（ab235775）购自Abcam公司。
LightCycler96实时荧光定量PCR仪（Roche公司）；TP600PCR仪（Takara公司）；5200S化学发光分析系统（Tanon公司）。
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人METRNL基因条件性过表达（R26-LSL-METRNL+/-）小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄 C57BL/6J 小鼠和Dppa-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。
所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒（IVC）系统中，温度（24±2）℃，相对湿度为40%~60%，饲养期间笼盒内保持清洁，小鼠在笼内自由活动、进食及饮水，动物房内照明系统为自动控制（12 h照明、12 h黑暗）。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》，并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准指导。
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将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm，剪碎，按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA之后，对目的基因进行PCR扩增，各引物序列见表1。
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5’→3’） 下游引物（5’→3’） R26-WT TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA R26-L-METRNL AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG GAGGCTCCATCCAGCAAGTT R26-Stop GGGCAACGTGCTGGTTATTG ACTTGCCCCTTGCTCCATAC 内参基因 TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC Dppa-Cre TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳，上样量为每孔6 μl，电泳条件为100 V，30 min，结束后进行拍照、分析。
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将小鼠称重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（100 mg/kg），待小鼠处于深度麻醉后，打开其胸腔，自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液，并转移至1.5 ml EP管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织，放入组织冻存管扔进液氮速冻，待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。血液于室温静置2 h后离心：4 ℃，3000×g，15 min，分离血清，储存至−80 ℃超低温冰箱。
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使用RNA提取试剂盒提取组织RNA，将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录，得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验，各引物序列见表2。
表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） 人 METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG 小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
取适量组织至2 ml高速离心管，加入蛋白裂解液后，使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管，离心：12000 × g，20 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中，进行蛋白浓度测定，剩余样品加入5 × 蛋白上样缓冲液，97 ℃变性10 min得到蛋白样品。
使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳条件为：150 V，60 min。使用PVDF膜进行转膜，转膜条件为100 V，60 min。
转膜结束后，使用快速封闭液封闭15 min，之后使用1×TBST缓冲液洗膜，5 min × 3次。加入一抗（1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液，使用1 × TBST缓冲液洗膜，5 min × 3次。加入二抗孵育液（1∶2 000稀释）常温孵育1 h，用1 × TBST缓冲液洗去二抗，5 min × 4次，结束后即可进行扫膜。
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使用酶联免疫吸附实验试剂盒（DY7867-05）测定小鼠血清中的METRNL水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。
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实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。两组间的比较使用双尾t检验，P<0.05视为差异有统计学意义。
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本研究基于前期构建好的人METRNL基因条件性过表达小鼠（简称为R26-LSL-METRNL+/-小鼠）和Cre-LoxP技术，最终获得全身过表达人METRNL基因小鼠（简称为R26-L-METRNL+/-小鼠），具体构建策略如图1所示。
图 1 全身过表达人METRNL基因小鼠的构建策略
R26-LSL-METRNL+/-小鼠是前期通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建而成，即在其中一个Rosa26基因位点定点插入了CAG-LoxP-Stop-LoxP-METRNL-3XFlag-Wpre-pA表达框，且该表达框的终止密码子Stop两侧插有同向LoxP位点，可基于Cre-loxP系统在Cre酶的作用下，将LoxP位点之间的序列切除，只留下一个LoxP位点，最终达到人METRNL基因过表达的目的。在该小鼠的名称“R26-LSL-METRNL+/-”中，“+”表示有外源基因表达框的插入，“-”表示无外源基因表达框插入。
Dppa3-Cre小鼠是由Dppa3基因启动子介导Cre重组酶在全身表达的工具鼠，将R26-LSL-METRNL+/-小鼠和Dppa3-Cre小鼠杂交，可获得R26-L-METRNL+/-小鼠，具体繁殖方法如图2所示。其中，野生对照小鼠简写为R26-WT，表示在Rosa26位点没有外源人METRNL基因表达框的插入。
图 2 全身过表达人METRNL基因小鼠的培育流程
在繁殖过程中进行基因型鉴定时，需确认外源人METRNL基因表达框、终止密码子Stop和Dppa-Cre基因的存在情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定，外源性表达框阳性条带为699 bp，对应野生型序列条带为996 bp，终止密码子Stop阳性条带为408 bp，Cre基因阳性条带为100 bp。如图3所示，泳道1为R26-LSL-METRNL+/-小鼠，泳道2为R26-L-METRNL+/-小鼠，泳道3为R26-WT小鼠，泳道4为R26-L-METRNL+/-Cre小鼠，泳道5为R26-WT;Cre小鼠。
图 3 DNA电泳条带图
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为验证R26-L-METRNL+/-小鼠是否存在人METRNL基因过表达，本研究首先利用实时荧光定量PCR技术检测了该小鼠各组织中人METRNL mRNA的表达情况。如图4所示，以 R26-WT 小鼠白色脂肪的人 METRNL mRNA表达量为1，肝、脾、肺、肾、白色脂肪和脑组织的相对表达量分别为94 008.6、618.1、88 537.3、68 897.9、32 386.3和24 816.5。该结果说明，R26-L-METRNL+/-小鼠在组织mRNA水平上实现了人METRNL基因过表达。
图 4 R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL mRNA相对表达量（n=5～6，
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接着，本研究提取各组织的蛋白，使用蛋白免疫印迹实验方法验证R26-L-METRNL+/-小鼠各组织中人METRNL蛋白表达情况。在该实验中，所用METRNL抗体可同时抗人和小鼠的METRNL蛋白。如图5所示，METRNL蛋白在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺和肌肉组织中的含量明显高于R26-WT小鼠，而在肾组织中METRNL抗体的结合效果不佳，且并未发现两组小鼠肾METRNL蛋白存在明显差异。该结果提示，R26-L-METRNL+/-小鼠在组织蛋白水平上实现了人METRNL基因过表达。
图 5 R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL 蛋白表达情况
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由于METRNL为分泌性蛋白，本研究最后使用ELISA方法测定R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠血清中人METRNL蛋白水平。如图6所示，可成功检测到R26-L-METRNL+/-小鼠血液中的人METRNL，浓度在1 100.3～1 579.3 pg/ml，而在R26-WT小鼠血液中检测不到人METRNL。该结果说明，R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白，提示R26-L-METRNL+/-小鼠实现了人METRNL基因过表达。
图 6 R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠的血清METRNL蛋白水平（n=5，
$ \bar x \pm s $ ） -
本研究利用Dppa-Cre小鼠和实验室前期构建的R26-LSL-METRNL+/-小鼠进行杂交繁殖，最终获得R26-L-METRNL+/-小鼠。该小鼠与R26-LSL-METRNL+/-小鼠都在Rosa26基因位点含有外源性基因表达框，不同的是在R26-L-METRNL+/-小鼠外源表达框中的终止密码子Stop被Cre酶成功切除，因此R26-L-METRNL+/-小鼠可实现全身细胞过表达人METRNL。
本研究从mRNA水平、组织蛋白水平和血清蛋白水平考察了R26-L-METRNL+/-小鼠过表达METRNL的情况。由于该小鼠插入的外源METRNL基因是人METRNL基因，因此在进行实时荧光定量PCR实验时，使用的是人METRNL引物和小鼠Gapdh引物。类似地，在ELISA实验中，使用的是检测人METRNL的试剂盒。由于没有特异性抗人的METRNL抗体，因此在蛋白免疫印迹实验中使用的是可同时抗人和小鼠的METRNL抗体，而内参使用的是抗鼠的Tubulin抗体。本研究结果显示，R26-L-METRNL+/-小鼠的各组织存在人METRNL mRNA高表达，虽然各组织的表达量有所波动，但都比R26-L-WT小鼠的表达量高几千倍甚至是数十万倍。蛋白免疫印迹实验结果显示，在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺、肌肉组织存在明显升高的METRNL蛋白水平，但该实验中检测的METRNL蛋白量升高倍数不多，可能与使用的METRNL抗体可以同时抗人和小鼠的METRNL有关。另外，我们也注意到两组小鼠肾组织的METRNL蛋白水平并没有明显差异，并且两组条带都非常微弱，为确证实验结果，我们进行了重复实验，得出相同结果。经过分析可能是因为该METRNL抗体对肾组织蛋白的亲和力不是很高，导致检测出的蛋白绝对量都太低而使两组之间很难出现差异。在血清水平，本研究结果提示R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白，而R26-L-WT小鼠血中检测不到该蛋白，说明R26-L-METRNL+/-小鼠成功过表达人METRNL，并可以成功分泌至血液中。同时，该实验提示，本研究所使用的人METRNL ELISA试剂盒特异性比较好，可以清晰区别人和鼠来源的METRNL蛋白。
在小鼠培育过程当中，尚未发现R26-L-METRNL+/-小鼠和同窝对照WT小鼠在体重、形态等方面有何差异。根据图2中R26-L-METRNL+/-小鼠的培育方式，采用R26-L-METRNL+/-小鼠与C57BL/6J 小鼠杂交进行扩大繁殖和保种，基于孟德尔遗传定律，后代鼠中R26-L-METRNL+/-小鼠理论得率为50%，但实际中，我们发现该小鼠的得率仅为15%左右，远低于理论值。这一现象非常有趣，因为此前本实验室构建过多种基因工程动物模型，均没有发现类似偏离孟德尔遗传定律的现象，而这一现象是否与METRNL蛋白的全身性过表达有关，值得我们进一步研究。
Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene
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摘要:
目的 构建全身过表达人METRNL基因的小鼠模型（R26-L-METRNL+/-小鼠）。 方法 基于Cre-loxP系统利用Dppa3-Cre小鼠和实验室前期构建的人METRNL基因条件性过表达（R26-LSL-METRNL+/-）小鼠进行交配繁殖，得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠。将该目标小鼠进行基因型鉴定，收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织，利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验，考察人METRNL基因在小鼠的表达情况。 结果 R26-L-METRNL+/- 小鼠的人METRNL在组织mRNA水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达，远高于野生对照组小鼠。 结论 R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功。 Abstract:Objective To generate mice with whole-body overexpression of human METRNL gene. Methods Based on Cre-loxP system, Dppa3-Cre mice were mated with Rosa26-LSL-METRNL knock-in mice（R26-LSL-METRNL+/-）to generate R26-L-METRNL+/- mice. The genotypes of the offsprings were identified, and tissues of the blood, heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, white adipose and muscle were collected. The expression of human METRNL gene in mice was investigated by quantitative real-time PCR, western blot and enzyme linked immunosorbent assay. Results Compared with wild type control mice, human METRNL in R26-L-METRNL+/- mice significantly expressed at both mRNA and protein levels in tissues, with abundant METRNL protein in blood. Conclusion The mouse model overexpressing human METRNL gene（R26-L-METRNL+/- mouse）was successfully constructed. -
Key words:
- METRNL /
- systemic overexpression /
- mouse
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新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是指2019年始发、由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn-drome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的肺炎。截至2020年4月5日，全球共确诊COVID-19患者1 093 349例，死亡58 620例[1]。目前尚无针对COVID-19的特异性治疗药物，一些化学药物包括氯喹/羟氯喹、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦等正在临床开展随机对照研究。临床实践表明，清肺排毒汤和连花清瘟胶囊等多种中药方剂和制剂对COVID-19有良好的治疗效果。据国家卫生健康委员会报道，在我国确诊的COVID-19病例中，有74 187人使用了中医药，占91.5%；中医药能够缓解症状，减少轻型、普通型疾病向重型发展，提高治愈率、降低病死率，总有效率达90%以上[2]。
柴胡达胸合剂，曾用名为“强力肺炎1号”，是国医大师梅国强教授为痰热壅肺证COVID-19患者制定的中药处方[3]。柴胡达胸合剂由小柴胡汤、小陷胸汤、达原饮、止嗽散共同组方，包含柴胡、黄芩、法半夏、全瓜蒌、黄连、枳实、甘草、浙贝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、槟榔、草果、藿香、佩兰、虎杖共十八味中药。由于临床使用疗效显著，2020年2月23日，湖北省药品监督管理局下发制剂备案批件，包括柴胡达胸合剂在内的2个由湖北省中医院研制的医院制剂获批用于防治COVID-19[4]。
网络药理学是基于系统生物学和多向药理学技术和方法，通过构建“药物-基因-疾病”网络，分析药物在网络中与特定节点相互作用的关系，从整体角度探索药物与机体相互作用的一门学科[5]。2007年，Hopkins首次在Nature Biotechnology杂志上发表述评，提出网络药理学这一概念，并认为其为发现新药的新范式[6]。中药通过多成分、多靶点、多通路对疾病产生治疗作用，利用网络药理学方法，可系统阐明中药治疗疾病的药理作用机制[7]。
因此，本研究运用网络药理学方法，筛选柴胡达胸合剂治疗COVID-19的活性成分和作用靶点，构建“药材-活性成分-靶点”网络图，然后对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interac-tion, PPI）、GO基因注释和KEGG信号通路分析，为进一步阐明柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 柴胡达胸合剂药材的性味归经、活性成分和靶点的筛选
通过《中华人民共和国药典》（2015年版）手工检索柴胡达胸合剂的十八味中药材的性味归经，利用Cytoscape 3.7.2软件制作“药材-性味归经”网络图。在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）以柴胡达胸合剂中的十八味中药材名为关键词检索得到所有中药的化学成分。生物利用度（oral bioavailability，OB）和半衰期（half life，HL）是影响药动学的重要参数，而类药性（drug-likeness，DL）可以反映化合物的理化性质与已上市的药物是否类似。根据TCMSP数据库推荐的筛选标准，本研究以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件，筛选得到每味中药材的活性成分。同时，通过 TCMSP 数据库查找各活性成分的作用靶点，归纳整理后利用Uniprot 数据库（
https://www.uniprot.org/ ）标准化靶点名称。1.2 “药材-活性成分-靶点”网络图的构建
以coronavirus为关键词，检索GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）和OMIM（https://omim.org/ ）数据库获得COVID-19潜在相关基因；利用Venn图在线绘制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/ ），将柴胡达胸合剂活性成分的作用靶点和COVID-19相关基因取交集，得到柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点；最后，将得到的药材-活性成分-靶点关联性文本导入Cytoscape 3.7.2软件，构建并分析“药材-活性成分-靶点”网络。1.3 PPI网络构建
将柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点导入STRING 蛋白相互作用数据库（
https://string-db.org/ ），物种选定为Homo sapiens，获得PPI信息并导入Cytoscape 3.7.2软件，利用NetworkAnalyzer功能，分析网络中每个靶点的度值（dgree value），使用R软件Graphics包，绘制条形图展示度值排名前20位的靶点。1.4 GO基因注释和KEGG通路分析
利用R软件的org.Hs.eg.db和clusterProfiler包，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点进行GO基因注释和KEGG通路分析，以P＜0.05进行筛选，得到柴胡达胸合剂对COVID-19发挥治疗作用参与的生物学过程和信号通路，并绘制气泡图展示结果。
2. 结果
2.1 柴胡达胸合剂的药材性味归经
柴胡达胸合剂“药材-性味归经”网络如图1所示，图中节点的大小代表该节点在网络中的度值。由图可知，度值最大的性味归经分别为寒（度值=8）、苦（度值=13）和肺经（度值=14）。
2.2 柴胡达胸合剂的活性成分及其作用靶点
通过TCMSP平台检索到柴胡达胸合剂中的十八味药材共包含1 977个化合物。以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件筛选并去重后，共得到221个活性成分。在TCMSP检索活性成分的作用靶点，并到Uniprot数据库中查找其标准名称，最后共得到259个作用靶点。柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息，结果见表1。
表 1 柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息表中药名称 化合物（个） 活性成分（个） 靶点（个） 柴胡 349 14 165 黄芩 143 32 95 法半夏 116 11 70 全瓜蒌 80 7 8 黄连 48 10 153 枳实 65 14 98 甘草 280 76 198 浙贝母 17 4 29 桔梗 102 7 63 百部 110 18 82 前胡 101 11 157 紫菀 91 13 175 款冬花 148 19 155 槟榔 52 3 10 草果 59 5 136 藿香 94 9 147 佩兰 60 6 73 虎杖 62 8 159 2.3 柴胡达胸合剂治疗 COVID-19的作用靶点
通过检索GeneCards和OMIM数据库，共收集得到COVID-19相关基因352个。将柴胡达胸合剂的作用靶点和COVID-19相关基因取交集制作Venn图，共得到51个交集基因，即柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点（图2）。
2.4 “药材-活性成分-靶点”网络
柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络共包含234个节点（药材节点18个，有效成分节点165个，靶点节点51个）。网络中棱形代表药材节点，倒三角代表有效成分节点，圆形代表靶点节点（图3）。节点的颜色越深或节点图形越大，表明该节点在网络中的度值越高。每一圈的最低点为该圈度值最大的节点，度值沿逆时针方向逐渐减小，且3个有效成分节点圈由外往里节点度值依次减小。网络中化合物节点中位数为4，高于2倍中位数的化合物节点共有12个（表2），这些化合物可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要活性成分。
表 2 高于2倍度值中位数的化合物信息表TCMSP数据库ID 化合物名称 对应药材 度值 MOL000098 槲皮素（quercetin） 草果、柴胡、甘草、虎杖、黄连、藿香、款冬花、前胡、紫菀 46 MOL000006 木犀草素（luteolin） 虎杖、桔梗、佩兰、枳实、紫菀 23 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 柴胡、甘草、款冬花、紫菀 16 MOL000358 β-谷甾醇（beta-sitosterol） 百部、半夏、浙贝母、虎杖、黄芩、款冬花、前胡、紫菀 15 MOL000173 汉黄芩素（wogonin） 黄芩 14 MOL004328 柚皮素（naringenin） 甘草、枳实 13 MOL002714 黄芩素（baicalein） 半夏、黄芩 10 MOL000497 甘草查尔酮A（licochalcone A） 甘草 10 MOL001689 刺槐素（acacetin） 黄芩、桔梗 10 MOL005828 川陈皮素（nobiletin） 枳实 10 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 柴胡、甘草、紫菀 9 MOL005916 葛花苷元（irisolidone） 藿香 9 2.5 PPI网络
在“药材-活性成分-靶点”网络中的靶点节点不包含PPI信息，因此，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19靶点进行PPI分析，结果如图4A所示。图中节点形状越大，表明其度值越高，越可能为柴胡达胸合剂治疗COVID-19的核心作用靶点。对网络中度值前30的节点作条形图，节点度值排名前10的蛋白为CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2 和CCL2（图4B）。
2.6 GO基因注释
GO基因注释将基因的功能分为3个部分：参与的生物学过程（biological process，BP），所处的细胞组分（cellular component，CC），执行的分子功能（molecular function，MF）。对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行GO基因注释，以P＜0.05为条件进行筛选，结果得到GO条目共1 722个，其中BP条目1 612个，CC条目30个，MF条目80个。选取每个部分的前5个条目作气泡图，富集最多基因且P值最小的BP、CC和MF条目分别为脂多糖反应、膜筏和细胞因子受体结合（图5）。
2.7 KEGG信号通路分析
对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行 KEGG 信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路156条，选取富集基因最多的10条通路作气泡图。排名前5的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎（图6）。
3. 讨论
COVID-19隶属于中医的“温疫”、“疫病”范畴，病因为感受“异气”、“疠气”，疠气夹湿，病位在肺、脾[3]。柴胡达胸合剂用于痰热壅肺证患者，其病因为痰热互结，壅闭于肺，致使肺失宣降而表现的肺经实热证候。本研究首先对柴胡达胸合剂的十八味中药材进行性味归经的网络分析，结果发现柴胡达胸合剂组方的性味以“苦寒”最多且主归肺经。“苦寒”药能清热泻火，消除热症，多用于具有实热特征病证[8]。因此，柴胡达胸合剂与COVID-19的病机、病位相符。
利用中药、疾病相关数据库，本研究筛选出柴胡达胸合剂治疗COVID-19的165个活性成分和51个作用靶点，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19具有多成分、多靶点的特点。通过构建和分析“药材-活性成分-靶点”网络图，发现网络中度值较高的12个活性成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺槐素、川陈皮素、异鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外，其余11个成分均属于黄酮类化合物。
黄酮类化合物广泛存在于自然界的多种植物中，具有包括抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理作用[9]。黄酮类化合物还有良好的抗病毒作用，对流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒等都有抑制作用[10]。体外实验研究表明，槲皮素和木犀草素均能够抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性，对SARS-CoV 产生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2与SARS-CoV基因序列有约80%同源性，两者3CL蛋白酶结构有相似性[14]。此外，分子对接结果发现山柰酚、槲皮素、 黄芩素、 木犀草素、 汉黄芩素、β-谷甾醇与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶均有较高的结合活性[15]。因此，通过直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制之一。
通过分析PPI网络发现，CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2、CCL2等在网络中有较高的度值。CASP3基因编码的caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，研究发现caspase-3蛋白在SARS-CoV病毒引起的组织细胞凋亡过程中发挥了重要作用[16]。MAPK基因编码的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物学过程。此外，炎症因子风暴被认为是重症COVID-19患者组织损伤的病理机制之一。SARS-CoV-2病毒在体内激活T细胞，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6等细胞因子，随后GM-CSF会进一步激活CD14+CD16+炎性单核细胞，进一步升高IL-6等炎性因子，形成炎症因子风暴，导致严重的肺部和其他器官免疫损伤[17]。细胞因子根据其在炎性反应中的作用不同可分为促炎性细胞因子（如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等）和抑炎性细胞因子（如 IL-4、IL-10 等）两类。SARS患者的肺部炎症和肺损伤与患者血浆中的IL-1B、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子水平升高引起炎症因子风暴有关[18]。同样地，COVID-19患者血浆IL-1B、IFN-γ、CXC趋化因子-10（CXCL-10）等促炎性细胞因子水平也升高[19]。本研究中，IL-6、IL-10和IL-1B均为核心作用靶点。因此，减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平可能也是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制。
对靶点进行GO基因注释的结果表明，柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要生物学过程为脂多糖反应、对源于细菌的分子的反应和氧化应激反应等。脂多糖是G-菌细胞壁的组成成分，可诱导细胞产生炎性反应，其中促炎性细胞因子发挥了重要介导作用。IL-6可促进B细胞分化，并活化MAPK，激活STAT转录因子，从而加重炎性反应[20]。KEGG分析富集到156条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19多通路的特点。
综上所述，本研究采用网络药理学方法，初步揭示了柴胡达胸合剂可能一方面通过多种黄酮类化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，另一方面通过多成分、多靶点、多通路减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平，从而对COVID-19产生治疗作用。
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图 5 R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL 蛋白表达情况
A.心脏组织；B.肝组织；C.脾组织；D.肺组织；E.肾组织；F.肌肉组织 （n=3，$ \bar x \pm s $）*P<0.05，**P<0.01，与 R26-WT组比较。
图 6 R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠的血清METRNL蛋白水平（n=5，
$ \bar x \pm s $ ）A.“METRNL浓度-吸光度”标准曲线（R2=0.992 9）；B.R26-L-METRNL +/-小鼠血清METRNL浓度 *** P <0.001，与 R26-WT 组比较。
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5’→3’） 下游引物（5’→3’） R26-WT TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA R26-L-METRNL AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG GAGGCTCCATCCAGCAAGTT R26-Stop GGGCAACGTGCTGGTTATTG ACTTGCCCCTTGCTCCATAC 内参基因 TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC Dppa-Cre TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 
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表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） 人 METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG 小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG
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